Em formação

GPCRs codificados espacialmente?


Estou lendo este artigo e já estou perdido em termos do que eles querem dizer com sinalização GPCR codificada espacialmente.

O tráfego de receptores acoplados à proteína G (GPCRs) é uma das áreas mais interessantes da biologia celular devido aos avanços recentes que demonstram que a sinalização de GPCR é codificado espacialmente.


Alguns GPCRs parecem regular sua própria taxa endocítica por meio da modulação da maturação do caroço revestido de clatrina (CCP ).12-14 Essa regulação, que pode diferir entre os ligantes que atuam no mesmo GPCR, é um método adicional pelo qual a sinalização do GPCR pode ser codificado espacialmente.

Como a sinalização pode ser codificada espacialmente?


Como a sinalização (GPCR) pode ser codificada espacialmente?

Explicação sucinta: durante a endocitose, o receptor acoplado à proteína G pode ser restrito espacialmente.

Seu artigo se refere a: "Cumprindo a promessa de agonismo do receptor acoplado à proteína G" tendencioso ", por Luttrell LM, Maudsley S e Bohn LM, em Mol Pharmacol. 2015; 88 (3): 579-588. https://doi.org/10.1124/mol.115.099630.

Resumo: O fato de que mais de 30% dos produtos farmacêuticos atuais têm como alvo os receptores acoplados à proteína G heptaélica (GPCRs) atesta sua tratabilidade como alvos de drogas. Embora o desenvolvimento de drogas GPCR tenha tradicionalmente focado em agonistas e antagonistas convencionais, a crescente apreciação de que GPCRs medeiam efeitos fisiologicamente relevantes via proteína G e efetores de proteína não G estimulou a busca por ligantes que podem "desviar" a sinalização a jusante em favor de um ou o outro processo. Ligantes polarizados são novas entidades com perfis de sinalização distintos ditados pela estrutura do ligante, e a perspectiva potencial de ligantes polarizados como melhores drogas foi proclamada pleonasticamente. De fato, estudos pré-clínicos de prova de conceito demonstraram que tanto a proteína G quanto os ligantes seletivos para a via da arrestina podem promover efeitos benéficos in vivo ao mesmo tempo que antagonizam os deletérios. Mas, junto com a oportunidade, vem a complexidade adicional e novos desafios para a descoberta de medicamentos. Se os ligantes podem ser enviesados, a classificação do ligante torna-se dependente do ensaio, e abordagens de triagem mais diferenciadas são necessárias para capturar a eficácia do ligante em várias dimensões de sinalização. Além disso, porque o repertório de sinalização de ligantes tendenciosos difere daquele do agonista nativo, respostas imprevistas podem surgir in vivo à medida que esses sinais desequilibrados se propagam. "

Uma explicação relativamente simples é oferecida em outro artigo: "Polarização temporal: Sinalização GPCR dinâmica codificada por tempo", por Manuel Grundmann e Evi Kostenis DOI: https://doi.org/10.1016/j.tips.2017.09.004:

“A noção de que a informação não é apenas codificada pela química dos componentes de sinalização, mas também por sua ocorrência espacial e temporal, deu origem ao termo de 'sinalização espaço-temporal' $^{[3]}$. A transdução de sinal pode, portanto, ser categorizada em pelo menos três dimensões, (i) qualidade (quais substâncias participam), (ii) espaço (onde o evento ocorre) e (iii) tempo (quando o evento ocorre). A interação entre essas dimensões será doravante designada como 'sinalização dinâmica' ou 'dinâmica de sinalização'. A sinalização dinâmica está profundamente enraizada na transdução de sinal GPCR, pois um número crescente de relatórios nos fornece um vislumbre dos aspectos espaço-temporais da função do receptor $^{[4, 5, 6, 7, 8, 9, 10]}$.".

