Em formação

Reversão de reticulação em ChIP-seq


A imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é um tipo de técnica experimental de imunoprecipitação usada para investigar a interação entre proteínas e DNA na célula. Um resumo do protocolo para ChIP está aqui. Resumidamente, as etapas são:

  1. O DNA e as proteínas associadas na cromatina em células ou tecidos vivos são reticulados;
  2. Os complexos DNA-proteína são fragmentados em fragmentos de DNA de ~ 500 bp por sonicação ou digestão com nuclease;
  3. Os fragmentos de DNA reticulados associados com a (s) proteína (s) de interesse são imunoprecipitados seletivamente a partir dos detritos celulares usando um anticorpo específico de proteína apropriado;
  4. Os fragmentos de DNA associados são purificados e sua sequência determinada.

Após a etapa 3 (imunoprecipitação do complexo proteína-DNA), é meu entendimento que a ligação cruzada proteína-DNA é revertida e as proteínas são removidas por digestão com proteinase K.

Alguém pode me dizer se durante esta etapa o DNA no local da reticulação é incluído na etapa de sequenciamento posterior ou é lavado com a própria proteína?


Após a etapa de reversão da ligação cruzada, você ainda tem algum DNA conectado a fragmentos de proteínas.

Então, nessa etapa, em vez de fazer uma purificação normal de DNA, também precisamos usar uma extração de fenol-clorofórmio ou colunas especiais para separar o DNA dos fragmentos de proteína.

O termofisher também costuma dar boas explicações.

Por favor, me avise se eu não entendi a pergunta corretamente! :)


Reticulação reversa no kit Active Motif - apenas 15 minutos? - (08 / mar / 2010)

I & # 39m usando o kit magnético Active Motif ChIP-IT Express para experimentos de ChIP. O protocolo diz que a reticulação reversa é feita a 95 ° C por 15 minutos ou 65 ° C por 2,5 horas, seguido por tratamento com Proteinase K a 37 ° C por 1 hora. No entanto, eu li a maioria dos protocolos em outros lugares que dizem qualquer coisa entre 4-6 horas ou durante a noite a 65 C para reticulação reversa. Alguém sabe se este protocolo está correto ou devo simplesmente ignorá-lo e fazer um cross-linking reverso mais longo? Tive alguns resultados de PCR estranhos e pensei que talvez a reversão incompleta das ligações cruzadas pudesse ser um problema. Obrigado.

Invertemos o X-link por 15 minutos a 95 graus ou 5 horas a 65. Não vejo diferença com nenhum dos métodos. Não tenho certeza sobre apenas 2,5h às 65 - isso pode não ser suficiente. Quando vejo resultados estranhos em meus PCRs, embora geralmente seja devido à presença de inibidores na amostra - diluir 1/10 ajuda.

annabellak em 9 de março de 2010, 12 & # 5848 AM disse:

Você pode me dizer quais inibidores de proteinase você usa e em que concentração?
Estou usando o kit ActiveMotif também e faço 5ul de PIC e PMSF para 1ml.

ezz em 19 de março de 2010, 02 & # 5827 PM disse:

annabellak em 9 de março de 2010, 12 & # 5848 AM disse:

Você pode me dizer quais inibidores de proteinase você usa e em que concentração?
Estou usando o kit ActiveMotif também e faço 5ul de PIC e PMSF para 1ml.

Apenas uma atualização rápida sobre isso para qualquer pessoa que possa estar fazendo um cross-linking reverso de 15 min @ 95 C:

Realizamos reticulação reversa de amostras de entrada (cromatina cisalhada) a 95 C por 15 minutos e 65 C por 2, 4 e 6 horas. Isso foi analisado por qPCR e, embora não tenha havido diferença entre as amostras de 65 ° C, todas elas tinham Cts aproximadamente um ciclo menor do que a amostra de 95 ° C. Tendo em mente que se tratava apenas da amostra de entrada, este efeito pode ser diferente no DNA do chip.

