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Produto de E. coli indesejado em produto de plasmídeo

Produto de E. coli indesejado em produto de plasmídeo


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Usando um kit de clonagem TOPO XL, nosso laboratório pegou um pouco de DNA humano amplificado, inseriu-o no vetor e tentou cloná-lo em E. coli. No entanto, ao sequenciar o produto de plasmídeo purificado, a sequência que recebemos foi E. coli em vez do humano que havíamos amplificado. Os iniciadores sentaram-se no plasmídeo como pretendido, apenas a sequência entre os iniciadores parece ser de E. coli (como implícito em explodi-lo contra um humano, sem obter resultados e, em seguida, explodi-lo contra E. coli e obtendo um hit).


A causa raiz acabou sendo uma especificação mentirosa. Usando um diferente, foi revelado que quase não havia DNA modelo na amplificação inicial. Sem DNA, sem plasmídeos bons.


A evolução indesejada de sequências de DNA projetadas limita os esforços de engenharia metabólica e genômica. Funções projetadas que são onerosas para as células hospedeiras e retardam sua replicação são rapidamente inativadas por mutações, e mutações não planejadas com efeitos imprevisíveis frequentemente se acumulam ao lado de mudanças planejadas em projetos de edição de genoma em grande escala. Desenvolvemos uma estratégia de evolução direcionada, eleição de resolução periódica para variantes volucionariamente confiáveis ​​(PResERV), para descobrir mutações que prolongam a função de uma sequência de DNA pesada em um organismo modificado. Aqui, usamos PResERV para isolar Escherichia coli células que replicam plasmídeos do tipo ColE1 com maior fidelidade. Encontramos mutações na DNA polimerase I e na RNase E que reduzem as taxas de mutação do plasmídeo em 6 a 30 vezes. O método PResERV seleciona implicitamente para manter a taxa de crescimento das células hospedeiras, e altos números de cópias de plasmídeo e níveis de expressão gênica são mantidos em alguns dos E. coli cepas, indicando que é possível melhorar a estabilidade genética do chassi celular sem encontrar trade-offs em outras características de desempenho desejáveis. Utilizando este novo antimutador E. coli e a aplicação do PResERV a outros organismos no futuro promete prevenir falhas evolutivas e imprevisibilidade para fornecer uma base genética mais estável para a biologia sintética.

Populações de células projetadas para funcionar como fábricas ou biossensores experimentam um modo de falha peculiar aos sistemas vivos: elas evoluem. A evolução indesejada é um problema fundamental para a bioengenharia que limita a eficiência e a previsibilidade dos esforços de engenharia metabólica e genômica (1 & # x020135). Freqüentemente, uma função projetada desvia recursos críticos da replicação celular ou de outra forma interfere no crescimento ou na homeostase (6,7). Nesses casos, as células & # x02018 quebradas & # x02019 com mutações que inativam a função de engenharia podem superar rapidamente o design original (8 & # x0201310). A taxa na qual uma função de engenharia decai dentro de uma população de células desta maneira pode ser resumida como uma vida evolutiva ou meia-vida (8) ou definida em termos de uma paisagem evolutiva pelas taxas nas quais vários modos de falha mutacional ocorrem e seus respectivos benefícios de fitness (9,10).

Às vezes, é possível editar um genoma para eliminar ou reduzir a taxa na qual certos tipos de mutações ocorrem (11 & # x0201316) ou conceber uma maneira de reduzir a carga de uma função de engenharia (2,17). No entanto, dada a complexidade dos processos de replicação e reparo do DNA e as várias maneiras pelas quais uma função projetada pode sobrecarregar uma célula hospedeira, geralmente é alcançado um ponto em que é difícil melhorar ainda mais a confiabilidade de uma célula. A evolução direcionada é uma estratégia eficaz para otimizar o desempenho de sistemas complexos com muitos componentes interagindo, mesmo quando incluem fatores desconhecidos. Por exemplo, tem sido usado para criar novas enzimas que superam suas contrapartes naturais (18) e para ajustar circuitos de genes artificiais para executar operações lógicas de forma eficaz (19).