[3]Kholodenko B.N. et al. Balé de sinalização no espaço e no tempo. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010; 11: 414-426

[4]Irannejad R. Seletividade funcional da ação da droga dirigida por GPCR através do viés de localização. FASEB J. 2017; 31 (664,2)

[5]Mullershausen F. et al. A sinalização persistente induzida por FTY720-fosfato é mediada por receptores S1P1 internalizados. Nat. Chem. Biol. 2009; 5: 428-434

[6]Irannejad R. et al. Os biossensores conformacionais revelam a sinalização GPCR dos endossomos. Natureza. 2013; 495: 534-538

[7]Eichel K. et al. A β-arrestina conduz a sinalização da quinase MAP de estruturas revestidas com clatrina após a dissociação de GPCR. Nat. Cell Biol. 2016; 18: 303-310.

[8]Thomsen A.R. et al. O supercomplexo GPCR-G da proteína-β-arrestina medeia a sinalização sustentada da proteína G. Célula. 2016; 166: 907-919

[9]Jean-Alphonse F.G. et al. Controle do receptor β2-adrenérgico da sinalização do receptor PTH endossômico via Gβγ. Nat. Chem. Biol. 2016; 13: 259-261

[10]A localização do receptor opioide μ na membrana plasmática controla a sinalização espaço-temporal. Sci. Sinal. 2016; 9: ra16

Ver: "Codificação espacial da sinalização GPCR no sistema nervoso", de Zara Y Weinberg, Stephanie E Crilly e Manojkumar A Puthenveedu, DOI: https://doi.org/10.1016/j.ceb.2018.12.006:

"Vários GPCRs, incluindo receptores que se pensava que sinalizavam principalmente a partir da superfície celular, foram recentemente mostrados para sinalizar de muitos compartimentos intracelulares. Isso levanta a ideia de que a sinalização por qualquer receptor é codificada espacialmente na célula, com locais distintos de origem do sinal ditando consequências distintas a jusante. ".

Durante a endocitose, o receptor acoplado à proteína G pode ser restrito espacialmente.

Veja: "Resolução espacial de sinalização cAMP por adenilil ciclase solúvel", por Giusi Caldieri e Sara Sigismund DOI: https://doi.org/10.1083/jcb.201606123 que oferece uma imagem fácil de entender:

Figura 1. Controle espacial e temporal da sinalização GPCR por ACs. Nos neurônios do hipocampo, o CRHR1, ao se ligar ao agonista CRH, ativa o complexo de proteína G trimérica, composto pelas subunidades α, β e γ. A subunidade Gα estimuladora é liberada e ativa a produção de tmAC e cAMP (Irannejad e von Zastrow, 2014). Em paralelo, GPCR ativado também pode induzir Ca local$^{2+}$ liberação que ativa o sAC, seguido por um aumento nos níveis de cAMP (Inda et al., 2016). (1) Essas duas fontes de cAMP no PM contribuem para a fase inicial de ativação de ERK por meio dos efetores da proteína quinase A (PKA) e EPACs (Inda et al., 2016). Os GPCRs ativados, uma vez liberados das proteínas G, são fosforilados e recrutam β-arrestina (β-ARR) para serem internalizados por meio de poços revestidos de clatrina (CCPs; Irannejad e von Zastrow, 2014). (2) Na estação endossômica, os GPCRs ativam o sAC para desencadear uma segunda onda de produção de cAMP e para sustentar a sinalização de Erk de uma forma dependente de EPAC. A ativação de sAC no PM e nos endossomos requer Ca$^{2+}$ e bicarbonato (não representado para simplificar; Inda et al., 2016). A cascata de sinalização que leva ao Ca$^{2+}$ e liberação de bicarbonato (particularmente na estação endossômica) e o mecanismo de ação exato da sAC não estão completamente caracterizados. As diferentes formas de ACs e os gradientes de cAMP correspondentes gerados por eles são representados em cores diferentes para destacar suas diferentes funções. Se essa especificidade reflete diferentes isoformas e / ou regulação ainda precisa ser esclarecido.