De agora em diante, estarei fazendo pelo menos um tratamento de 2 horas a 65 C.

jamessmith01 em 24 de março de 2010, 08 e # 5850 AM disse:

Apenas uma atualização rápida sobre isso para qualquer pessoa que possa estar fazendo um cross-linking reverso de 15 min @ 95 C:

Realizamos reticulação reversa de amostras de entrada (cromatina cisalhada) a 95 C por 15 minutos e 65 C por 2, 4 e 6 horas. Isso foi analisado por qPCR e, embora não tenha havido diferença entre as amostras de 65 ° C, todas elas tinham Cts aproximadamente um ciclo menor do que a amostra de 95 ° C. Tendo em vista que se tratava apenas da amostra de entrada, este efeito pode ser diferente no DNA do chip.

De agora em diante, estarei fazendo pelo menos um tratamento de 2 horas a 65 C.

O 95C por 15min é melhor realizado em um pH básico. Se o seu tampão de eluição estiver em pH 10 ou superior, você deve estar bem. Abaixo desse pH, o DNA ficará cortado e não será um modelo tão bom para PCR (ou pode ser totalmente degradado). Além disso, descobrimos que um pouco de agente quelante (EDTA 1mM) também pode ajudar a preservar o DNA em altas temperaturas.

jamessmith01 em 24 de março de 2010, 12 & # 5850 PM disse:

Apenas uma atualização rápida sobre isso para qualquer pessoa que possa estar fazendo um cross-linking reverso de 15 min @ 95 C:

Realizamos reticulação reversa de amostras de entrada (cromatina cisalhada) a 95 C por 15 minutos e 65 C por 2, 4 e 6 horas. Isso foi analisado por qPCR e, embora não tenha havido diferença entre as amostras de 65 ° C, todas elas tinham Cts aproximadamente um ciclo menor do que a amostra de 95 ° C. Tendo em mente que se tratava apenas da amostra de entrada, este efeito pode ser diferente no DNA do chip.

De agora em diante, estarei fazendo pelo menos um tratamento de 2 horas a 65 C.


Só por curiosidade, você costuma reverter os links cruzados apenas no buffer de eluição? Ou você adiciona NaCl? Pelo que vale a pena, eu normalmente eluo e trato com proteinase K ao mesmo tempo (62C por 2 horas em um forno Hyb para obter um pouco de agitação com base no protocolo Millipore MagnaChIP) e depois coloco a 95C por 10 min antes da purificação. Parece estar funcionando muito bem para mim recentemente, desde que parei de usar o buffer de eluição Millipore & # 39s (que eles não me disseram a receita) e comecei a usar o mais comum 1% SDS + 0,1M NaHCO3.

Mighty Mouse em 26 de março de 2010, 12 & # 5842 PM disse:

jamessmith01 em 24 de março de 2010, 12 & # 5850 PM disse:

Apenas uma atualização rápida sobre isso para qualquer pessoa que possa estar fazendo um cross-linking reverso de 15 min @ 95 C:

Realizamos reticulação reversa de amostras de entrada (cromatina cisalhada) a 95 C por 15 minutos e 65 C por 2, 4 e 6 horas. Isso foi analisado por qPCR e, embora não tenha havido diferença entre as amostras de 65 ° C, todas elas tinham Cts aproximadamente um ciclo menor do que a amostra de 95 ° C. Tendo em vista que se tratava apenas da amostra de entrada, este efeito pode ser diferente no DNA do chip.

De agora em diante, estarei fazendo pelo menos um tratamento de 2 horas a 65 C.