Dadas as restrições similarmente complexas subjacentes à mutagênese celular e às cargas de aptidão de diversas funções projetadas, raciocinamos que um procedimento de evolução direcionada, eleição de Res P eriódica para Variantes E volucionariamente R eliáveis ​​(PResERV) (Figura & # x200B (Figura 1), 1) , poderia ser uma estratégia eficaz para melhorar a confiabilidade evolutiva de uma célula projetada. No PResERV, alguém seleciona artificialmente células mutantes que exibem manutenção aprimorada de uma função de engenharia pesada ao longo de dezenas a centenas de divisões celulares. Esperávamos que o PResERV pudesse isolar células com mutações que reduzissem a taxa em que as mutações de falha ocorreram ou a carga de aptidão da função de engenharia, ou ambos, possivelmente de maneiras que generalizariam para estabilizar outras funções de engenharia nas células evoluídas. Aqui, nós descrevemos Escherichia coli cepas evoluídas por PResERV que exibem taxas de mutação inferiores às naturais para genes codificados em plasmídeos de alta cópia, estabilizando-os assim contra a evolução indesejada.

Resseleção Periódica para Variantes Evolucionariamente Confiáveis ​​(PResERV) & # x000a0método. O PResERV começa com uma população de células que expressam GFP em um nível tão alto que impõe uma carga de aptidão significativa. Após a mutagênese, a população é cultivada por meio de duplicações celulares suficientes para que os mutantes com expressão de GFP reduzida surjam e superem outras células. & # X000a0Periodicamente, a população é classificada para reter apenas as células que permanecem tão fluorescentes quanto a cepa original, enriquecendo as células hospedeiras mutantes com taxas de mutação reduzidas ou um menor custo de adequação para a expressão de GFP. Uma vez que a estabilidade evolutiva da expressão de GFP aumenta, as células fluorescentes são isoladas e seus genomas são sequenciados para identificar e caracterizar as mudanças genéticas que contribuem para esse melhoramento. O novo crescimento das células durante o PResERV seleciona implicitamente apenas aqueles mutantes que alcançam estabilidade genética melhorada, sem introduzir qualquer troca que reduza significativamente as taxas de crescimento celular.


Fundo

Em 2009, quase um terço (45 de 151) das proteínas recombinantes biofarmacêuticas comerciais licenciadas pela FDA e EMEA foram produzidas pelo cultivo de Escherichia coli[1]. Isso significa que quase 30% das proteínas recombinantes de alto valor foram produzidas por meio de um sistema de expressão baseado em plasmídeo. Várias outras proteínas recombinantes comerciais (por exemplo, enzimas) ou produtos não proteicos (por exemplo, aminoácidos) também foram obtidas com cepas de E. coli abrigando plasmídeos. Pesquisando o banco de dados do Science Citation Index por “coli proteína recombinante ”levaria a mais de 26.000 resultados. Esses fatos mostram a grande importância de E. coli como um sistema de expressão para uso comercial e científico.

Sistemas de expressão baseados em E. coli dependem em quase todos os casos da presença de pelo menos um plasmídeo, que deve ser segregado em células em divisão durante o crescimento. A estabilidade insuficiente do plasmídeo segregacional tornaria os sistemas de expressão baseados em plasmídeo inúteis. Portanto, uma variedade de métodos foram desenvolvidos a fim de alcançar a estabilidade do plasmídeo [2]. O método comumente usado consiste em adicionar antibióticos ao meio de cultivo e colocar genes para resistência a antibióticos no plasmídeo que carrega o gene alvo. Esta estratégia é amplamente utilizada em pesquisa, uma vez que na maioria das vezes apenas volumes de trabalho baixos têm de ser aplicados. Na biotecnologia industrial, a adição de antibióticos pode ser geralmente excluída - não apenas por razões econômicas. A eliminação de antibióticos da mídia e dos fluxos de resíduos pode ser necessária durante o processamento posterior. Portanto, outros métodos para estabilização de plasmídeo estão em alta demanda.

