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9.9: Clivagem de Proteína - Biologia

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9.9: Clivagem de Proteína

PROTEIN | Interações e reações envolvidas no processamento de alimentos

Decomposição de Aminoácidos

Estudos de sistemas modelo revelaram que a clivagem de proteínas e a degradação de cadeias laterais, ao invés da formação de redes de proteínas, são as reações preferidas quando o conteúdo de água das misturas de proteína-lipídio diminui. Exemplos da extensão das perdas em aminoácidos em uma proteína na presença de um lipídeo oxidado são apresentados na Tabela 3. A forte dependência dessa perda da natureza da proteína e das condições de reação é óbvia. Os produtos de degradação obtidos em sistemas modelo de aminoácidos puros e lipídios oxidantes estão listados na Tabela 4.

Tabela 3 . Perdas de aminoácidos que ocorrem em proteínas expostas a lipídios peroxidados

Sistema de reação Condições de reaçãoAminoácidos perdidos uma (% perda)
ProteínaLipídioTempoTemperatura (° C)
CaseínaÉster etílico de ácido linoléico24 h55 bLys (10), Thr (10), Val (10), Ala (9), Tyr (8), Phe (8), Ser (8), Arg (8), Asp (8) CD
CaseínaÉster etílico de ácido linoléico4 dias60 eLys (50), Met (47), Ile (30), Phe (30), Arg (29), Asp (29), Gly (29), His (28), Thr (27), Ala (27), Tyr (27) CD
OvalbuminaÉster etílico de ácido linoléico24 h55 bMet (17), Ser (10), Lys (9), Ala (8), Leu (8) CD
OvalbuminaÉster etílico de ácido linoléico4 dias60 eLys (50), Met (42), Leu (22), His (21), Val (21) CD
RibonucleaseÁcido linoleico40 min37 bMet (99), Tyr (62), His (54), Lys (51), Cys (40) c
TripsinaÁcido linoleico40 min37 bMet (83), His (12) c
LisozimaÁcido linoleico8 dias37 bTrp (56), His (42), Lys (17), Met (14), Arg (9)

Dados de Gardner HW (1979) Reatividade do hidroperóxido de lipídio com proteínas e aminoácidos: uma revisão. Journal of Agricultural and Food Chemistry 27: 220–229 e referências nele.

a Apenas os aminoácidos mais lábeis são listados. b Sistema aquoso. c Trp não analisado. d Cys não analisado. e 80% de umidade relativa.

Tabela 4. Produtos formados a partir de aminoácidos expostos a lipídios peroxidantes

Sistema de reaçãoCompostos formados a partir de aminoácidos
AminoácidoLipídio
HistidinaLinoleato de MetilaÁcido 3- (imidazol-4-il) láctico, ácido 3- (imidazol-4-il) acético histamina, valina, ácido aspártico, etilamina
CisteínaEtil araquidonatoCistina, sulfeto de hidrogênio, alanina
Ácido linoleicoCistina, ácido cisteico, dissulfóxido de cistina
MetioninaLinoleato de metilaSulfóxido de metionina
LisinaLinoleato de MetilaDiaminopentano, ácido aspártico, glicina, alanina, ácido α-aminoadípico, ácido pipecolínico, 1,10-diamino-1,10-dicarboxidecano

Modificado de Gardner HW (1979) Reatividade do hidroperóxido de lipídio com proteínas e aminoácidos: uma revisão. Journal of Agricultural and Food Chemistry 27: 220–229.


RESULTADOS

OMA1 e YME1L modulam diferencialmente a atividade de fusão OPA1

Considerando que humano OPA1 tem oito variantes de splice de mRNA diferentes (Figura Suplementar S1A), tecidos de camundongo expressam apenas quatro - isoformas 1, 5, 7 e 8 (Akepati et al., 2008) (Figura 1A). Cada uma das isoformas 1 e 7 produz uma mistura de l-OPA1 e uma ou duas versões de s-OPA1, respectivamente. As isoformas curtas são produzidas por clivagem proteolítica da isoforma longa pelas proteases da membrana interna mitocondrial OMA1 (no local S1) e YME1L (no local S2). Em contraste, o processamento proteolítico das isoformas 5 e 8 vai para a conclusão e resulta em apenas isoformas curtas (Song et al., 2007).

FIGURA 1: OMA1 e YME1L regulam diferencialmente a atividade de fusão OPA1. (A) Esquema das isoformas da proteína OPA1 de camundongo, mostrando a origem das bandas de proteína umae. MEFs expressam as isoformas 1, 5, 7 e 8. As isoformas 1 e 7 produzem formas longas que constituem bandas uma e b e formas curtas que constituem bandas ce. As isoformas 5 e 8 produzem exclusivamente formas curtas que devem comigrar com bandas ce, mas para simplificar, bandas ce são marcados de acordo com sua origem nas isoformas 1 e 7. Os locais de clivagem MPP (peptidase de processamento mitocondrial), S1 (por OMA1) e S2 (por YME1L) são indicados com setas. A linha laranja e as setas mostram que as bandas c e d são derivados da isoforma longa 7 /uma, e a linha rosa e a seta mostram essa faixa e é derivado da isoforma longa 1 /b. (B) Análise de Western blot de bandas OPA1 em Oma1 e Yme1l MEFs mutantes. Cinco bandas OPA1 (umae) são aparentes em MEFs de tipo selvagem. Oma1- falta de MEFs nulos c e e Yme1l- falta de MEFs nulos d e Oma1 / Yme1l- MEFs nulos não possuem todas as formas abreviadas, ce. A tubulina foi usada como controle de carregamento. (C) Imagens representativas da morfologia mitocondrial (mito-DsRed) em WT e MEFs nulos de protease em diferentes meios. GLY: meio de alta glicose OXI: meio indutor de OXPHOS CHX: meio de alta glicose com 10 μM de cicloheximida. As inserções mostram a visualização ampliada. Barra de escala, 5 μm. (D) Quantificação da morfologia mitocondrial das células em C. Em cada experiência, 100 células foram pontuadas. As barras de erro mostram o SD de três experimentos independentes. (E) Comparação das taxas de fusão mitocondrial in vivo em diferentes meios de comunicação entre WT e Oma1 / Yme1l-null MEFs. A atividade de fusão foi medida pela redução da intensidade de PA-GFP em função do tempo. Barras de erro representam SDs de pelo menos seis medições independentes.

Em fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs), este grupo de quatro isoformas de mRNA dá origem a cinco bandas de proteínas quando os lisados ​​celulares são resolvidos em SDS-PAGE (rotulado umae na Figura 1, A e B). Bandas uma e b são as formas longas decorrentes da isoforma 7 e da isoforma 1, respectivamente (Figura 1A). Bandas c e d são produtos de clivagem S1 e S2 da isoforma 7 gerados por OMA1 e YME1L, respectivamente. Banda e é a forma curta clivada em S1 da isoforma 1. As isoformas 5 e 8 geram apenas isoformas curtas que seriam esperadas para contribuir para as bandas ce (Canção et al., 2007). O mesmo conjunto de bandas OPA1 foi observado em outros estudos, embora as intensidades relativas possam variar, talvez devido a diferenças nas condições de cultura (Anand et al., 2014).

As dependências das bandas ce nas proteases OMA1 ou YME1L foram confirmadas pelo padrão de banda OPA1 em lisados ​​de Oma1-null ou Yme1L- células nulas (Figura 1B). Os padrões de banda OPA1 observados nas células mutantes de protease são tabulados na Figura Suplementar S1B. As identidades do Oma1-null e Yme1LAs células nulas foram confirmadas por Western blotting contra as proteases relevantes (Figura Suplementar S1C). Notavelmente, há uma banda mais longa emergindo em ambos os Yme1l-null e Yme1l / Oma1- células nulas, provavelmente devido à interrupção da formação de isoforma curta dependente de YME1L (isto é, isoforma 8).

Para entender o papel dessas proteases na regulação da função fusogênica OPA1, examinamos Oma1 / Yme1l MEFs de nocaute duplo, que contêm apenas formas longas de OPA1 (Anand et al., 2014). No meio de cultura padrão com alto teor de glicose, essas células mostram fragmentação mitocondrial aumentada em comparação com as células do tipo selvagem (WT) (Figura 1, C e D). Muitos Oma1 / Yme1l células mutantes, no entanto, mostram mitocôndrias tubulares curtas (Figura 1D), de modo que o grau de fragmentação mitocondrial é substancialmente menos grave do que em Mfn1 / Mfn2-null ou Opa1- células nulas (Chen et al., 2005, 2007). Oma1- MEFs nulos mostram perfis de morfologia mitocondrial normais, e Yme1l-null MEFs mostram mitocôndrias altamente fragmentadas (Figura 1D). As tendências gerais - que as mitocôndrias em Oma1 / Yme1l células mutantes são mais fragmentadas do que em células WT, mas menos do que em Yme1l células mutantes - são consistentes com um estudo anterior (Anand et al., 2014). Os padrões de banda OPA1 são semelhantes nas diferentes condições de mídia (Figura Suplementar S1D).