Só por curiosidade, você costuma reverter os links cruzados apenas no buffer de eluição? Ou você adiciona NaCl? Pelo que vale a pena, eu normalmente eluo e trato com proteinase K ao mesmo tempo (62C por 2 horas em um forno Hyb para obter um pouco de agitação com base no protocolo Millipore MagnaChIP) e depois coloco a 95C por 10 min antes da purificação. Parece estar funcionando muito bem para mim recentemente, desde que parei de usar o buffer de eluição Millipore & # 39s (que eles não me disseram a receita) e comecei a usar o mais comum 1% SDS + 0,1M NaHCO3.

Eu sigo o protocolo Active Motif conforme abaixo:

- Faça lavagens.
- Adicionar tampão de eluição (& # 39AM2 & # 39), incubação de 15 min.
- Adicionar buffer X-linking reverso, remover supnt. de contas.
- Incube 15 min @ 95 ° C (ou 2,5 h @ 65 ° C).
- Adicionar proteinase K, incubar 1 hora a 37 C.
- Adicione a solução de parada de proteinase K.

Eu presumi que o buffer de ligação X reverso contém NaCl, mas talvez não.


Como você reverte a reticulação de formaldeído? - (19 / out / 2005)

Olá,
Estou tendo dificuldades para encontrar um protocolo para a reversão da reticulação de formaldeído. Estou examinando a interação entre a proteína bruta e uma sequência específica de DNA, gostaria de reticulá-los, mas também preciso separá-los. Se alguém souber de um protocolo & quotreversível & quot, por favor, me avise.
Obrigado

A reticulação de formaldeído é revertida incubando a solução reticulada em alto teor de sal (aproximadamente 1ul 5M NaCl / 25ul material reticulado no kit ChIP) a 65C por pelo menos 4h

- outra pessoa deve confirmar isso, mas eu acho que isso se inverte laços imino formado entre o fator de transcrição e o DNA pelo formaldeído -

Sim, beccaf22 está certo. Realize a reticulação reversa PELO MENOS por 4 horas.

A reticulação de formaldeído é revertida incubando a solução reticulada em alto teor de sal (aproximadamente 1ul 5M NaCl / 25ul material reticulado no kit ChIP) a 65C por pelo menos 4h

- outra pessoa deve confirmar isso, mas eu acho que isso se inverte laços imino formado entre o fator de transcrição e o DNA pelo formaldeído -


Reticulação UV e imunoprecipitação (CLIP)

O interesse nas interações RNA-proteína está crescendo à medida que começamos a apreciar o papel do RNA, não apenas em processos bem estabelecidos, como transcrição, splicing e tradução, mas também em campos mais novos, como interferência de RNA e regulação gênica por não codificação RNAs.

CLIP é uma técnica baseada em anticorpos usada para estudar interações RNA-proteína relacionadas à imunoprecipitação de RNA (RIP), mas difere do RIP no uso de radiação UV para reticular proteínas de ligação de RNA ao RNA ao qual estão ligadas. Esta ligação covalente é irreversível, permitindo condições de purificação rigorosas. Ao contrário do RIP, o CLIP fornece informações sobre o local real de ligação da proteína no RNA.

Existem diferentes tipos de CLIP, sequenciamento de alto rendimento-CLIP (HITS-CLIP), CLIP fotoativável-ribonucleosídeo aprimorado (PAR-CLIP) e CLIP individual (iCLIP).

Aqui está um resumo do protocolo iCLIP adaptado do Konig et al. J. Vis. Exp. 2011. “iCLIP -Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution.”

Adaptado de Huppertz et al. Métodos. 2014. “iCLIP: Interações proteína-RNA na resolução de nucleotídeos.”