"O trabalho relatado por Inda et al. Nesta edição integra e expande nosso conhecimento emergente da sinalização GPCR localizada no nível endossomal. Em um trabalho anterior, esses autores mostraram que a ativação de Erk pela sinalização do receptor 1 do hormônio liberador de corticotropina (CRHR1) é bifásico, com uma resposta precoce originada do PM e uma resposta tardia dependente de endocitose (Bonfiglio et al., 2013). Em seu novo trabalho, Inda et al. (2016) reforçam esses achados, mostrando que fontes distintas de cAMP são diferencialmente envolvido nas duas fases da sinalização Erk. Enquanto tmAC e sAC contribuem para a resposta de sinalização Erk aguda, o sAC está especificamente envolvido na fase "endocítica" sustentada da sinalização Erk nas células neuronais do hipocampo (Fig. 1). ".

Observe que as fases 1 e 2, visando uma fase ou outra, em vez de ação contínua, são codificadas espacialmente.


Gα s sinalização no desenvolvimento esquelético, homeostase e doenças

O desenvolvimento do esqueleto é perfeitamente controlado tanto espacial quanto temporalmente por redes de sinalização celular. Gαs é a subunidade α estimuladora em um complexo heterotrimérico de proteína G que transduz a sinalização de receptores acoplados à proteína G (GPCRs), responsável por controlar o desenvolvimento esquelético e a homeostase. Gαs, codificado pelo gene GNAS em humanos, desempenha papéis críticos no desenvolvimento e homeostase do esqueleto, regulando o comprometimento, a diferenciação e a maturação das células do esqueleto. GαsA sinalização mediada interage com as vias de sinalização Wnt e Hedgehog, ambos reguladores cruciais do desenvolvimento esquelético, remodelação e reparação de lesões. Mutações genéticas que interrompem Gαs funções causam distúrbios humanos com defeitos esqueléticos graves, como displasia fibrosa do osso e formação óssea heterotópica. Este capítulo enfoca os papéis cruciais do Gαs sinalização durante o desenvolvimento esquelético e homeostase, e os mecanismos patológicos subjacentes às doenças esqueléticas causadas por mutações GNAS.

Palavras-chave: BMSC Fibrodisplasia óssea de condrócitos GNAS Gα (s) Hedgehog sinalização Ossificação heterotópica Hipertrofia Ossificação intramembranosa Síndrome de McCune-Albright Osteoblasto Osteoclast PKA Heteroplasia óssea progressiva Wnt sinalização cAMP.


Químicos desenvolvem uma nova estratégia de descoberta de drogas para alvos de drogas "não-remédios"

Uma equipe de pesquisa liderada pelo Dr. Xiaoyu LI da Divisão de Pesquisa de Química da Faculdade de Ciências, em colaboração com o Professor Yizhou LI da Escola de Ciências Farmacêuticas da Universidade de Chongqing e o Professor Yan CAO da Escola de Farmácia da Segunda Universidade Médica Militar de Xangai desenvolveu um novo método de descoberta de drogas visando proteínas de membrana em células vivas.

As proteínas de membrana desempenham papéis importantes na biologia, e muitas delas são alvos de alto valor que estão sendo intensamente perseguidos na indústria farmacêutica. O método desenvolvido pela equipe do Dr. Li fornece uma maneira eficiente de descobrir novos ligantes e inibidores contra proteínas de membrana, que permanecem em grande parte intratáveis ​​para as abordagens tradicionais. O desenvolvimento da metodologia e suas aplicações estão agora publicados em Química da Natureza.

As proteínas da membrana na superfície celular desempenham uma miríade de funções biológicas que são vitais para a sobrevivência das células e dos organismos. Não surpreendentemente, numerosas doenças humanas estão associadas a funções aberrantes de proteínas de membrana. Na verdade, as proteínas de membrana respondem por mais de 60% dos alvos de todos os medicamentos de pequenas moléculas aprovados pelo FDA. A superfamília do receptor acoplado à proteína G (GPCR) sozinha, como a maior classe de receptores de superfície celular, são os alvos de

34% de todos os medicamentos clínicos. No entanto, apesar da importância, a descoberta de drogas contra proteínas de membrana é notoriamente desafiadora, principalmente devido à propriedade especial de seu habitat natural: a membrana celular. Além disso, proteínas de membrana também são difíceis de estudar de forma isolada, pois tendem a perder característica celular essencial e podem ser desativadas. Na verdade, as proteínas de membrana há muito tempo são consideradas um tipo de alvos "impossíveis de serem remediados" na indústria farmacêutica.