Testamos como essas células mutantes respondem às condições de cultura que aumentam o nível de fusão mitocondrial. MEFs cultivados aumentam a atividade de fusão mitocondrial e mostram alongamento mitocondrial quando cultivados em meio que induz fosforilação oxidativa (OXPHOS). Esta resposta demonstrou depender da atividade YME1L (Mishra et al., 2014). Consistente com essa ideia, descobrimos que o alongamento mitocondrial causado pelo meio indutor de OXPHOS foi anulado em Yme1l-null e Oma1 / Yme1l- MEFs nulos (Figura 1, C e D). Conforme medido no ensaio de fusão fotoativável (PA) - proteína fluorescente verde (GFP), a fusão mitocondrial sob condições basais foi substancialmente reduzida em Oma1 / Yme1- MEFs nulos em comparação com as células WT e não aumentaram em resposta ao meio indutor de OXPHOS (Figura 1E). Em contraste, as células de todos os genótipos testados neste estudo mostram um alongamento mitocondrial robusto em resposta ao tratamento com cicloheximida (CHX), que causa hiperfusão mitocondrial induzida por estresse (Tondera et al., 2009) (Figura 1, C – E). A hiperfusão é induzida rapidamente após a adição de CHX (Figura 1E). O tratamento com CHX melhorou a diluição do sinal PA-GFP em ambos WT e Oma1 / Yme1l-células nulas. As células WT mostraram uma taxa de fusão substancialmente maior do que as últimas, indicando a capacidade de fusão reduzida em Oma1 / Yme1l- células nulas, mesmo na presença de um forte estímulo de fusão. Juntas, nossas observações concordam com a descoberta anterior de que Oma1/Yme1l- células nulas, contendo apenas l-OPA1, retêm a atividade de fusão mitocondrial (Anand et al., 2014). No entanto, o nível de atividade de fusão é substancialmente menor em comparação com as células WT. As proteases OMA1 e YME1L regulam diferencialmente a função OPA1. A hiperfusão induzida por estresse não depende de nenhuma protease, consistente com o relatório de que l-OPA1 é suficiente para mediar a fusão sob esta condição de estresse (Tondera et al., 2009). Em contraste, o alongamento mitocondrial induzido por OXPHOS é dependente da atividade de YME1L, conforme observado anteriormente (Mishra et al., 2014).

O Opa1 O sítio S2 é necessário para mediar a fusão induzida por OXPHOS in vivo

Para esclarecer as funções da clivagem dependente de YME1L de OPA1, usamos o direcionamento de gene mediado por CRISPR-Cas9 em MEFs para gerar mutações no Opa1 locus genômico no exon 5b, que codifica o local de clivagem S2 (Figura 2, A e B). Esperávamos gerar deleções no exon 5b que interromperiam o Opa1 quadro de leitura, resultando em um códon de parada prematuro a jusante que impediria a formação de isoformas OPA1 funcionais contendo S2. Neste cenário, seria esperado que as células mutantes tivessem apenas a isoforma 1 longa (banda b) e o produto de clivagem S1 correspondente (banda e) Bandas uma, c, e d estaria faltando, porque eles surgem de transcritos contendo o exon 5b (Figura 2B).

FIGURA 2: O site S2 codificado por Opa1 O exão 5b é necessário para a fusão induzida por OXPHOS in vivo. (A) Esquema do exon 5b, mostrando as localizações de S2 e do alvo de gRNA CRISPR-Cas9. Deleções presentes nos clones 1 e 2 são indicadas. (B) Esquema da composição da isoforma OPA1 após a eliminação das isoformas contendo o exon 5b. Os Xs vermelhos indicam que se espera que as isoformas estejam ausentes nas células mutantes. (C) Análise de Western blot de ∆exon 5b Clones MEF. Os clones 1 e 2 são clones positivos que mostram o desaparecimento esperado de bandas uma, c, e d. A última pista é um clone negativo. A tubulina foi usada como controle de carregamento. (D) Quantificação da morfologia mitocondrial em WT e dois ∆exon 5b clones nos meios indicados. Cem células foram contadas para cada experimento. Barras de erro indicam SD de três experimentos independentes.

Após a expressão transitória de Cas9 e gRNA (RNA guia) contra o exon 5b alvo em MEFs, identificamos várias colônias sem bandas uma, c, e d (Figura 2C). Para evitar efeitos específicos do clone, usamos três ou mais ∆exon 5b clones em todos os nossos experimentos e os resultados de dois clones diferentes são mostrados nas figuras. O sequenciamento de DNA mostrou que o clone 1 tem uma deleção de dois nucleotídeos homozigótica e o clone 2 tem duas deleções mais longas, cada uma causando deslocamento de quadro (Figura 2A).

o ∆exon 5b as células mostraram perfis mitocondriais normais quando cultivadas em meio contendo glicose regular. Além disso, eles mostraram uma resposta de hiperfusão induzida por estresse normal, alongando dramaticamente as mitocôndrias após a estimulação de CHX (Figura 2D e Figura Suplementar S2A). No meio indutor de OXPHOS, no entanto, as células mutantes não mostraram qualquer alongamento das mitocôndrias em comparação com o crescimento no meio de controle, indicando que a clivagem S2 de Opa1 é necessária para a hiperfusão induzida por OXPHOS. Embora o meio indutor de OXPHOS não promova o alongamento mitocondrial em ∆exon 5b células, não detectamos consequências fisiológicas. O meio indutor de OXPHOS causou a regulação positiva do consumo de oxigênio nessas células (Figura Suplementar S2B), indicando que o aumento da função respiratória não depende do alongamento mitocondrial. Além disso, ambas as células WT e ∆exon 5b as células mostraram crescimento celular semelhante após a mudança para meio indutor de OXPHOS (Figura Suplementar S2C). Além de MEFs, geramos dois ∆exon 5b linhas do mouse. A análise ocidental de tecidos mutantes mostrou revogação de Opa1 bandas de proteína contendo exon 5b (Figura Suplementar S2D). Apesar desta mudança bioquímica nas isoformas OPA1, os camundongos mutantes não mostraram nenhuma disfunção fisiológica óbvia e ganharam peso normalmente (Figura Suplementar S2E) por pelo menos 1 ano de idade.

Detecção de um novo local de clivagem OPA1 em WT e ∆exon 5b células

No decorrer deste estudo, mudamos para um sistema de gel de alta resolução para estudar essas isoformas da proteína OPA1. Com este novo sistema, o que antes era designado por banda d em células WT pode ser resolvido em bandas duplas, que designamos como d e d′ (Figura 3A). Após a reanálise, percebemos que ∆exon 5b as células produzem duas bandas Opa1 curtas, d' e e. Com a exclusão do site S2 dependente de YME1L, ∆exon 5b seria esperado que as células mostrassem apenas o processamento de OPA1 mediado por OMA1. No ∆exon 5b / Oma1- células nulas, banda e está faltando mas dA banda ′ permanece, indicando que é independente de OMA1 (Figura 3A).

FIGURA 3: Detecção de uma nova clivagem OPA1 em WT e ∆exon 5b células. (A) Análise Western de alta resolução de WT, ∆exon 5b, e ∆exon 5b/Oma1-null MEFs. Observe a banda adicional localizada em d em WT MEFs. Esta banda (referida como d′) É mais claramente visto em ∆exon 5b e ∆exon 5b/Oma1-clones nulos. HSP60 foi usado como controle de carregamento. (B) Dependência de banda d' sobre Yme1l. As células que expressam o shRNA indicado foram analisadas por Western blotting. Os dois conjuntos de painéis foram executados no mesmo gel. HSP60 foi usado como controle de carregamento. (C) análise de PCR de Opa1 transcrições em ∆exon 5b células. O primer direto está localizado no exon 3, e o primer reverso está localizado no exon 7 (Figura Suplementar S3C). As bandas correspondentes às isoformas 1 e 5 foram confirmadas por sequenciamento. (D) Esquema das isoformas 1 e 5 de OPA1 de comprimento total. (E) Análise de Western blot da forma curta produzida pela isoforma 5. HSP60 foi usado como controle de carregamento. (F) Dependência da banda da isoforma 5 d′ Em YME1L. O OPA1 humano marcado com FLAG (isoforma 1 ou 5) foi expresso em células do genótipo indicado e analisado por Western blotting contra FLAG. HSP60 foi usado como controle de carregamento.

Como YME1L é a outra protease intermembrana conhecida envolvida no processamento pós-tradução de OPA1, usamos o RNA em gancho curto (shRNA) para testar se é essencial para a produção de banda d′. As eficiências de knockdown do Yme1l e Oma1 Os shRNAs foram confirmados por Western blotting (Figura Suplementar S3, A e B). Em células WT, o knockdown de YME1L causou o desaparecimento de bandas d e d′, Enquanto o knockdown de OMA1 causou o desaparecimento de bandas c e e (Figura 3B). A dependência de d′ Em YME1L, mas não em OMA1, foi posteriormente confirmado em ambos Δexon 5b / Oma1- células nulas e Δexon 5b células (Figura 3B).