Tampão de lise

Inibidores de protease (adicionar novos a cada vez)

Lavagem com alto teor de sal

Diluição de RNase baixa Diluição de RNase alta

Diluições de 1/500 RNase I para preparação de biblioteca Diluições de 1/50 RNase I para controle de anticorpo

Mistura de tampão de lavagem PNK

4 μL 5x PNK tampão pH 6,5 [350 mM Tris-HCl, pH 6,5 50 mM MgCl 2 5 mM de ditiotreitol]

Mistura de ligadura Uma mistura PNK quente

4 μL de tampão de ligação 4x [200 mM Tris-HCl 40 mM MgCl 2 4 mM de ditiotreitol]

1,5 μL de ligante pré-adenilado L3 [20 μM]

Tampão PK Tampão PKurea

RNA / mistura de primer RT mix

0,5 μL Rclip primer [0,5 pmol / μL]

0,25 μL de transcriptase reversa Superscript III

Mistura de ligadura B Mistura de recozimento de oligo

0,8 μL 10x CircLigase Buffer II

1 μL de mistura de primer P5 / P3 solexa

20 μl de enzima Accuprime Supermix 1

1. Reticulação UV de células de cultura de tecidos

1.1. Remova a mídia e adicione PBS gelado às células (por exemplo, use células cultivadas em uma placa de 10 cm para três experimentos e adicione 6 ml de PBS).

1.2. Retire a tampa, coloque no gelo e irradie uma vez com 150 mJ / cm 2 a 254 nm usando um Stratalinker.

Um ou mais controles negativos devem ser mantidos durante todo o experimento. Células ou tecido nocaute, bem como células não reticuladas, são bons controles negativos, enquanto células nocaute não são recomendadas.

Observação. A pré-incubação opcional de 4-tiouridina e a reticulação UV-A podem ser usadas para certas proteínas. 4-tiouridina aumenta a reticulação de algumas proteínas. (Para esta etapa opcional, siga as instruções abaixo).

Opcional - rotulagem com tiouridina e reticulação UV-A (alternativa à etapa 1.2)

• Adicione 50 μL de 4SU (concentração de estoque: 100 mM 4SU) a uma placa de 10 cm de células cultivadas em 10 ml de DMEM suplementado com FBS e caneta strep para obter uma concentração final de 500 μM 4SU. Alternativamente, adicione 10 μL de 4-tiouridina (concentração de estoque: 100 mM) para obter uma concentração final de 100 μM de 4SU.

• Incube as células com 4-tiouridina por 60 min a 500 μM ou 8 h a 100 mM. Verifique a viabilidade celular.

• Aspire o meio e adicione 6 mL de PBS gelado às células que crescem em uma placa de 10 cm (o suficiente para três imunoprecipitações). Retire a tampa e coloque no gelo.

• Irradie uma vez com 2 × 400 mJ / cm 2 em um Stratalinker 2400 com lâmpadas de 365 nm ou um instrumento equivalente.

1.3. Colher as células com um raspador de células e transferir a suspensão de células para os microtubos (por exemplo, 2 mL para cada um dos três microtubos).

1.4. células sedimentadas (giram em velocidade máxima por 10 segundos a 4 ° C) e, em seguida, remova o sobrenadante.

1,5. Congele rapidamente os pellets de células em gelo seco e armazene a -80 ° C até o uso.

O experimento pode levar até uma semana. Evite vários ciclos de congelamento e descongelamento.

1.6 Preparação do grânulo

1.6.1 Adicionar grânulos de proteína A ou proteína G (por exemplo, 100 μl de grânulos magnéticos por experimento) a um microtubo fresco e lave os grânulos 2x com tampão de lise.

1.6.2 Ressuspender os grânulos em tampão de lise (100 μL), adicionar anticorpo (2-10 μg) e girar os tubos em temperatura ambiente por 30–60 min.

A quantidade de anticorpos necessária pode precisar ser otimizada. Uma amostra sem anticorpos é um bom controle negativo.

1.6.3. Lave as contas 3x com tampão de lise (900 μL) e deixe na última lavagem até que esteja pronto para prosseguir com a imunoprecipitação (etapa 3.1).

Se um anticorpo funcionar no IP, é uma boa indicação de que funcionará no CLIP.

2. Lise celular e digestão de RNA parcial

2.1. Ressuspenda o pellet celular em tampão de lise com inibidores de protease (1 mL) e transfira para microtubos de 1,5 mL.