Nos últimos anos, a biblioteca química codificada por DNA (DEL) surgiu e se tornou uma poderosa tecnologia de triagem de drogas. Para simplificar, podemos usar uma biblioteca de livros como exemplo. Em uma biblioteca, cada livro é indexado com um número de catálogo e codificado espacialmente com uma localização específica em uma estante. Analogamente, em um DEL, cada composto químico é anexado a uma etiqueta de DNA única, que serve como o "número de catálogo" registrando as informações estruturais do composto. Com a codificação de DNA, todos os compostos da biblioteca podem ser misturados e rastreados contra o alvo simultaneamente para descobrir aqueles que podem modular as funções biológicas do alvo, e. inibir as proteínas que são aberrantemente ativas em cânceres malignos. DELs podem conter números surpreendentemente grandes de compostos de teste (bilhões ou mesmo trilhões), e a triagem DEL pode ser conduzida em apenas algumas horas em um laboratório de química regular. Hoje, DEL foi amplamente adotado por quase todas as principais indústrias farmacêuticas em todo o mundo. No entanto, DEL também encontrou dificuldades significativas em interrogar proteínas de membrana em células vivas.

2 Principais descobertas: Rastreamento e otimização

Existem dois obstáculos que a equipe superou para permitir a aplicação de DEL em células vivas. Primeiro, a superfície da célula não tem uma forma convexa lisa como um balão, é extremamente complexa com centenas de biomoléculas diferentes com uma topologia acidentada, portanto, localizar o alvo desejado na superfície das células é como encontrar uma única árvore em uma densa floresta tropical. A equipe superou esse problema de "especificidade do alvo" usando um método que eles desenvolveram anteriormente: marcação por afinidade programada por DNA (DPAL). Este método utiliza um sistema de sonda baseado em DNA que pode fornecer especificamente uma etiqueta de DNA para a proteína desejada em células vivas, e a etiqueta de DNA serve como um farol para direcionar a triagem DEL específica do alvo. Em outras palavras, a equipe primeiro instalou um "rastreador" no alvo para atingir a especificidade da triagem.

O segundo desafio é a abundância de destino. Normalmente, as proteínas de membrana existem em concentração nanomolar a micromolar baixa, que está muito abaixo da alta concentração micromolar necessária para capturar a pequena fração de ligantes entre bilhões de não-ligantes em uma biblioteca. Para resolver este problema, a equipe empregou uma nova estratégia usando sequências complementares na etiqueta de DNA na proteína alvo e na biblioteca real, de modo que a biblioteca possa hibridizar perto do alvo, "aumentando" assim a concentração efetiva da proteína alvo . Em outras palavras, o "rastreador" pode não apenas ajudar a biblioteca a localizar o alvo, mas também criar uma força atrativa para concentrar a biblioteca ao redor do alvo, não sendo distraída pela população não vinculante.

Na publicação, a equipe relata o desenvolvimento de sua metodologia detalhada e também demonstra a generalidade e o desempenho deste método ao rastrear uma biblioteca de 30,42 milhões de compostos contra o receptor de folato (FR), anidrase carbônica 12 (CA-12) e epidérmico receptor do fator de crescimento (EGFR) em células vivas, todos são alvos importantes na descoberta de drogas anticâncer. Espera-se que esta abordagem seja amplamente aplicável a muitas proteínas de membrana. Por exemplo, alvos clássicos de drogas, como GPCRs e canais iônicos, podem ser revisitados em um ambiente de célula viva para identificar novas oportunidades de descoberta de drogas, aproveitando o poder de DEL.

"Esperamos que a utilidade deste método não se limite à descoberta de drogas, mas também na pesquisa acadêmica para explorar sistemas biológicos desafiadores, como complexos de proteínas de membrana oligomérica e comunicações célula-célula", disse o Dr. Xiaoyu Li.