Para identificar a origem da nova banda curta OPA1 d′, Usamos a análise de PCR de cDNA de Δexon 5b células para identificar as principais restantes Opa1 transcrições de mRNA. Usando primers que flanqueiam os exons de splicing alternativo 4, 4b e 5b para distinguir os transcritos de mRNA individuais (Figura Suplementar S3C), descobrimos que as células mutantes expressaram as variantes de splice de mRNA 1 e 5 (confirmadas por análise de PCR e sequenciamento), com a isoforma 1 sendo ligeiramente mais abundante (Figura 3, C e D). Não é surpreendente que as isoformas 7 e 8 estejam ausentes, porque elas contêm o exon 5b. Em vez disso, a isoforma 5 contém o exon 4b alternativo (Figura 3D) e, como outras isoformas contendo o exon 4b, foi anteriormente demonstrado ser clivado constitutivamente em uma isoforma curta (Song et al., 2007). A clivagem constitutiva da isoforma 5 foi assumida como ocorrendo no local S1, o único local de clivagem conhecido nesta isoforma (Song et al., 2007). No entanto, questionamos se essa suposição pode estar incorreta, porque a clivagem da isoforma 5 em S1 levaria à banda e, não d′. Para testar se a isoforma 5 pode gerar banda d′, Expressamos a isoforma 5 em Opa1-células nulas. A isoforma 5 gerou uma isoforma curta que era claramente distinta de e e comigrou com o d′ Bandas presentes em ∆exon 5b e ∆exon5b / Oma1células nulas (Figura 3E). Esta observação indica que a isoforma 5 é a provável fonte de banda d′. Seu local de clivagem é N-terminal para S1, conforme indicado pelo tamanho ligeiramente maior de d' comparado com e.

Para determinar a protease responsável pela clivagem da isoforma 5 e ainda confirmar que a banda dependente de YME1L d′ De fato surge da isoforma 5, comparamos o comportamento das isoformas 5 e 1 humanas marcadas com FLAG C-terminal em MEFs mutantes sem OMA1 ou YME1L. Consistente com estudos anteriores que mostram clivagem em S1 por OMA1, a isoforma 1-FLAG produz uma isoforma curta que é dependente de OMA1 (Figura 3F). Quando YME1L está ausente, mais desta isoforma curta é produzida, presumivelmente devido à regulação positiva da atividade de OMA1 (Wai et al., 2015). Como esperado, a isoforma 5-FLAG é completamente processada em MEFs de controle. A ausência de OMA1 não afeta o padrão de clivagem, indicando que a produção da forma curta da isoforma 5 é independente de OMA1 (Figura 3F). A remoção de Yme1l anula completamente a produção desta forma curta e resulta em uma banda inferior que comigra com a isoforma curta gerada a partir da isoforma 1 (Figura 3F). Além disso, uma pequena quantidade da forma longa, anteriormente ausente, é formada. Estes resultados indicam que, em condições normais, a isoforma 5 é processada até a conclusão em um local a montante de S1, de uma maneira dependente de YME1L, para produzir banda d′. Quando YME1L está ausente, a clivagem é ativada no local S1 a jusante. Apenas a forma longa é gerada a partir da isoforma 5 quando OMA1 e YME1L estão ausentes (Figura 3F, última faixa). Juntos, os resultados sugerem que a isoforma 5 de OPA1 é altamente suscetível ao processamento de protease, normalmente por YME1L. Na ausência de YME1L, OMA1 processa a isoforma 5 em OPA1 clivado por S1. Nenhuma protease adicional é suficiente para a clivagem da isoforma 5, conforme indicado pela formação da isoforma 5 longa quando ambos Yme1l e Oma1 estão ausentes.

Identificação de um local de clivagem dependente de YME1L rico em leucina no exon 4b

Nossos resultados até agora sugerem que a isoforma 5 contém um novo local de clivagem dependente de YME1L a montante de S1. Para localizar o novo local de clivagem (que designamos como S3), perguntamos se a clivagem é dependente do exon 4b, o primeiro exon a montante do exon 5. O knockdown do exon 4b com shRNA reduziu substancialmente a intensidade da banda d′ Em WT, Δexon 5b, e Δexon 5b / Oma1- células nulas (Figura 4A, banda d′ Marcado com asteriscos). Esta dependência sugere que o local de clivagem provavelmente reside no exon 4b. Para testar essa ideia, analisamos o comportamento de uma série de mutantes da isoforma 5 (Mut 1-9) contendo várias deleções curtas no exon 4b (Figura 4B). Os mutantes 1, 2 e 3, contendo deleções na metade 5 ′ do exon 4b, não mostram nenhum defeito no processamento de clivagem da isoforma 5, indicando que a primeira metade do exon 4b não contém o local de clivagem (Figura 4C). As mutações 4, 5 e 6 resultam em pequenas quantidades da forma longa, que normalmente está ausente. Além disso, esses mutantes mostram produção proeminente de bandas e. Os mutantes 7 e 8 também mostram a presença da forma longa e banda e. Além disso, esses mutantes mostram novos produtos de clivagem formando uma mancha acima da banda e (Figura 4C). A mutação 9, que deletou os aminoácidos de ligação entre os exons 4b e 5, gera a banda e e produz novos produtos de clivagem sem gerar uma forma longa de isoforma 5. Esses resultados sugerem que a clivagem S3 é sensível a mutações na metade 3 ′ do exon 4b, e particularmente a mutações (mutantes 7 e 8) que afetam um trecho de cinco leucinas consecutivas (aminoácidos 199-203 na isoforma 5). Curiosamente, os efeitos mais proeminentes das mutações estão no aparecimento da forma longa e novos produtos de clivagem, em vez de na eliminação da banda d′.

FIGURA 4: Identificação do local de clivagem OPA1 S3 dependente de YME1L no exão 4b. (A) Dependência de banda d′ No exão 4b. shRNA contra Opa1 O exão 4b foi expresso em células do genótipo indicado. Asteriscos destacam banda d′. HSP60 foi usado como controle de carregamento. (B) Esquema de Opa1 mutantes do exão 4b. No topo, as sequências polipeptídicas codificadas pelo exon 4b (vermelho) e exon 5 (azul) são mostradas. A seta vermelha indica o local de clivagem S1 conhecido no exon 5, as setas verdes indicam os novos locais S3 encontrados neste estudo. Os mutantes da isoforma 5 são listados, juntamente com os aminoácidos deletados no exon 4b. (C) Efeito de mutantes do exon 4b no processamento de OPA1. Mutantes de exon 4b marcados com FLAG da isoforma 5 humana foram expressos em Opa1- células MEF nulas e analisadas por Western blot. As isoformas 1 e 5 de WT marcadas com FLAG foram usadas como controles. HSP60 foi usado como controle de carregamento. (D) Efeito de OMA1 e YME1L no processamento de OPA1 em mutantes da isoforma 5. Iso 5 humano WT e seus mutantes 2, 6 e 7 foram expressos em Oma1- e Yme1l- MEFs nulos e padrões de banda OPA1 marcados com FLAG foram analisados ​​por Western blot. HSP60 foi usado como controle de carregamento. (E) Identificação de prováveis ​​locais de clivagem S3 dentro do exon 4b por espectrometria de massa em tandem de banda d′. Banda d′ Foi produzido pela expressão de FLAG marcado Opa1 isoforma 5 em células 293T, purificada por imunoprecipitação anti-FLAG, resolvida por SDS-PAGE, digerida por tripsina e submetida a espectrometria de massa em tandem. À esquerda, o esquema indica os três peptídeos N-terminais irregulares identificados, coloridos de acordo com sua intensidade relativa. Certo, gráfico da intensidade dos três peptídeos. (F) Efeito de mutantes penta-leucina na geração de banda d′. Conforme indicado, as alaninas foram usadas para substituir 1, 2 ou 3 leucinas no trecho penta-leucina C-terminal codificado pelo exão 4b. Mutantes marcados com FLAG da isoforma 5 foram expressos em Opa1células nulas e analisadas por Western blot. HSP60 foi usado como controle de carregamento. (G) Esquema do perfil de isoforma OPA1 em ∆exon 5b MEFs. A seta verde representa o novo site S3 identificado.

Para determinar as proteases responsáveis ​​pela clivagem dos mutantes, expressamos os mutantes marcados com FLAG em MEFs mutantes de protease (Figura 4D). Nos mutantes 6 e 7, o menor produto de clivagem desapareceu em Oma1- células nulas, indicando que é dependente de OMA1. No mutante 7, existem formas curtas maiores que são dependentes de YME1. Na ausência de OMA1 e YME1L, nenhuma clivagem foi observada, demonstrando que essas duas proteases são essenciais para o processamento da isoforma 5.