Uma estratégia simples na tentativa de manter uma alta estabilidade de plasmídeo segregacional sem adicionar antibióticos consiste em usar plasmídeos de alto número de cópias e esperar que a distribuição estatística de plasmídeos durante a divisão celular possa sempre produzir células com pelo menos alguns plasmídeos. Isso funciona bem, desde que o número médio de cópias do plasmídeo seja homogêneo [3]. Assim que as células com números de cópias de plasmídeo muito baixos aparecem preferencialmente durante altas taxas de crescimento, as células podem não ter tempo suficiente para sintetizar plasmídeos em números de cópias elevados. Causados ​​pela carga metabólica adicional, os plasmídeos podem ser perdidos completamente, uma vez que as células livres de plasmídeo ganhariam uma vantagem de crescimento em comparação com as células contendo plasmídeo. Isso teria uma influência drástica, especialmente nos processos de cultivo contínuo e descontínuo.

A alta carga metabólica, os níveis de transcrição basal e os possíveis efeitos tóxicos das proteínas recombinantes exigem outros métodos para estabilizar os plasmídeos. Em alguns casos, mudanças nas estratégias de cultivo, principalmente pela diminuição da taxa de crescimento específica, podem levar a estabilidade suficiente do plasmídeo. Isso pode ser conseguido reduzindo a temperatura de cultivo ou alterando a fonte de carbono do meio. No entanto, a maioria dos métodos é baseada na adição de alguns elementos estabilizadores por engenharia genética.

Algumas lições podem ser aprendidas com as estratégias da natureza para garantir a segregação do plasmídeo. Assim, plasmídeos de cópia única muitas vezes mostram mecanismos de estabilização sofisticados, como aquele baseado no par-sistema que leva a uma distribuição controlada de plasmídeos, semelhante à distribuição cromossômica altamente organizada e controlada em organismos superiores. o par-sistema consiste em pelo menos dois genes codificadores de proteínas e um sítio especial no plasmídeo para distribuição controlada na célula em divisão [4].

Outros sistemas levam à morte pós-segregacional de células livres de plasmídeo e precisam da informação genética de uma toxina e seu antídoto correspondente, com o antídoto no plasmídeo alvo [5]. Tal combinação foi recentemente aplicada para o desenvolvimento de um Streptomyces sistema de expressão de proteína baseado [6].

Em todos esses casos, os plasmídeos podem se tornar muito grandes, levando a uma carga metabólica maior. Um tamanho maior também pode levar a outro problema - a estabilidade estrutural do plasmídeo diminuída devido a mutações estocásticas, o que também levaria a uma redução na produtividade. A este respeito, o ccdB/ccdA sistema de antídoto de veneno, modificado como um sistema de estabilização de componente separado fornece uma alternativa usando construções genéticas muito pequenas para fornecer manutenção eficiente livre de antibióticos de plasmídeo em E. coli[7].

Muitos estudos sobre a produção de vacinas de DNA têm se mostrado particularmente interessados ​​em mecanismos alternativos de seleção de plasmídeos, devido à necessidade de evitar todos os tipos de genes ou proteínas de resistência no DNA terapêutico de acordo com padrões de segurança. Um método baseado em RNA, usando a expressão constitutiva de sacB como um marcador contra-selecionável durante o crescimento em sacarose foi relatado ser capaz de trazer seleção livre de antibióticos e fermentação altamente produtiva, embora não seja restrito a vetores ColE1 [8].