Observação. Aqui você pode tentar uma etapa opcional de sonicação. A sonicação corta o DNA, que libera proteínas da cromatina, aumentando a recuperação dos complexos proteína-RNA.

Opcional - Sonicação de amostras

Sonicate a amostra no gelo usando um sonicador. A sonda não deve tocar nas laterais do tubo para evitar a formação de espuma. Sonicate duas vezes com rajadas de 10 segundos a cinco decibéis. Limpe a sonda sonicando H 2 O antes e depois do tratamento da amostra.

Use o Bioruptor plus por cinco ciclos alternando 30 seg ligado / 30 seg desligado em baixa intensidade.

2.2. Adicione a diluição de RNase baixa (10 μL) e Turbo DNase (2 μL) ao lisado celular e incube por exatamente 3 min a 37 ° C, agitando a 1.100 rpm e, em seguida, transfira imediatamente para o gelo.

2.3. Girar a 4 ° C a 22.000 g por 10 min e coletar cuidadosamente o sobrenadante limpo (deixar cerca de 50 mL de lisado com o pellet).

Cada membro do laboratório deve usar seu próprio conjunto de tampões e reagentes para facilitar a identificação de fontes potenciais de contaminação. As condições ideais para as digestões de RNase podem precisar ser otimizadas para cada novo lote de RNase.

3. Imunoprecipitação e desfosforilação das extremidades 3 'do RNA

3.1. Remova o tampão de lise das esferas (etapa 1.1.3) e adicione o lisado celular (a partir da etapa 2.3).

3.2. Faça a rotação das amostras por 2 h a 4 ° C.

3.3. Descarte o sobrenadante, lave as contas 2x com tampão de alto teor de sal (900 μL) e, em seguida, 2x com tampão de lavagem (900 μL). Faça a rotação dessas lavagens por pelo menos 1 minuto a 4 ° C.

A otimização e as condições de lavagem rigorosas são muito importantes.

Observação. No caso em que as condições iCLIP padrão não são rigorosas o suficiente para purificar especificamente a proteína de interesse, uma imunoprecipitação dupla com desnaturação de ureia pode ser usada em vez do protocolo descrito aqui. Para obter mais informações, consulte Huppertz et al. Métodos. 2014. “iCLIP: Interações proteína-RNA na resolução de nucleotídeos.”

3.4. Descarte o sobrenadante, ressuspenda os grânulos na mistura PNK (20 μL) e incube por 20 min a 37 ° C em um termomixer.

3,5. Adicione tampão de lavagem (500 μL), lave 1x com tampão de alto teor de sal e, a seguir, 2x com tampão de lavagem.

4. Ligação do ligante às extremidades 3 'do RNA e marcação da extremidade 5' do RNA

4.1. Remova cuidadosamente o sobrenadante, ressuspenda os grânulos na mistura de ligação A (20 μL) e incube durante a noite a 16 ° C em um termomixer.

4.2. Adicionar tampão de lavagem (500 μL), lavar 2x com tampão de alto teor de sal (1 mL) e, em seguida, 2x com tampão de lavagem (1 mL). Realize essas lavagens com rotação a 4 ° C por 5 minutos cada.

4.3. Remova o sobrenadante, ressuspenda os grânulos na mistura PNK quente (4 μL) e incube por 5 min a 37 ° C.

4,4. Remova a mistura PNK quente e ressuspenda os grânulos em tampão de carregamento 1x SDS-PAGE (20 μL).

4.5. Incubar em um termomixer a 70 ° C por 10 min.

4,6. Imediatamente coloque em um ímã para precipitar as contas vazias e carregar o sobrenadante no gel (veja a etapa 5).