Para identificar o local de clivagem com mais precisão, usamos espectrometria de massa em tandem para determinar a sequência N-terminal da banda d′, Produzido por superexpressão da isoforma 5 humana marcada com FLAG em células 293T. Banda d′ Foi coletado por imunoprecipitação contra a tag FLAG, resolvido em SDS – PAGE e isolado para análise bioquímica. Os peptídeos foram gerados por digestão com tripsina e identificados por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa em tandem de ionização de nanospray (LC-MS). Dos peptídeos identificados, apenas três tinham terminais N não trípticos. Os dois predominantes tinham terminais N localizados dentro do exão 4b, começando com a penúltima leucina e a última leucina do trecho penta-leucina (Figura 4E). O último péptido teve de longe a intensidade mais elevada, sugerindo que representa o produto de clivagem S3 predominante. Para testar essa ideia, projetamos mutantes isoforma 5 (mutantes 10–13) em que as últimas 1–3 leucinas do trecho penta-leucina foram substituídas por alanina. Descobrimos que a substituição de uma única leucina (mutantes 12 e 13) teve pouco efeito na banda d′ Produção, embora um pequeno nível de produtos de clivagem maiores pudessem ser observados (Figura 4F). Quando as duas últimas leucinas foram substituídas (mutante 11), houve um nível mais substancial de clivagem aberrante e a isoforma longa apareceu. Ambos os efeitos aumentaram quando as três últimas leucinas foram substituídas (mutante 10). Tomados em conjunto, o LC-MS e a análise mutacional argumentam fortemente que o local de clivagem S3 está dentro do trecho penta-leucina codificado pelo final do exon 4b. Embora os espectros de íons de produto indicassem que a clivagem ocorre principalmente no terminal N até a última leucina, os fenótipos mutacionais sugerem que a clivagem pode ocorrer em outros locais muito próximos ao trecho penta-leucina (Figura 4C, pistas 9-13). Nenhuma das mutações elimina completamente a produção de banda d′, Sugerindo que a clivagem ainda pode ocorrer muito perto de S3 quando o local está mutado. Também é aparente que a isoforma 5 é altamente propensa ao processamento proteolítico - quando o local S3 está mutado, a clivagem é ativada em S1 ou em locais crípticos N-terminal para S3, levando a formas clivadas variantes da isoforma 5. Nossa análise indica que ∆exon5b células retêm dois dominantes Opa1 transcrições de mRNA, isoformas 1 e 5. Este perfil de transcrição simplificado resulta em um l-OPA1 (da isoforma 1) e dois s-OPA1 (isoformas 1 / S1 e 5 / S3) (Figura 4G).

A forma curta clivada de S3 da isoforma 5 regula a tubulação mitocondrial

Em humanos e camundongos, metade dos Opa1 as formas de emenda contêm o exon 4b e são clivadas constitutivamente para produzir isoformas exclusivamente curtas (Song et al., 2007). Isso levanta a questão de por que Opa1 codifica várias formas de splice de mRNA, cuja única finalidade aparente é gerar isoformas curtas. Usamos a isoforma 5 para resolver esse problema. Consistente com estudos anteriores (Song et al., 2007), a isoforma 5 quase não tem atividade de alongamento mitocondrial quando expressa em Opa1- MEFs nulos, que têm mitocôndrias altamente fragmentadas devido à perda completa de fusão da membrana interna (Figura 5A e Figuras Suplementares S5A e S4A). Mutações da isoforma 5 que interrompem o processamento de S3, no entanto, mostram atividade de fusão mitocondrial substancial, conforme indicado por sua capacidade de alongar mitocôndrias (Figura 5A e Figuras Suplementares S5A e S4, A e B). Como esses mutantes produzem uma variedade de formas curtas e também longas, esses resultados se encaixam no modelo de que uma mistura de isoformas longas e curtas de OPA1 é importante para a atividade de fusão mitocondrial (Song et al., 2007). Alternativamente, esses resultados poderiam ser explicados propondo que é a produção da isoforma longa que induz a atividade de fusão mitocondrial.

FIGURA 5: A forma curta clivada em S3 da isoforma 5 regula a morfologia mitocondrial. (A) Alongamento da mitocôndria por mutantes da isoforma 5. Os mutantes da isoforma 5 foram expressos em Opa1células nulas e morfologias mitocondriais foram quantificadas. Barras de erro indicam SD de seis experimentos independentes. (B) Esgotamento da banda d′ Por shRNA contra o exon 4b e reexpressão de d′ Pela isoforma 5. A expressão ectópica da isoforma 5 é suficiente para superar o efeito shRNA e produzir d′. As isoformas OPA1 foram analisadas por Western blotting contra OPA1. HSP 60 foi usado como controle de carregamento. (C) Efeito do shRNA do exon 4b na morfologia mitocondrial. Barras de erro indicam SD de três experimentos independentes. (D) Análise da expressão de OPA1 bicistrônica. Opa1- células nulas que expressam a isoforma 1 ou isoforma 1 mais a isoforma 5 foram analisadas por Western blotting contra OPA1. ∆exon 5b as células são mostradas para comparação. HSP60 foi usado como controle de carregamento. (E) Efeito da banda d′ Na morfologia mitocondrial. Quantificação da morfologia mitocondrial de Opa1-null MEFs expressando isoforma 1 com YFP ou isoforma 1 com isoforma 5. Barras de erro indicam SD de três experimentos independentes. P os valores para fragmentado, tubular curto, tubular longo e interconectado foram 4,8 × 10 –4, 0,04, 0,001 e 9,9 × 10–7, respectivamente. P os valores foram calculados por Student's t teste. (F) Modelo mostrando as isoformas OPA1 em condições normais e S3 interrompidas. Quando S3 é interrompido (painel inferior, caixa), clivagens em S1 e locais crípticos são ativados, preservando a produção de s-OPA1. OM: membrana externa, IM: membrana interna.

Para distinguir entre esses dois modelos, investigamos ainda mais a função fisiológica da forma curta da isoforma 5. Usamos o shRNA para derrubar o exon 4b em Δexon 5b e Δexon 5b / Oma1-células nulas, que têm um portfólio simplificado de Opa1 formas de junção de mRNA. Como esperado, o knockdown do exon 4b resultou na redução da banda d′ Em ambas as linhas celulares (Figuras 4A e 5B). No Δexon 5b MEFs, o knockdown do exon 4b leva à fragmentação mitocondrial dramática (Figura 5C e Figura Suplementar S5B). Da mesma forma, em Δexon 5b / Oma1- células nulas, o knockdown do exon 4b resulta em fragmentação mitocondrial (Figura 5C e Figura Suplementar S5B). Para verificar que o resultado do knockdown não é devido a efeitos fora do alvo, reexpressamos a isoforma 5 nos knockdowns do exon 4b (Figura 5B) e observamos o alongamento da morfologia mitocondrial em ambas as linhas celulares (Figura 5C e Figura Suplementar S5B).

Para testar ainda mais essa ideia de que uma forma curta de OPA1 pode colaborar com uma forma longa para regular a fusão mitocondrial, desenvolvemos um sistema de expressão para co-expressar duas formas de splice OPA1 diferentes em Opa1-null MEFs. Construímos um vetor de expressão bicistrônica para gerar a isoforma 1 junto com a isoforma 5, ou a isoforma 1 junto com o controle YFP. O Western blot confirmou o padrão de banda OPA1 esperado nessas células (Figura 5D). Com a expressão da isoforma 1 sozinha, a banda longa b e a banda curta e foi produzido. Com a expressão bicistrônica das isoformas 1 e 5, uma forma curta adicional (d′ Da isoforma 5) foi adicionado. Esta dupla expressão recapitulou as bandas observadas em Δexon 5b células (Figura 5D) e resultou em perfis mitocondriais mais longos. Significativamente, mais células continham mitocôndrias interconectadas e menos células tinham mitocôndrias fragmentadas, em comparação com a expressão da isoforma 1 sozinha (Figura 5E e Figura Suplementar S5C). Estes resultados sugerem que s-OPA1 clivado por S3 pode funcionar com l-OPA1 para promover a fusão mitocondrial. Para determinar se esta sinergia requer atividade de hidrólise de GTP em s-OPA1, usamos o sistema bicistrônico para expressar a isoforma 1 de tipo selvagem com a isoforma 5 contendo um domínio GTPase disfuncional (iso 5-G300E) em Opa1-null MEFs. O padrão de banda de proteína foi semelhante em células que expressam Iso 1-IRES-Iso 5-G300E em comparação com células que expressam Iso 1-IRES-Iso 5 (Figura Suplementar S5D). A isoforma mutada 5 foi ineficaz na promoção da fusão mitocondrial em combinação com a isoforma 1 de tipo selvagem, demonstrando que a atividade de GTPase é necessária em s-OPA1 para manter a função de fusão (Figura Suplementar S5, C e E).


RESULTADOS

Especificidade de ADAM 10 purificado para substratos peptídicos.