O co-autor correspondente, Professor Yizhou Li, da Universidade de Chongqing, disse: "Este método tem o potencial de facilitar a descoberta de drogas para proteínas de membrana com o poder de grande e complexa diversidade química de bibliotecas químicas codificadas por DNA." O co-autor do co-autor, o professor Yan Cao, da Second Military Medical University em Xangai, acrescentou: "Esta tecnologia é uma ferramenta eficaz para caracterizar a interação ligante-alvo que lançará uma nova luz sobre o desenvolvimento de métodos de triagem de alto rendimento e, assim, facilitará a pesca de ligantes direcionar proteínas de membrana. "


Reconhecimentos

Agradecemos a J. Tesmer pela assistência na preparação da Tabela Suplementar 1. Este trabalho foi financiado pelo Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália (NHMRC) (Programa Grant número APP1055134). D.M.T. e A.G. são bolsistas do prêmio Australian Research Council Discovery Early Career Research, P.M.S. é um pesquisador principal do NHMRC e A.C. é um pesquisador principal sênior do NHMRC.

Informação do revisor

Natureza agradece A. Jazayeri, R. Lefkowitz e A. Manglik por sua contribuição para a revisão por pares deste trabalho.


Químicos e colaboradores desenvolvem uma nova estratégia de descoberta de drogas para alvos de drogas "impossíveis de serem tratadas"

Ilustração gráfica do trabalho: a marcação por afinidade programada por DNA (DPAL) permite a triagem direta de bibliotecas químicas codificadas por DNA (DELs) contra alvos de proteínas de membrana em células vivas para criar novas oportunidades de descoberta de drogas.

Uma equipe de pesquisa liderada pelo Dr. Xiaoyu Li da Divisão de Pesquisa de Química da Faculdade de Ciências, em colaboração com o Professor Yizhou Li da Escola de Ciências Farmacêuticas da Universidade de Chongqing e o Professor Yan Cao da Escola de Farmácia da Segunda Universidade Médica Militar de Xangai, desenvolveu um novo método de descoberta de drogas visando proteínas de membrana em células vivas.

As proteínas de membrana desempenham papéis importantes na biologia e muitas delas são alvos de alto valor que estão sendo intensamente perseguidos na indústria farmacêutica. O método desenvolvido pela equipe do Dr. Li fornece uma maneira eficiente de descobrir novos ligantes e inibidores contra proteínas de membrana, que permanecem em grande parte intratáveis ​​para as abordagens tradicionais. O desenvolvimento da metodologia e suas aplicações estão agora publicados emQuímica da Natureza, um prestigioso jornal de química da Natureza Publishing Group (NPG).

As proteínas da membrana na superfície celular desempenham uma miríade de funções biológicas que são vitais para a sobrevivência das células e dos organismos. Não surpreendentemente, numerosas doenças humanas estão associadas a funções aberrantes de proteínas de membrana. Na verdade, as proteínas de membrana respondem por mais de 60% dos alvos de todos os medicamentos de pequenas moléculas aprovados pelo FDA. A superfamília do receptor acoplado à proteína G (GPCR) sozinha, como a maior classe de receptores de superfície celular, são os alvos de

34% de todos os medicamentos clínicos. No entanto, apesar da importância, a descoberta de drogas contra proteínas de membrana é notoriamente desafiadora, principalmente devido à propriedade especial de seu habitat natural: a membrana celular. Além disso, proteínas de membrana também são difíceis de estudar de forma isolada, pois tendem a perder característica celular essencial e podem ser desativadas. Na verdade, as proteínas de membrana há muito tempo são consideradas um tipo de alvos "impossíveis de serem remediados" na indústria farmacêutica.