Outra forma talvez mais elegante de estabilizar a propagação de plasmídeos é destruir a função de um gene essencial no cromossomo e colocar esse gene no plasmídeo que carrega os genes-alvo. Esta abordagem requer uma estratégia para gerar células competentes da cepa agora auxotrófica. Um dos primeiros métodos para uso comercial foi o valS-sistema [9]. O gene de tipo selvagem para a valil-tRNA sintetase (valS) do hospedeiro carrega uma mutação sensível à temperatura, enquanto o gene sem mutação é colocado em um plasmídeo. Para a transformação, o hospedeiro é cultivado a 30 ° C. Durante os cultivos a 37 ° C, a sintetase mutada no cromossomo perde sua função e apenas as células que carregam o valS- o plasmídeo portador pode sobreviver e crescer. No entanto, o valS gene ainda está por aí no cromossomo e a pressão de seleção favorece uma recombinação do mutante valS no cromossomo e no tipo selvagem valS no plasmídeo. Tal recombinação produz revertentes sem pressão de seleção por valS e leva à instabilidade do plasmídeo. Uma forma de reduzir a probabilidade de recombinação é o nocaute completo do gene cromossômico. No caso de valS isso não permitiria obter células viáveis ​​para transformação e, portanto, não seria praticável.

A estratégia Operator-Repressor-Titration (ORT) é baseada na regulação negativa de um gene cromossômico essencial por uma sequência operadora que permite a ligação de uma proteína repressora expressa constitutivamente. A fim de permitir a expressão do gene essencial e sobreviver, a célula tem que titular as moléculas repressoras contra uma sequência de operador semelhante que pode estar presente em múltiplas cópias no plasmídeo alvo a ser mantido [10]. A estratégia de complementação de função essencial também pode ser eficaz no nível do RNA. Recentemente, uma mutação âmbar sem sentido introduzida no essencial thyA gene no cromossomo causando auxotrofia da timidina, foi superado por plasmídeos recombinantes carregando um tRNA supressor, que permitiu a seleção de plasmídeo livre de antibiótico e também a expressão do repórter de luciferase recombinante em tecidos eucarióticos e em células tumorais [11]. O sistema fabI-triclosan, que é uma combinação essencial de inibidor de produto de gene, era um conceito de seleção de plasmídeo alternativo completamente diferente. No entanto, os riscos associados ao biocida triclosan, a necessidade do agente de seleção devido a um efeito aditivo, a necessidade de induzir e superexpressar o marcador do gene essencial e a instabilidade do plasmídeo na ausência de seleção também foram observados [12]. Outro exemplo de seleção de plasmídeo livre de antibióticos é a estratégia envolvendo o infA codificação do gene para o fator de iniciação da tradução [13].

Se uma auxotrofia pode ser superada por suplementos no meio, células competentes podem ser preparadas e transformadas usando tal meio suplementado. Isto pode ser conseguido por eliminação de um gene essencial para, e. a síntese de um aminoácido como a glicina [14]. Neste caso, o glyA gene é nocauteado em E. coli M15 levando a uma cepa auxotrófica que pode ser cultivada em meio contendo glicina. o glyA gene é clonado em um vetor de expressão sob o controle de um promotor fraco constitutivo. Este sistema tem uma desvantagem em que meios contendo glicina podem levar a células livres de plasmídeo e muitos meios industriais complexos contêm glicina.

Uma solução para esse problema consistiria na construção de uma cepa knockout, cujo nocaute cromossômico ainda permitiria pelo menos algum crescimento em meios complexos. A taxa de crescimento específico para uma cepa abrigando o plasmídeo contendo o gene knockout poderia gerar uma vantagem de seleção alta o suficiente para manter o plasmídeo na população de células.

Durante a busca por um gene que seria apropriado para a aplicação da estratégia baseada em auxotrofia para estabilização de plasmídeo, nós nos concentramos em tpiA, o gene da triosefosfato isomerase, uma enzima central na via da glicólise. Uma das recentes grandes conquistas científicas em E. coli pesquisa foi o estabelecimento da chamada coleção Keio de cepas knockout [15]. Usando o Keio tpiA cepa de nocaute, apresentamos a construção de tpiA- plasmídeos vizinhos que levam a E. coli cepas contendo plasmídeos de alta estabilidade segregacional.