Como um substrato peptídico que abrange o local de clivagem de & # x003b1-secretase, escolhemos a sequência de amida octadecapeptídica, resíduos 11 & # x0201328 em A & # x003b2 (numeração em relação ao terminal N de A & # x003b2) (12). Seu terminal C corresponde ao primeiro resíduo extracelular de APP. Após uma incubação de 30 min de A & # x003b2 (11 & # x0201328) com ADAM 10, a análise de HPLC mostrou clivagem de 28 & # x00025 do peptídeo inicial com dois fragmentos surgindo (Tabela & # x200B (Tabela 1). 1). A análise por espectrometria de massa de ionização por eletropulverização identificou-os como o hexapeptídeo N-terminal (& # x0005bM & # x0002bH & # x0005d & # x0002b íon em m& # x0002fz de 777,5) e o dodecapeptídeo amida C-terminal (& # x0005bM & # x0002bH & # x0005d & # x0002b íon em m& # x0002fz de 2082,8) da amida octadecapeptídeo parental. Assim, o ADAM 10 cliva proteoliticamente entre Lys-16 e Leu-17 como esperado para uma enzima com atividade & # x003b1-secretase. Após uma incubação de 6 horas, 69 & # x00025 de A & # x003b2 (11 & # x0201328) foram clivados predominantemente neste local com clivagem menor ocorrendo após Leu-17 e Val-18 (Fig. & # X200B (Fig.1 1 UMA e Tabela & # x200B Tabela1). 1).

Tabela 1

Especificidade de ADAM 10 purificado de rim bovino para peptídeos que abrangem o local de clivagem de proteínas eliminadas & # x02009

ProteínaSeqüência& # x00025 clivagem por ADAM 10 bovino
30 minutos6 horas
APLICATIVOEVHHQK & # x02193 LVFFUMAEDVGSNK-NH22869
APP (A692G)EVHHQK & # x02193 LVFFGEDVGSNK-NH21454
Receptor de IL-6ANATSLPVQ & # x02193 DSSSV-NH200
Enzima conversora de angiotensinaTPNSAR ↓ SEGPLPDSGR-NH200
Pro-TNF-αPLAQA ↓ VRSSSRTPSD-NH249100

Cleavage of peptides by ADAM 10 after 30 min or 6 hr was determined by HPLC analysis. ↓, proteolytic cleavage site. 

Cleavage of peptides spanning the α-secretase cleavage site of APP by ADAM 10. (UMA) Peptide substrates were incubated in cleavage buffer in the absence (Deixou) or in the presence of ADAM 10 (Direito) for 6 hr at 37ଌ, followed by HPLC analysis. The asterisks indicate the peptide substrates and the numbers indicate the products generated as follows: 1, EVHHQK-OH 2, LVFFAEDVGSNK-NH2 3, LVFFGEDVGSNK-NH2. (B) CD spectra of APP peptides. Measurements were carried out in the presence of 0.5% SDS.

Next we examined whether the extent of cleavage depends on the conformation of the substrate as has been described for the cleavage of APP by α-secretase (3). For this purpose, Ala-21 in Aβ(11�) was replaced by Gly. This position corresponds to a naturally occurring Ala → Gly mutation at position 692 of APP770 (31), which was identified in patients with cerebral hemorrhages due to amyloid angiopathy. Na Vivo studies with APP770 (A692G) showed that this mutation C-terminal to the α-secretase cleavage site led to relatively more Aβ compared with p3 by partial inhibition of α-secretase (32) and to an increased alternative cleavage of the Aβ domain, probably caused by aberrant substrate recognition of α-secretase (33).

CD measurements for the octadecapeptide amide Aβ(11�) in 0.5% SDS showed a spectrum characteristic for α-helical conformation, whereas a random coil conformation was observed for the peptide with the Ala → Gly mutation in position 21 of Aβ(11�) (Fig. ​ (Fig.1 1 B) The latter peptide was cleaved by ADAM 10 less efficiently than the wild-type peptide: after 30 min, only 14% of the peptide was cleaved between Lys-16 and Leu-17 compared with 28% of Aβ(11�) (Table ​ (Table1). 1 ). ADAM 10 did not cleave peptide substrates containing a cleavage site for ectodomain shedding of angiotensin-converting enzyme (34) or IL-6 receptor (35), but it cleaved a peptide substrate derived from pro-TNF-α, as reported (36, 37).

Several metalloproteinase inhibitors were examined for their ability to inhibit cleavage of Aβ(11�) by purified ADAM 10. The hydroxamic acid-based inhibitor BB-3103 (38) at 100 μM completely inhibited the cleaving activity. ADAM 10 was also completely inhibited by 1 mM DTT, which suggests the existence of thiol or disulfide bonds important for α-secretase activity, and by 1 mM of the chelating agent 1,10-phenanthrolin.

Processing and Localization of ADAM 10 in HEK Cells.

To study the effect of ADAM 10 on APP cleavage in a cellular system, we used HEK cells. The ADAM 10 cDNA was cloned from a bovine kidney cDNA library, tagged at its 3′ end with a DNA sequence coding for the HA antigen, and cloned into the expression vector pcDNA3. After transfection of HEK cells and HEK cells stably expressing APP695 (HEK APP695) (29) with ADAM 10, clones were analyzed for expression and processing of the metalloprotease. For this purpose, cell lysates were immunoprecipitated with anti-HA antibody (16B12) and analyzed by SDS/PAGE and Western blot. Immunostaining revealed two immunoreactive species with apparent molecular masses of 90 kDa and 64 kDa (Fig. ​ (Fig.2 2 UMA, lanes 2 and 5). The 64-kDa form is derived from the 90-kDa form by removal of the prodomain (194 aa), probably by a furin-like pro-protein convertase, which cleaves ADAMs at the sequence motif RXKR in a late Golgi compartment (39). The calculated molecular mass of the protein core of ADAM 10 after cleavage of the prodomain is 61 kDa. To investigate whether the difference between apparent and calculated molecular masses is caused by glycosylation on the putative N-glycosylation sites of ADAM 10 (24), the glycoproteins of the cell clone with the highest expression level of ADAM 10 (HEK ADAM 10) were treated with N-glycosidase F. This treatment resulted in a reduction of the molecular masses to the expected values of about 86 kDa for the precursor protein and about 61 kDa for the protein core of ADAM 10 lacking the prodomain (Fig. ​ (Fig.2 2 UMA, lane 3).

Expression and deglycosylation of ADAM 10 protease (UMA) After transfection of HEK and HEK APP695 cells with ADAM 10 cDNA, cell lysates were immunoprecipitated with anti-HA antibody, subjected to deglycosylation with N-glycosidase F (PNGase F) (lane 3), or directly analyzed by 4�% NuPAGE gel system and Western blot. (B) HEK and HEK ADAM 10 cells were surface-biotinylated. After immunoprecipitation with anti-HA antibody (16B12) and elution of the immune complexes, four-fifths of the eluate were incubated with immobilized streptavidin (lanes a), and the remaining one-fifth was directly applied to a 10% SDS/PAGE gel (lanes b) and then blotted onto PVDF membranes.

The localization of ADAM 10 in transfected HEK cells was investigated by cell surface biotinylation and confocal microscopy. For biotinylation, cells were cooled to 4ଌ and incubated for 30 min with sulfo-N-hydroxysuccinimidobiotin, a membrane-impermeant biotinylation reagent. Immunoprecipitation was performed with the anti-HA mAb. Four-fifths of collected immunoprecipitates were incubated with immobilized streptavidin to recover protease molecules localized on the plasma membrane. Fig. ​ Fig.2 2 B shows the appearance of both the processed �-kDa form of ADAM 10, as well as its 90-kDa precursor at the cell surface (lanes a). One-fifth of the immunoprecipitate that was not incubated with streptavidin predominantly showed the nonprocessed 90-kDa form and only a faint band of proteolytically activated ADAM 10 (lanes b). These results demonstrate that the proteolytically activated form of ADAM 10 is localized mainly on the cell surface, where it is able to cleave APP. The majority of ADAM 10 was found intracellularly as proenzyme. Analysis of the localization of ADAM 10 by confocal microscopy of permeabilized HEK ADAM 10 cells showed that its staining pattern largely overlapped with that of the Golgi marker 58K (Fig. ​ (Fig.3). 3 ).

Colocalization of ADAM 10 and of a Golgi marker in HEK cells. Stably expressed ADAM 10 and the Golgi network were simultaneously immunostained. (Deixou) Anti-Golgi 58K protein. (Direito) Anti-HA-epitope staining. The high degree of overlap of both immunoreactivities in the perinuclear region reveals a strong colocalization of ADAM 10 and the trans-Golgi marker. The scale bar is in μm.

Effect of ADAM 10 on α Secretase Cleavage of APP in HEK Cells.