Nos últimos anos, a biblioteca química codificada por DNA (DEL) surgiu e se tornou uma poderosa tecnologia de triagem de drogas. Para simplificar, podemos usar uma biblioteca de livros como exemplo. Em uma biblioteca, cada livro é indexado com um número de catálogo e codificado espacialmente com uma localização específica em uma estante. Analogamente, em um DEL, cada composto químico é anexado a uma etiqueta de DNA única, que serve como o "número de catálogo" registrando as informações estruturais do composto. Com a codificação de DNA, todos os compostos da biblioteca podem ser misturados e rastreados contra o alvo simultaneamente para descobrir aqueles que podem modular as funções biológicas do alvo, e. inibir as proteínas que são aberrantemente ativas em cânceres malignos. DELs podem conter números surpreendentemente grandes de compostos de teste (bilhões ou mesmo trilhões), e a triagem DEL pode ser conduzida em apenas algumas horas em um laboratório de química regular. Hoje, o DEL foi amplamente adotado por quase todas as principais indústrias farmacêuticas em todo o mundo. No entanto, DEL também encontrou dificuldades significativas em interrogar proteínas de membrana em células vivas.

2 Principais descobertas: Rastreamento e otimização

Existem dois obstáculos que a equipe superou para permitir a aplicação de DEL em células vivas. Primeiro, a superfície da célula não tem uma forma convexa lisa como um balão, é extremamente complexa com centenas de biomoléculas diferentes com uma topologia acidentada, portanto, localizar o alvo desejado na superfície das células é como encontrar uma única árvore em uma densa floresta tropical. A equipe superou esse problema de "especificidade do alvo" usando um método desenvolvido anteriormente: marcação por afinidade programada por DNA (DPAL). Este método utiliza um sistema de sonda baseado em DNA que pode entregar especificamente uma etiqueta de DNA para a proteína desejada em células vivas, e a etiqueta de DNA serve como um farol para direcionar a triagem DEL específica do alvo. Em outras palavras, a equipe primeiro instalou um "rastreador" no alvo para atingir a especificidade da triagem.

O segundo desafio é a abundância de destino. Normalmente, as proteínas de membrana existem em concentração nanomolar a micromolar baixa, que está muito abaixo da alta concentração micromolar necessária para capturar a pequena fração de ligantes entre bilhões de não-ligantes em uma biblioteca. Para resolver este problema, a equipe empregou uma nova estratégia usando sequências complementares na etiqueta de DNA na proteína alvo e na biblioteca real, de modo que a biblioteca possa hibridizar perto do alvo, "aumentando" assim a concentração efetiva da proteína alvo . Em outras palavras, o "rastreador" pode não apenas ajudar a biblioteca a localizar o alvo, mas também criar uma força atrativa para concentrar a biblioteca ao redor do alvo, não sendo distraída pela população não vinculante.

Na publicação, a equipe relata o desenvolvimento de sua metodologia detalhada e também demonstra a generalidade e o desempenho deste método ao rastrear uma biblioteca de 30,42 milhões de compostos contra o receptor de folato (FR), anidrase carbônica 12 (CA-12) e epidérmico receptor do fator de crescimento (EGFR) em células vivas, todos são alvos importantes na descoberta de drogas anticâncer. Espera-se que esta abordagem seja amplamente aplicável a muitas proteínas de membrana. Por exemplo, alvos clássicos de drogas, como GPCRs e canais iônicos, podem ser revisitados em um ambiente de célula viva para identificar novas oportunidades de descoberta de drogas, aproveitando o poder de DEL.

"Esperamos que a utilidade deste método não se limite à descoberta de drogas, mas também na pesquisa acadêmica para explorar sistemas biológicos desafiadores, como complexos de proteínas de membrana oligomérica e comunicações célula-célula", disse o Dr. Xiaoyu Li.

O co-autor correspondente, Professor Yizhou Li, da Universidade de Chongqing, disse: "Este método tem o potencial de facilitar a descoberta de drogas para proteínas de membrana com o poder de grande e complexa diversidade química de bibliotecas de produtos químicos codificados por DNA." O co-autor correspondente, Professor Yan Cao, da Second Military Medical University em Xangai, acrescentou: "Esta tecnologia é uma ferramenta eficaz para caracterizar a interação ligante-alvo que lançará uma nova luz sobre o desenvolvimento de métodos de triagem de alto rendimento e, assim, facilitará a pesca de ligantes direcionar proteínas de membrana. "


Opções de acesso

Obtenha acesso completo ao diário por 1 ano

Todos os preços são preços NET.
O IVA será adicionado mais tarde no check-out.
O cálculo do imposto será finalizado durante o checkout.