Vetores de plasmídeo de E. coli

A manipulação do DNA recombinante, que é realizada quase exclusivamente com o hospedeiro E. coli, constitui uma das metodologias fundamentais da biotecnologia molecular. Em E. coli Plasmid Vectors, pesquisadores de bancada experientes descrevem suas técnicas comprovadas para a manipulação de plasmídeos recombinantes utilizando este popular hospedeiro bacteriano. Os autores descrevem métodos prontamente reproduzíveis para clonagem de DNA em vetores de plasmídeo, transformação de plasmídeos em E. coli e análise de clones recombinantes. Eles também incluem protocolos para a construção e triagem de bibliotecas, bem como técnicas específicas para veículos de clonagem especializados, como cosmídeos, cromossomos artificiais bacterianos, vetores l e fagemídeos. Também são apresentados métodos para aplicações comuns a jusante, como mutagênese, expressão de proteínas recombinantes e transcritos de RNA e usos de genes repórter. Cada protocolo totalmente testado é descrito em detalhes passo a passo por um especialista estabelecido no campo e inclui uma introdução que descreve os princípios por trás da técnica, listas de equipamentos e reagentes necessários, dicas sobre como solucionar problemas e evitar armadilhas conhecidas e, quando necessário , uma discussão da interpretação e uso dos resultados.
Abrangente e altamente prático, os vetores de plasmídeo de E. coli oferecem aos novos no campo um guia básico para o uso de vetores de plasmídeo no hospedeiro de clonagem E. coli, e aos pesquisadores mais experientes uma ampla variedade de técnicas comprovadas de sucesso.

. uma revisão científica e um "livro de receitas" metodológico de alta qualidade. É realmente um manual altamente prático, útil para todos os cientistas que trabalham com clonagem e manipulação de genes. "- Folia Microbiologica

". uma adição muito útil para laboratórios que investigam plasmídeos per se, e para aqueles que empregam plasmídeos como vetores para clonagem de genes." - Microbiologia hoje


Transformação - Introdução do vetor modificado em um hospedeiro

A transformação é a terceira etapa da tecnologia de DNA recombinante e envolve a introdução do DNA recombinante (plasmídeo modificado) na célula hospedeira (por exemplo, bactéria). O objetivo principal desta etapa é recuperar grandes quantidades da molécula de DNA.

Um dos hospedeiros mais comumente usados ​​é a bactéria E. coli. Isso ocorre porque eles são baratos para usar e têm um crescimento muito rápido (tempo de duplicação de cerca de 20 minutos). Portanto, a fase estacionária pode ser alcançada em um período de tempo muito curto.

Embora células bacterianas como a E. coli sejam fáceis de usar, é importante notar que elas não aceitam facilmente material genético estranho. Por esse motivo, essas células precisam ser tratadas para que o novo DNA seja introduzido com sucesso.

Um dos métodos usados ​​para introduzir o plasmídeo modificado na célula envolvia resfriar as células e aquecê-las rapidamente. Isso criou pequenos poros na membrana celular através dos quais os plasmídeos podiam entrar na célula. Com o tempo, entretanto, esses buracos / poros começariam a se fechar. Hoje, uma série de novos métodos estão sendo usados ​​para introduzir vetores nas células.

· Microinjeção - Este método envolve o uso de uma agulha de vidro (pipeta microcapilar) para introduzir diretamente o novo material de DNA na célula. Aqui, um micromanipulador (para precisão) é usado para direcionar o movimento da agulha.

· Eletroporação - Neste método, um campo elétrico é aplicado a fim de aumentar a permeabilidade da membrana celular. Isso torna mais fácil para o plasmídeo modificado ser inserido na célula.

· Transferência de genes mediada por ultrassom

· Transferência de genes mediada por fibra de carboneto de silício

· Transferência mediada por cloreto de cálcio

* Embora os métodos de controle mencionados acima ajudem a minimizar as chances de auto-ligação dos vetores entre outros resultados indesejados, a inserção do DNA recombinante nas células hospedeiras mostrou resultar em resultados variáveis.

Embora algumas das células hospedeiras absorvam o plasmídeo recombinante (que contém o gene de interesse), algumas das outras células hospedeiras podem absorver células plasmídicas que sofreram auto-ligação, enquanto outras conterão plasmídeos com genes indesejados. Por esse motivo, é importante selecionar células hospedeiras transformadas.