The α-secretase activity in HEK ADAM 10 cells was compared with the activity found in untransfected HEK cells. The release of APPs into the medium from cells was monitored with two site-specific antibodies, 1736 and 6E10, both of which recognize the N-terminal sequence of Aβ and thus only detect APPsα, and not APPsβ. Immunoblot experiments and immunoprecipitation after metabolic labeling with 35 S were performed to determine α-secretase activity (Figs. ​ (Figs.4 4 and ​ and5). 5 ). Quantitative analysis of immunoblot experiments with mAb 6E10 showed that HEK cells stably expressing a high level of ADAM 10 release approximately four times more APPsα into the medium compared with untransfected HEK cells (Fig. ​ (Fig.4, 4 , lanes 1 and 4). Increased α-secretase activity was also observed in the HEK APP695 cell clone stably expressing ADAM 10. The relative increase of APPs751α derived from endogenous APP and of APPs695α was only 2-fold (Fig. ​ (Fig.4 4 UMA, lanes 7 and 8), because of the lower expression level of ADAM 10 (Fig. ​ (Fig.2, 2 , lane 5) and the higher substrate to enzyme ratio.

Secretion of APPsα from HEK and HEK ADAM 10 cells. (UMA) Cells were incubated in the presence of indicated compound. After 4 hr, the medium was collected, and proteins were precipitated and subjected to immunoblot analysis with antibody 6E10 followed by a 35 S-labeled anti-mouse IgG antibody. (B) Quantitative analysis of secreted APPsα. The radioactive bands corresponding to APPsα were quantified with the Bio-Imaging analyzer model BAS-1800. The results are expressed as percentage of secreted APPsα in control HEK cells and are the averages ±SD of at least three experiments.

Effect of ADAM 10 on the production of APPsα and on the 10-kDa C-terminal fragment. (UMA) Cells were metabolically labeled with l -[ 35 S]methionine and [ 35 Sלysteine (200 㯌i/ml) for 5 hr. Cell media were immunoprecipitated with antibody 1736 and analyzed by SDS/PAGE in 10% gels. (B) Cell lysates were immunoprecipitated with antibody C7. The samples were separated by 10�% Tris/Tricine gel (Novex) and analyzed as described. (C) Quantitative analysis of holo-APP and p10. The values of p10 were normalized to the levels of holo-APP. The results are the averages ±SD of four experiments. Statistical significance between control cells and HEK ADAM 10 cells was determined by Student’s unpaired t test (∗, P < 0.005).

Hydroxamic acid-based zinc metalloprotease inhibitors have recently been shown to inhibit the ectodomain shedding of several membrane proteins including the α-secretase cleavage of APP. No effect on the release of APPsβ has been found (40). We therefore investigated the effect of the hydroxamic acid-based inhibitor BB-3103 on HEK cells and on HEK cells overexpressing ADAM 10. BB-3103 inhibited the release of APPsα in HEK cells by about 40% (Fig. ​ (Fig.4, 4 , lanes 1 and 3) and in HEK ADAM 10 cells by about 70% (Fig. ​ (Fig.4, 4 , lanes 4 and 6).

The stimulation of protein kinase C by phorbol esters strongly enhances the release of APPsα and inhibits the secretion of Aβ (41, 42). To examine the effect of protein kinase C stimulation on ADAM 10 activity, HEK and HEK ADAM 10 cells were treated with 1 μM phorbol 12-myristrate 13-acetate (PMA). Immunoblot experiments showed that PMA increased APPsα release from HEK cells about 6.0-fold (Fig. ​ (Fig.4, 4 , lanes 1 and 2). The augmented α-secretase activity from HEK ADAM 10 cells was further increased 2.5-fold (Fig. ​ (Fig.4, 4 , lanes 4 and 5).

Similar results were observed in immunoprecipitation experiments with antibody 1736, thus the expression of ADAM 10 in HEK cells significantly increased APPsα secretion into the medium (Fig. ​ (Fig.5 5 UMA) To determine whether ADAM 10 expression also increases the level of p10, cell lysates from HEK and HEK ADAM 10 cells after metabolic labeling were immunoprecipitated with antibody C7 recognizing the C-terminal part of APP. As shown in Fig. ​ Fig.5 5 B e C, the expression of full-length APP (holo-APP) is not changed, whereas the signal for p10 is significantly stronger in HEK ADAM 10 cells than in control cells, further indicating that ADAM 10 has α-secretase activity.

Effect of a Dominant Negative ADAM 10 Mutant on α Secretase Activity.

To determine whether the human homologue of ADAM 10 is expressed in HEK cells and, therefore, might be responsible for the endogenous α-secretase activity, we performed reverse transcriptase–PCR analysis using total RNA obtained from these cells and oligonucleotides specific for ADAM 10. As shown in Fig. ​ Fig.6 6 UMA, HEK cells express detectable amounts of mRNA encoding for human ADAM 10, which shows 97% identity of amino acids with bovine ADAM 10. In a control experiment, bovine ADAM 10 mRNA was detected in total RNA of MDBK cells known to express ADAM 10 (24).

Inhibition effect of a dominant negative ADAM 10 protease form (DN). (UMA) Endogenous expression of ADAM 10 in HEK and MDBK cells detected by reverse transcriptase–PCR. In each case a 541-bp DNA fragment could be amplified. As control, RNA from HEK cells was treated with RNase A before reverse transcription (St, DNA molecular weight marker). (B) Quantitative analysis of secreted APPsα after immunoblot analysis. The results are expressed as percentage of secreted APPsα in control HEK cells and are the averages ±SD of at least three experiments. Statistical significance between control cells and HEK˽N cells treated or untreated with PMA was determined by Student’s unpaired t test (∗, P < 0.005 ∗∗, P < 0.001).

To inhibit the endogenous α-secretase activity in HEK cells, the point mutation E384A was introduced into the zinc binding site of the bovine ADAM 10 protease. A mutant KUZ protein with a mutation at the same site acted as a dominant negative form in D. melanogaster (21). HEK cells stably expressing the mutant ADAM 10 E384A (HEK˽N) showed a substantially decreased secretion of APPs. The inhibitory effect was most apparent in PMA-treated cells: only about 25% of enzymatic activity was observed (Fig. ​ (Fig.6 6 B) Thus, this point mutation resulted in a dominant negative form of the protease and significantly decreased constitutive and stimulated α-secretase activity.


Discussão

Mechanistic and structural implications

We have successfully demonstrated that controllable cleavages of recombinant proteins can be achieved using the engineered Ssp DnaB S1 split-intein. One part of the split-intein is embedded in the precursor protein, and the complementary part of the split-intein is added em trans when needed to activate the desired cleavage reaction. In the C-cleavage design, the 144-aa IC sequence in the precursor protein could not undergo C-cleavage on its own, which demonstrates for the first time that the 11-aa IN sequence from the N-terminus of the intein is required for C-cleavage (through Asn cyclization) at the C-terminus of the intein. O euN sequence is not known to participate directly in catalyzing Asn cyclization therefore, its effect is more likely structural. In the intein crystal structure, IN is located together with the C-terminal part (including the Asn residue) of the intein in a catalytic pocket 20 therefore, the deletion of IN might have left a structural void in the catalytic pocket and thus affected cyclization of Asn. O euC was activated to undergo C-cleavage when the missing IN was added as a synthetic peptide, indicating that the IN can associate with the IC em trans to reconstitute an active intein. O euN peptide lacked an N-extein therefore, the C-cleavage reaction (Asn cyclization) must have occurred without the first two steps (acyl shift and trans-esterification) of the protein splicing mechanism.

In the N-cleavage design, the 11-aa IN sequence was embedded in the precursor protein, and the separately produced IC protein must recognize and associate with the short IN seqüência em trans, in order for N-cleavage to occur. The reconstituted intein (IC plus IN) must have catalyzed an N-S acyl shift at the N-terminus of IN, and the resulting ester bond was hydrolyzed to complete the N-cleavage reaction. DTT increased the rate constant and the efficiency of the N-cleavage reaction by ∼10-fold and more than 4-fold, respectively, which is likely due to DTT promoting thiolysis of the ester bond, which occurs more rapidly than cleavage by hydrolysis.

The success of our N-cleavage design also for the first time reveals an interesting structural flexibility of the IC protein, as the IC protein could functionally assemble with the 11-aa IN sequence even when the IN was sandwiched between two large protein domains. The crystal structure of the Ssp DnaB mini-intein, from which the S1 split-intein was derived, is shaped like a disk or closed-horseshoe, 20 and the 11-aa IN sequence runs almost perpendicularly through the center of the disk-like structure [Fig. 8(A)]. The 11-aa IN sequence forms two small β-strands named β1 and β2. The β2 part of IN interacts with the β3 part of the IC protein to form an antiparallel β-sheet, which may contribute to the association between IN within the precursor protein and the IC proteína. The β1 part of IN is buried deeply inside the intein structure and is enclosed by three β-strands (β5, β6, and β10) of the IC proteína. It appears spatially impossible for the IN sequence to simply insert or thread itself through the central cavity of the IC protein, because in the precursor proteins tested, the IN sequence was sandwiched between two relatively large globular protein domains (the 42-kDa maltose-binding protein at the N-terminus, and proteins ranging from the 12.5-kDa thioredoxin to the 116-kDa β-galactosidase at the C-terminus). A more likely scenario is that the IC protein is structurally flexible enough to open up like a clamp so that it could saddle onto the IN sequence within the precursor protein, and then close around the IN sequence to form the active intein [Fig. 8(B)]. It is also possible that the IC protein preexists in an open-clamp structure and can change to the closed-disk-like structure only upon association with the IN seqüência. The structural flexibility of the intein could be manifested by the two long β-strands (β5 and β10), which together form the backbone of the disk-like structure of the intein.