Obtenha acesso limitado por tempo ou ao artigo completo no ReadCube.

Todos os preços são preços NET.


Introdução

A visão clássica da sinalização da proteína G começa com um estímulo extracelular. Uma ampla gama de moléculas, incluindo fótons, átomos individuais (por exemplo. prótons e cálcio), odores, aminas biogênicas (por exemplo. epinefrina e dopamina), fosfolipídios, hormônios glicoproteicos e até enzimas (por exemplo. trombina), são detectados por receptores acoplados à proteína G. Uma vez ativados, esses receptores envolvem um heterotrímero de proteína G ou, em alguns casos, & # x003b2-arrestinas. As proteínas G trocam GDP por GTP e as subunidades dissociadas & # x003b1 e & # x003b2 / & # x003b3 iniciam processos bioquímicos dentro da célula, mais classicamente a produção de segundos mensageiros, como cAMP.

O Journal of Biological Chemistry tem uma rica tradição de publicação de artigos sobre GPCRs, proteínas 2 G e seus reguladores. Por exemplo, as proteínas RGS (reguladores da sinalização da proteína G) aceleram a hidrólise do GTP e, portanto, atuam em oposição aos receptores para limitar a transdução do sinal. Grande parte desta literatura tem se concentrado em aspectos mecanísticos da função ou modificação da proteína G, com menos atenção ao movimento e distribuição das proteínas componentes dentro da célula. Dado que a maioria dos hormônios e neurotransmissores não consegue atravessar a membrana plasmática, parecia natural supor que os receptores e as proteínas G também devessem residir na membrana plasmática para funcionar. Acreditava-se que as proteínas localizadas em outros lugares estivessem em trânsito, de ou para seu local de ação primário. No entanto, há muito se sabe que pelo menos uma família de GPCRs, os receptores de luz epitomizados pela rodopsina, não estão na superfície da célula, mas estão densamente compactados dentro de & # x0201cdiscs ovais & # x0201d dentro das células de bastonete e cone da retina . Assim, pelo menos alguns receptores acoplados à proteína G atuam principalmente de dentro da célula. Essa visualização foi expandida por descobertas recentes que são o foco desta série de minirevisão. Os artigos contribuídos são de três laboratórios líderes que são pioneiros em seus respectivos campos.

A primeira minirevisão da série é de Terri Clister, Sohum Mehta e Jin Zhang (1). Este artigo começa com um bom resumo da sinalização da proteína G, incluindo novos insights sobre como a função da proteína G é regulada no espaço e no tempo. Muito do trabalho que eles descrevem se beneficiou do desenvolvimento de biossensores sensíveis e versáteis. Em geral, consistem em proteínas ou fragmentos de proteínas que emitem um sinal óptico (geralmente fluorescente) com base nas mudanças na atividade bioquímica. Quando esses biossensores são combinados com microscopia de alta resolução, eles podem revelar informações espaciais e temporais altamente detalhadas sobre mudanças moleculares dentro da célula, como ocorre quando uma célula se move em direção a um estímulo gradiente. Essas ferramentas fornecem informações que muitas vezes são perdidas nos dados agregados da análise bioquímica e começaram a revelar variações dramáticas de célula para célula na resposta aos estímulos. Os autores descrevem o projeto atual do biossensor e fornecem exemplos específicos de biossensores sendo usados ​​para monitorar a ativação do receptor e da proteína G (ou arrestina), a translocação de e para a membrana plasmática e a produção localizada de segundos mensageiros químicos. Finalmente, eles discutem novos esforços para manipular processos celulares, por exemplo, usando GPCRs ativados por luz para direcionar a ativação da proteína G dentro de um segmento estreito de uma célula. A capacidade de medir e ativar localmente a sinalização da proteína G certamente avançará nossa compreensão dos gradientes de sinalização celular, tanto fora quanto dentro da célula.