5. Ligante SDS-PAGE e transferência de membrana

5.1. Carregue as amostras, bem como um marcador de tamanho de proteína pré-corado (5 μL) em um gel pré-moldado de 4-12% Bis-Tris e execute o gel por 50 min a 180 V em tampão de corrida 1x MOPS (de acordo com as instruções do fabricante).

Géis com pH constante 7 são recomendados.

5,2 Remova a frente do gel e descarte como resíduo sólido (contém ATP radioativo livre).

5.3. Transfira os complexos de proteína-RNA do gel para uma membrana de nitrocelulose usando um aparelho de transferência úmida (transferência de 1 h a 30 V dependendo das instruções do fabricante).

5,4 Após a transferência, enxágue a membrana em tampão PBS, em seguida, embrulhe em filme aderente e exponha a um filme a -80 ° C por 30 min, 1h e depois durante a noite.

Um adesivo fluorescente próximo à membrana permite posteriormente alinhar o filme e a membrana. O sucesso da experiência pode ser monitorado na autorradiografia do complexo proteína-RNA após a transferência da membrana.


Como testar a reticulação e reversão de ChIP? - (13 / jun / 2006)

Também gostaria de experimentar o seu novo protocolo para ChIP. É possível me enviar o protocolo ou uma reimpressão do artigo em protocolos da natureza, pois não temos acesso a este periódico?

Eu queria saber se esse método ChIP rápido poderia ser ajustado para usar colunas de rotação (em vez de pipetar o sobrenadante, apenas girar.

Quer dizer, apenas carregar as contas e tudo em uma coluna de rotação e girar o sobrenatural? Lembro-me vagamente de ouvir sobre alguém fazendo isso e tendo sucesso, mas infelizmente não consigo me lembrar onde. Você está preocupado com o transporte de grânulos durante a transferência da amostra, a grande quantidade de volume morto ou apenas tentando acelerar o ensaio?

Na verdade, quero diminuir de forma que o & # 39pellet & # 39 fique muito pequeno para distingui-lo. Além disso, minhas habilidades de recuperação do sobrenadante não são ótimas (parece muita variabilidade). Acabei de experimentar, então veremos como são os PCRs.

EDIT: Bem, sem sorte. Mas não a sorte que eu estava pensando que aconteceria. O anticorpo (dois abs diferentes), nenhum anticorpo e as amostras de IgG mostram sinal de PCR. Que diabos? Qualquer ajuda aqui. Pelo menos na primeira vez, havia mais sinal nas duas amostras de anticorpos do que na amostra sem ab; agora, elas são quase iguais. Eu até tentei lavar com uma concentração de sal mais alta (450 mM) no tampão desta vez. ALGUMA AJUDA LÁ?

Quer dizer, apenas carregar as contas e tudo em uma coluna de rotação e girar o sobrenatural? Lembro-me vagamente de ouvir sobre alguém fazendo isso e tendo sucesso, mas infelizmente não consigo me lembrar onde. Você está preocupado com o transporte de grânulos durante a transferência da amostra, a grande quantidade de volume morto ou apenas tentando acelerar o ensaio?

Na verdade, quero diminuir a escala de forma que o & # 39pellet & # 39 fique muito pequeno para distingui-lo. Além disso, minhas habilidades de recuperação do sobrenadante não são ótimas (parece muita variabilidade). Acabei de experimentar, então veremos como são os PCRs.

EDIT: Bem, sem sorte. Mas não a sorte que eu estava pensando que aconteceria. O anticorpo (dois abs diferentes), nenhum anticorpo e as amostras de IgG mostram sinal de PCR. Que diabos? Qualquer ajuda aqui. Pelo menos na primeira vez, havia mais sinal nas duas amostras de anticorpos do que na amostra sem ab, agora eles são quase iguais. Eu até tentei lavar com uma concentração de sal mais alta (450 mM) no tampão desta vez. ALGUMA AJUDA LÁ?