Structural modeling of IC association with IN for the N-cleavage. (A) Schematic representation of the precursor protein before and after association with the IC proteína. Ribbon structures of IN (red) and IC (yellow) are adapted from a crystal structure of the Ssp DnaB mini-intein that was split into the IN e euC parts, with some of the 12 β-strands numbered according to the original crystal structure. 20 The precursor protein consists of the 11-aa IN (β-strands 1 and 2, red) sandwiched between a maltose-binding protein (MBP) and a thioredoxin (Trx). The 42-kDa MBP and the 12.5-kDa Trx are shown as round balls but not drawn to scale relative to the 17-kDa intein (IN plus IC) (B) A hypothetical model for association of IC with IN. In the first step, a transient conformational change of the IC protein loosens its structure into an open-horseshoe shape. In the second step, the IC protein saddles onto IN and closes up to form the disk-like structure of an active intein.

Our ability to precisely control the N-cleavage and the C-cleavage reactions permitted easy analysis of the reaction kinetics. Interestingly, the N-cleavage rate constant of this Ssp DnaB S1 split-intein is significantly lower than the previously reported N-cleavage rate constants of (1.0 ± 0.5) × 10 −3 s −1 for the Ssp DnaE S0 split-intein 21 and 1.9 × 10 −3 s −1 for the Sce VMA S0 split-intein. 22 This may be due to the very different amino acid sequences of these inteins, although the crystal structures of inteins are generally highly conserved. The different rate constants may be more likely due to the different split sites of these inteins, because the Ssp DnaB S1 split-intein is split at the S1 site near the N-terminus of the intein sequence, whereas the Ssp DnaE split-intein and the Sce VMA split-intein are split at the S0 site closer to the middle of the intein sequence. Different split sites have been noted to affect the rate constant of trans-splicing reactions. o Ssp DnaB S0 split-intein and the Ssp DnaB S1 split-intein, which were derived from the same natural intein, showed trans-splicing rate constants of (9.9 ± 0.8) × 10 −4 s −1 and (4.1 ± 0.2) × 10 −5 s −1 , respectively, 19 , 22 which differed by more than an order of magnitude. Unlike the N-cleavage rate constant discussed above, the C-cleavage rate constants of this Ssp DnaB S1 split-intein are quite comparable to the previously reported C-cleavage rate constants of (1.9 ± 0.9) × 10 −4 s −1 for the natural Ssp DnaE split-intein and (1.0–1.7) × 10 −3 s −1 for the synthetic Sce VMA split-intein, 21-23 although these split-inteins have very different amino acid sequences and very different split sites. We found that the C-cleavage rate constant could be increased by ∼10-fold by substituting the Cys1 residue to the less nucleophilic Ser residue. Although the residues at the N-terminal splice junction are not known to directly participate in Asn cyclization, it appears that even small changes in amino acid side chains at the intein N-terminus can substantially affect rearrangement of chemical bonds at the C-terminal splice junction.

Potential uses and advantages of the controllable cleavages

Advantages of intein-based protein cleavage methods, compared to others such as protease-based methods, have been noted previously, 11 and our methods using intein fragments retain many of these advantages. For example, the N-cleavage method may be used to generate an activated thioester at the C-terminus of a target protein so that the target protein can be joined with another protein or peptide having an N-terminal Cys residue, using the EPL method. 8-10 Unlike protease-based methods that cleave on the C-terminal side of specific recognition sequences, our intein-based N-cleavage method cleaves on the N-terminal side of the recognition sequence (IN) and thus allows removal of the affinity purification domain (or tag) placed on the C-terminus of the target protein. The intein-based N- and C-cleavage methods may also be used together on a single target protein to produce precise and tag-free ends at both the N- and the C-termini, or to achieve cyclization of the target protein (ligation of the N- and C-termini) using the EPL approach. We have demonstrated that the C-cleavage method can be used to generate an N-terminal Cys residue on a target protein, which is needed for EPL, although the Ssp DnaB intein is naturally followed by a Ser residue. Another advantage of these intein-based methods, unlike some protease-based methods, is that inteins are believed to pose no risk of nonspecific cleavage at unintended locations.

Compared to existing intein-based methods that use contiguous inteins, our methods using the S1 split-intein completely avoid any spontaneous cleavage during expression and purification of the precursor protein. This is a significant advantage, because spontaneous cleavages often result in lower yields of the purified protein. In previous reports using contiguous inteins, unwanted spontaneous cleavages have been observed na Vivo at various levels and could be as high as 90%. 9 In our C-cleavage method, the 11-aa IN peptide may not be overly expensive and laborious to use, due to the small size of the peptide. For example, cleavage of 100 mg of a 50 kDa-precursor protein may require as little as 20 mg of the IN peptide, if the peptide is used at ∼10-fold molar excess over the precursor protein to drive the cleavage reaction. The extra cost of 20 mg IN may easily be compensated by an increase in protein yield due to the prevention of spontaneous cleavage observed with other intein-based methods. This cost-effectiveness may be particularly true when producing high value proteins for research or pharmaceutical uses, when using more expensive producing cells (e.g. mammalian tissue culture), or when spontaneous cleavages are not tolerated. Lastly, the small IN peptide can be stably stored and easily removed from the cleaved proteins through simple dialysis.

The recombinant precursor proteins in this study had either a maltose-binding protein or a chitin-binding domain as the affinity binder for easy purification, but potentially other affinity binders such as the His-tag and the GST-tag may be used. We showed that the C-cleavage can also occur when the precursor protein is bound to chitin beads and incubated with the IN peptide therefore, this C-cleavage method may be used in a single-step purification of recombinant proteins, using a process similar to that of the IMPACT method. 5 In such a process, cell lysate containing the precursor protein is passed through an affinity column, unbound proteins are washed away, the IN peptide is added to the column to activate the C-cleavage, and the protein of interest is released (cleaved) from the column in a pure form. We have shown the feasibility of this purification strategy by preparing two recombinant proteins (thioredoxin and eGFP) in good yields (6 and 3 mg/L of culture). Our demonstration of peptide-triggered C-cleavage with various different target proteins in solution further shows that the purification approach could be a valuable tool for the preparation of recombinant proteins.

Both N- and C-cleavage reactions presented here reached efficiencies of >90% under optimal conditions, which is comparable to or higher than the cleavage efficiencies of previous methods using contiguous inteins. The N-cleavage method in this study also showed a much higher (∼95%) cleavage efficiency compared to the previously reported IMPACT method using contiguous inteins, 5 probably because the shorter IN sequence embedded in the precursor protein less likely causes protein misfolding.


Resumo

Fundo:Developments in ‘soft’ ionisation techniques have revolutionized mass-spectro-metric approaches for the analysis of protein structure. For more than a decade, such techniques have been used, in conjuction with digestion b specific proteases, to produce accurate peptide molecular weight ‘fingerprints’ of proteins. These fingerprints have commonly been used to screen known proteins, in order to detect errors of translation, to characterize post-translational modifications and to assign diulphide bonds. However, the extent to which peptide-mass information can be used alone to identify unknown sample proteins, independent of other analytical methods such as protein sequence analysis, has remained largely unexplored.

Resultados: We report here on the development of the molecular weight search (MOWSE) peptide-mass database at the SERC Daresbury Laboratory. Practical experience has shown that sample proteins can be uniquely identified from a few as three or four experimentally determined peptide masses when these are screened against a fragment database that is derived from over 50 000 proteins. Experimental errors of a few Daltons are tolerated by the scoring algorithms, thus permitting the use of inexpensive time-of-flight mass spectrometers. As with other types of physical data, such as amino-acid composition or linear sequence, peptide masses provide a set of determinants that are sufficiently discriminating to identify or match unknown sample proteins.

Conclusão: Peptide-mass fingerprints can prove as discriminating as linear peptide sequences, but can be obtained in a fraction of the time using less protein. In many cases, this allows for a rapid identification of a sample protein before committing it to protein sequence analysis. Fragment masses also provide information, at the protein level, that is complementary to the information provided by large-scale DNA sequencing or mapping projects.


MATERIAIS E MÉTODOS

Mutant Strains

All of the mutant strains of Chlamydomonas reinhardtii used in this study have been described previously (see Table 2). o oda2 allele used was pf28 (Mitchell and Rosenbaum, 1985). Cells were maintained on minimal medium using standard procedures (Harris, 1989).