Reparo de DNA em Escherichia coli: identificação do produto do gene uvrD

Um fragmento de DNA Pvu II de 2,9 quilobases (kb) que contém o gene uvrD de Escherichia coli K-12 foi clonado em veículos de plasmídeo de baixa cópia e de múltiplas cópias. O plasmídeo uvrD de baixa cópia (pVMK49) complementa uma variedade de mutações uvrD, uvrE e recL. Em contraste, as mesmas cepas carregando o fragmento de 2,9 kb em um plasmídeo de cópias múltiplas (pVMK45) permanecem sensíveis à luz ultravioleta (UV). Além disso, os transformantes de pVMK45 de E. coli de tipo selvagem são sensíveis a UV e metanossulfonato de metila e parecem ser deficientes em recombinação. O gene uvrD clonado não complementa o alelo uvrD3 dominante. O inserto Pvu II de 2,9 kb nesses plasmídeos codifica uma única proteína de 76.000 dalton, que, com base em experimentos de inativação de inserção com o transposon Tn1000, deve ser o produto do gene uvrD. Esses dados confirmam a análise genética anterior que sugeriu que recL, uvrE e uvrD eram todos alélicos. A direção da transcrição do gene uvrD também foi determinada.


4. Conclusão

Poderíamos demonstrar a aplicabilidade do romance E. coli Cepa X-press para produção extracelular de proteínas recombinantes. Exploramos o espaço de design, no qual a produção de proteína extracelular é favorecida sem sacrificar a viabilidade: Para a proteína modelo solúvel SpA, temperaturas de cultivo entre 30 e 35 ° C e qS, 0 de até 0,25 g g -1 h -1 aumentou a capacidade de vazamento e a produtividade, mantendo a lise celular ao mínimo. Os parâmetros do processo afetaram positivamente o título total do produto e a fluidez em ambos os hospedeiros de expressão investigados. Por repressão de crescimento induzível, o romance E. coli A cepa X-press mostrou menos suscetibilidade à carga metabólica da produção de proteína recombinante e, portanto, permite um controle mais rígido do processo devido à variabilidade reduzida em diferentes condições de processo, embora a dependência do crescimento com a temperatura ainda tenha sido observada. Finalmente, mostramos que a cepa X-press pode atingir altos títulos de diferentes classes de proteínas recombinantes e vazar até 90% de todo o produto solúvel. Portanto, esta cepa é um candidato promissor para a produção de proteína extracelular em aplicações de lote alimentado atuais ou fabricação contínua futura. No entanto, a triagem adicional do espaço de design para produtos diferentes pode ser necessária, especificamente para proteínas que são propensas à formação de IB. Pesquisas adicionais devem ser direcionadas para a relação entre diferentes sistemas de expressão, parâmetros de processo e suas implicações na liberação de proteínas periplasmáticas.


Esses autores contribuíram igualmente: Jie Qiao, Wenqiang Li, Siyu Lin.

Afiliações

Laboratório Estadual de Biocatálise e Engenharia Enzimática, Escola de Ciências da Vida, Universidade de Hubei, Wuhan, 430062, Hubei, China

Jie Qiao, Wenqiang Li, Siyu Lin, Lixin Ma e Yi Liu

Centro de inovação colaborativa de Hubei para a transformação verde de recursos biológicos, Wuhan, 430062, Hubei, China

Wenli Sun, Lixin Ma e Yi Liu

Hubei Key Laboratory of Industrial Biotechnology, School of Life Sciences, Wuhan, 430062, Hubei, China

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Contribuições

Y.L. e L.X.M. concebeu e projetou os experimentos W.L.S. e W.Q.L. construiu os plasmídeos de expressão e purificou Cas9 e Cas12a RNPs J.Q. e S.Y.L. realizaram os experimentos celulares Y.L. analisou os dados e escreveu o artigo.

Autores correspondentes


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