Quer dizer, apenas carregar as contas e tudo em uma coluna giratória e girar o sobrenatural? Lembro-me vagamente de ouvir sobre alguém fazendo isso e tendo sucesso, mas infelizmente não consigo me lembrar onde. Você está preocupado com o transporte de grânulos durante a transferência da amostra, a grande quantidade de volume morto ou apenas tentando acelerar o ensaio?

Após a incubação do anticorpo com a cromatina, você centrifugou (velocidade máxima de 10 minutos, pelo menos) e tomou cuidado para pegar apenas os 85-90% (ou menos) superiores ao transferir sua cromatina para as contas de proteína A?

Bem, eu fiz isso por meio de uma coluna, então girei e coletei o fluxo direto. Estou prestes a fazer de novo sem as colunas, mas desta vez limpando minhas amostras com algumas contas. Talvez isso elimine o sinal pcr nas amostras não ab & # 33. Também vi a sugestão de bloquear as contas com BSA. Qual você acha que funcionaria melhor (ou ambos)?

Você pode tentar incubar suas contas com 5% de BSA e 100ug / ml de DNA de espermatozóide de salmão tosquiado antes e durante a incubação com anticorpo e cromatina. Isso pode ajudar a reduzir a ligação não específica. Além disso, se estiver usando grânulos de alta capacidade (como a agarose de proteína A Amersham Fast-Flow), você pode reduzir a quantidade de grânulos que usa.

Eu reduziria a quantidade de grânulos, mas como é o principal (novo) problema que estou tendo é o desaparecimento de grânulos de agarose? Eu giro os tubos que tinham apenas um pellet (tudo que fiz foi adicionar minha amostra ab incubada), mas depois de girar eu não vejo mais um pellet Algum pensamento?

Você pode tentar incubar suas contas com 5% de BSA e 100ug / ml de DNA de espermatozóide de salmão tosquiado antes e durante a incubação com anticorpo e cromatina. Isso pode ajudar a reduzir a ligação não específica. Além disso, se estiver usando grânulos de alta capacidade (como a agarose de proteína A Amersham Fast-Flow), você pode reduzir a quantidade de grânulos que usa.


Quais são os problemas técnicos com o ChIP-seq?

Grosso modo, o ChIP-seq possui três etapas principais que determinam seu sucesso. O primeiro e mais crucial é a seleção de anticorpos, o segundo é o sequenciamento real, que está sujeito a vários vieses possíveis e o terceiro é a análise algorítmica, incluindo mapeamento e chamada de pico.

O primeiro requisito, obviamente, é que o anticorpo tenha alguma especificidade para a proteína em estudo: isso pode ser testado usando um painel de proteínas recombinantes ou linhas de células transfectadas com diferentes alvos proteicos. Então, o anticorpo deve ser capaz de imunoprecipitar a proteína-alvo. Nem todos os anticorpos imunoprecipitam e, mesmo quando o fazem, podem não se dar bem em ChIP. Idealmente, estudos anteriores terão identificado locais genômicos onde a proteína é conhecida por se ligar, e esses locais podem ser usados ​​para otimizar as condições de ChIP.

A segunda questão é o sequenciamento, que é uma 'caixa preta' para muitos biólogos, que estão familiarizados com o que entra e o que sai, mas talvez não com os possíveis vieses introduzidos no meio. As abordagens de sequenciamento de última geração requerem processamento em massa de fragmentos de DNA e sequenciamento maciço paralelo. Isso significa que mesmo o menor viés na ligação de ligantes, na amplificação por PCR ou na hibridização pode resultar em alguns desvios dependentes da plataforma nos dados da população emergentes de 10 milhões ou mais leituras. As tecnologias ainda estão evoluindo e os diferentes formatos têm vieses diferentes. Por esse motivo, é importante em um experimento ChIP-seq executar um controle usando 'DNA de entrada' (DNA genômico não ChIP) para que os vieses de sequenciamento possam ser identificados e ajustados.