Cell Cytoplasmic Extract

Chlamydomonas cells were grown in 500 ml of liquid M medium (Sager and Granick, 1953) with aeration in continuous light to a density of 10 6 cells/ml, harvested by centrifugation (550 × g for 6 min at 22°C), and resuspended in ice-cold HMDEK (10 mM HEPES, 5 mM MgSO4, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 25 mM potassium chloride, pH 7.4) to a total of 500 μl. The suspension was transferred to a 1.5-ml microfuge tube that contained an equal volume of acid-washed glass beads (1 mm) and vortexed at setting 6.5 on a Genie II vortexer for 1 min. Cell suspensions were then centrifuged using a Beckman L8 centrifuge at 48,000 ×g, at 4°C for 2 h. Supernatants were either used for immunoprecipitation as described below or mixed with 0.25 volume of 4× sample buffer (8% SDS, 40% glycerol, 125 mM Tris-HCl, pH 6.8, with Pyronin Y added as tracking dye) and β-mercaptoethanol, to a final concentration of 0.7 M, and stored at −20°C for SDS-PAGE. Pellets were resuspended in 500 μl HMDEK, mixed with 0.25 volume 4× sample buffer, and stored at −20°C for SDS-PAGE. Protein concentration was determined by the Bradford dye binding method using BSA as a standard (Bradford, 1976).

Axonemal Preparation

Axonemes were isolated by the method of Witman et al.(1978). Cells were grown in 500 ml of liquid M medium (Sager and Granick, 1953) with aeration in continuous light to a density of 10 6 cells/ml, harvested by centrifugation at 550 ×g for 6 min at 22°C, washed with 10 mM HEPES, pH 7.4, centrifuged again, and resuspended in 10 ml HMDS (10 mM HEPES, pH 7.4, 5 mM MgSO4, 1 mM DTT, and 4% sucrose). Resuspended cells were deflagellated with 400 μl 50 mM dibucaine (CIBA Pharmaceutical, CIBA-GEIGY, Summit, NJ) and diluted with 10 ml ice-cold HMDS containing 2 mM EGTA and 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, and cell bodies were removed by centrifugation at 4°C for 7 min at 1,550 ×g. The supernatant was collected and recentrifuged as above. Cell-free supernatant was then centrifuged at 31,000 ×g to pellet axonemes, which were resuspended in HMDEK and an equal volume of 2× sample buffer. β-Mercaptoethanol was added to a final concentration of 0.7 M, and samples were stored at −20°C.

SDS-PAGE and Western Blotting

Samples were prepared and run with Tris-glycine-buffer (Laemmli, 1970) in 5% stacking gels and 5, 7, or 12% separating gels (designated in text) prepared from stocks that contained 30% acrylamide and 0.4% bis-acrylamide. Broad Range protein standards (New England Biolabs, Beverly, MA) of 212, 158, 116, 97.2, 66.4, 55.6, and 42.7 kDa were used, and gels were either stained with Coomassie Blue to show total protein or transferred to immobilon membrane (Millipore, Bedford, MA) for Western blotting following the recommendations ofBurnette (1981). Gels were soaked in transfer buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 10% methanol) for 10 min and transferred either at 200 mA for 12 h (Figures 2, 3, 4A, and 5) or at 300 mA for 6 h (Figures 4B and 6). Protein standard lanes were separated from sample lanes and stained with amido black. Antibody binding and detection were performed as directed in the POD chemiluminescence kit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Briefly, transferred blots were blocked with 1% POD blocking solution for 1 h at room temperature, incubated with the primary antibody in 0.5% POD blocking solution for 3 h at room temperature, washed with TBST (50 mM Tris base, 150 mM NaCl, pH 7.5, with 0.1% Tween-20 [vol/vol]) 2 × 10 min, washed with 0.5% POD blocking solution 2 × 10 min, incubated with secondary antibody in 0.5% POD blocking solution for 1 h at room temperature, washed with TBST four times for 10 min, and then incubated with developing solution for 1 min and exposed to Biomax film (Eastman Kodak, Rochester, NY). Antigen quantitation was estimated by comparison with a blot of an antigen dilution series (2, 1, 0.8, 0.6, 0.4, 0.2, 0.1 x WT control) processed in parallel.

Fig. 2. Specificity of antibody B3B. WT andoda11 flagella, run on 5% gels and blotted to PVDF membrane, were probed with C11.6 (left panel), which detected equal levels of HCβ in both samples. A parallel blot probed with antibody B3B (right panel) detected a single band in WT flagella that is missing in flagella of HCα assembly mutant oda11. Antibodies were detected with a peroxidase-linked secondary antibody and chemiluminescent detection.

Antibodies

Anti-HCβ mAb C11.6 was concentrated by ammonium sulfate precipitation from hybridoma culture supernatants and used at a 1:100 dilution. It was generated from the same fusion as C11.13 (Mitchell and Rosenbaum, 1986). Anti-IC70 mAb 1869A ascites was used at 1:2000 dilution. Anti-IC78 mAb 1878A hybridoma culture supernatant was kindly donated by Dr. G. Witman (King et al., 1985) and was used at a 1:2 dilution. Anti-HCα polyclonal antibody B3B was produced in a rabbit by immunization with a purified bacterial fusion protein. A 1-kilobase (kb) PmlEU/HpaI fragment of HCα cDNA pBcA6 (Mitchell and Brown, 1997), which encodes amino acids 512–838 of HCα (a region unrelated to other DHC sequence and that contains the HCα EPAA repeat element), was cloned into vector pGEX-4T-2 (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) at a SmaI site and was transformed into DH5αF′ E. coli. Fusion protein expression was induced for 3 h with 0.1 mM isopropyl-β-thiogalactopyranoside at 37°C. Fusion protein was solubilized and purified by the method ofFrangioni and Neel (1993), run on an SDS-PAGE gel, transferred to nitrocellulose, and visualized with Ponceau S. Nitrocellulose strips containing the protein of interest were dissolved in dimethyl sulfoxide, mixed with adjuvant, and used for immunization. Specific antibodies were affinity purified from whole sera using Western blots of the fusion protein (Frangioni and Neel, 1993) and were used at a dilution of 1:50. Anti-HCγ mAb 25–8, kindly donated by Dr. G. Piperno (King and Witman, 1988), was used at a 1:10 dilution. Peroxidase-labeled goat anti-mouse or goat anti-rabbit secondary antibodies (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) were used at a 1:6000 dilution.

Immunoprecipitation

Cell extracts (0.5 ml) were mixed in a 15-ml conical tube with an equal volume of ice-cold immunoprecipitation (IP) buffer (HMDEK, 75 mM NaCl, 0.01% thimersol, 0.5 mM PMSF, 3% BSA, 0.1% Triton X-100, pH 7.5) and preabsorbed with 25 μl of 50/50 (vol/vol) protein A agarose in IP buffer for 30 min on ice. mAb anti-HCβ antibody C11.6 was added to preabsorbed extracts and incubated for 3–4 h at 4°C. A 100-μl volume of 50/50 (vol/vol) protein A agarose (Sigma Chemical, St. Louis, MO) in IP buffer was added, and the tubes were mixed gently for 1 h. Agarose beads were washed three times with IP buffer containing 0.05% Triton X-100. Immune complexes were eluted by addition of 2× sample buffer containing 0.7 M β-mercaptoethanol and incubation for 2 min in boiling water. The quantity of HCβ immunoprecipitated with antibody C11.6 from wild-type andoda mutant cytoplasmic extracts was determined from preliminary Western blots. Subsequent loads of immunoprecipitate samples were adjusted to include equal amounts of HCβ.

Partial Acid Hydrolysis

Western blots of proteins subjected to partial acid hydrolysis were generated by a modification of the method described by Clevelandet al. (1977). Briefly, cytoplasmic extracts or whole axonemes were run on an SDS-PAGE gel along with molecular weight markers. The gel was stained in 0.1% Coomassie blue, 50% methanol, and 10% acetic acid for 30 min and destained in 5% methanol and 10% acetic acid for 45 min. Bands of ∼70 kDa molecular mass were cut from the gel and soaked 30 min in 0.125 M Tris/HCl, pH 6.8, 0.1% SDS, 1 mM EDTA. Slices were then lyophilized and either stored frozen at −20°C (controls) or incubated with 70% formic acid for 16 h at 37°C, washed with 50% methanol, and lyophilized. Gel slices were then rehydrated with buffer (1% SDS, 10 mM Tris/HCl, pH 8, 0.1% β-mercaptoethanol, and 10% glycerol) for 6 h, pushed into the bottom of an SDS-PAGE well, and overlayed with 10 μl of Tris/HCl buffer containing 20% glycerol for electrophoresis and transfer to PVDF membranes.


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Este texto é baseado em Openstax Biology for AP Courses, Autores contribuintes sênior Julianne Zedalis, The Bishop's School em La Jolla, CA, John Eggebrecht, Cornell University Autores contribuintes Yael Avissar, Rhode Island College, Jung Choi, Georgia Institute of Technology, Jean DeSaix , University of North Carolina em Chapel Hill, Vladimir Jurukovski, Suffolk County Community College, Connie Rye, East Mississippi Community College, Robert Wise, University of Wisconsin, Oshkosh

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