O segundo artigo da série foi escrito por Nikoleta G. Tsvetanova, Roshanak Irannejad e Mark von Zastrow (2). Esses autores se concentram no tráfego de GPCR e proteína G para o compartimento endossômico. Eles delineiam um mecanismo pelo qual a internalização de receptores ativados leva a uma & # x0201segunda onda & # x0201d de sinalização da proteína G dos endossomos. Estudos genéticos mais antigos em leveduras, bem como estudos farmacológicos em cultura de células de mamíferos, indicaram um papel para pools de endomembrana de proteínas G ativadas. A evidência direta da ativação do GPCR e da proteína G nos endossomos vem de um trabalho recente do grupo de von Zastrow. Eles adaptaram fragmentos de anticorpo de domínio único, originalmente desenvolvidos para estabilizar GPCRs ativados e proteínas G para fins de cristalografia de raios-X, como biossensores geneticamente codificados. Quando esses fragmentos foram usados ​​em conjunto com imagens de fluorescência de células vivas, esses pesquisadores notaram duas ondas de ativação, uma na membrana plasmática e uma segunda, mais sustentada, onda nos endossomos. Essas ondas de ativação de proteínas se correlacionam com as ondas de produção de segundo mensageiro e essas duas leituras exibem sensibilidades semelhantes aos inibidores endocíticos e à abstinência de agonistas. Essas descobertas desafiam as visões de longa data que equiparam a endocitose do receptor à dessensibilização. Dado que muitos processos fisiológicos dependem do momento e da localização dos sinais intracelulares, a compreensão desses processos é de suma importância em fisiologia e farmacologia.

O terceiro artigo é de Mikel Garcia-Marcos, Pradipta Ghosh e Marilyn G. Farquhar (3). Esses autores se concentram nas novas funções do GIV (também conhecido como Girdin), um de um grupo em expansão de proteínas que ativam as proteínas G, mas que não estão localizadas na membrana plasmática e não se assemelham aos GPCRs típicos. O GIV é predominantemente encontrado nas membranas internas, ao invés da membrana plasmática, e é ativado por tirosina quinases receptoras, ao invés de GPCRs. Embora os detalhes mecanísticos ainda estejam sendo elucidados, existem dados genéticos convincentes para indicar um papel importante para o GIV na migração celular e na progressão da metástase do câncer, bem como nefrose e fibrose hepática.

O que essas descobertas significam para os químicos biológicos? Dada a longa história dos GPCRs, bem como das tirosina quinases receptoras, como alvos de drogas, há uma forte justificativa para investigar ativadores não receptores como alvos potenciais de drogas também. Na verdade, os esforços anteriores de descoberta de medicamentos foram baseados em opiniões antigas que podem não ser mais inteiramente válidas. Com evidências emergentes de ativadores de proteínas G que não são receptores, e que nem mesmo estão na membrana plasmática, talvez possamos esperar uma & # x0201segunda onda & # x0201d de descobertas relacionadas à proteína G nas páginas do Journal of Biological Química.


Exemplo 4: Adaptando o Ensaio a uma Amostra Biológica

Um modelo de RNA de controle é imobilizado em um suporte sólido para criar um sistema artificial. O ensaio é realizado usando T4 DNA ligase, que pode reparar cortes em híbridos de DNA / RNA. Os ensaios são realizados em lâminas correspondentes ou seções diferentes da mesma lâmina, onde em um caso o gDNA é analisado e no outro o RNA é analisado. Ao testar o gDNA, a lâmina pode ser pré-tratada com RNase e, ao testar o RNA, a lâmina é pré-tratada com DNase. Os resultados do ensaio são confirmados pela extração de gDNA ou RNA e quantificação das quantidades relativas por qPCR ou RT-qPCR, respectivamente.

A fim de tornar os ensaios de RNA de seção de tecido tão informativos quanto possível, informações pré-existentes sobre os níveis de expressão em tecidos específicos para transcritos alvo em uma gama de abundâncias são usadas no projeto do ensaio. Ambos os transcritos de alta abundância, bem como alguns transcritos de média e baixa abundância, são direcionados para permitir uma avaliação inicial das características quantitativas de desempenho do ensaio.


Assista o vídeo: Common cell signaling pathway (Janeiro 2022).