O terceiro problema é o mapeamento, que com tags curtas (em torno de 25 a 35 bp) pode ser ambíguo em regiões de alta homologia ou em regiões repetidas. À medida que as sequências de tags ficam mais longas, isso deixa de ser um problema, mas os erros de chamada de base e sequenciamento limitam a capacidade de mapeamento. Não é incomum ter apenas 50% das leituras mapeáveis, embora com algoritmos de mapeamento mais 'inteligentes' que levam em consideração erros de sequenciamento ou polimorfismos, a capacidade de mapeamento tenha aumentado significativamente. No ChIP-seq, a densidade de tags de sequência mapeada é o principal determinante do sucesso. O algoritmo ELAND da Illumina e o MAQ (Mapping and Assembly with Quality) costumavam ser os mapeadores de leitura curta preferidos, mas uma nova geração de programas mais eficientes, como Bowtie, BWA (Burrows-Wheeler Alignment Tool) e BFAST (Blat-like Ferramenta de pesquisa rápida e precisa) estão substituindo-os gradualmente.


Conclusões

Nós fornecemos um protocolo para ChIP-exo baseado na plataforma de sequenciamento Illumina comumente usada. Como o ChIP-seq forneceu uma melhoria substancial em relação ao chip ChIP na precisão da chamada de pico e na capacidade de distinguir locais de ligação próximos [3, 15], nossos dados sugerem fortemente que o ChIP-exo supera o ChIP-seq na capacidade de discriminar picos próximos e pequenos picos. Além disso, pode revelar informações sobre os padrões de ligação do fator de transcrição ao DNA, incluindo a previsão da ligação do fator de transcrição do dímero. Também mostramos pela primeira vez que o ChIP-exo é viável em tecido primário, como o fígado de camundongo. Acreditamos que a tecnologia ChIP-exo pode ajudar a caracterizar a arquitetura do cis- elementos regulatórios, em particular no que diz respeito ao destaque da cooperatividade entre os fatores de transcrição.

Disponibilidade de dados

Todos os dados são depositados no ArrayExpress com o número de acesso E-MTAB-1827. A Figura 3A inclui dados de FoxA1 ChIP-seq do mouse depositados sob os números de acesso ArrayExpress E-MTAB-223 [8] e E-MTAB-1414 [16].


Preparação de bibliotecas ChIP-seq de baixa entrada e livres de ligações usando a tecnologia de troca de modelo

A imunoprecipitação da cromatina (ChIP) seguida por sequenciamento de alto rendimento (ChIP-seq) se tornou o padrão ouro para o mapeamento de fatores de transcrição e modificações de histonas em todo o genoma. No entanto, para experimentos de ChIP envolvendo poucas células ou visando fatores de transcrição de baixa abundância, a pequena quantidade de DNA recuperado torna a ligação de adaptadores muito desafiadora. Nesta unidade, descrevemos um fluxo de trabalho ChIP-seq que pode ser aplicado a pequenos números de células, incluindo um método robusto de tubo único e sem ligação para a preparação de bibliotecas de sequenciamento a partir de quantidades de sub-nanogramas de DNA ChIP. Um exemplo de protocolo ChIP é apresentado pela primeira vez, resultando no enriquecimento seletivo de proteínas de ligação de DNA e fragmentos de DNA reticulados imobilizados em grânulos por meio de uma ponte de anticorpo. Isso é seguido por um protocolo para reversão de cross-linking e recuperação de DNA rápida e fácil. Finalmente, descrevemos um protocolo de preparação de biblioteca rápido e livre de ligação, apresentando a tecnologia DNA SMART, resultando em amostras prontas para o sequenciamento Illumina. © 2016 por John Wiley & Sons, Inc.


Cromodinâmica biológica: um método geral para medir a ocupação de proteínas em todo o genoma, calibrando ChIP-seq

O sequenciamento de fragmentos de DNA associados a proteínas após a reticulação in vivo com formaldeído (conhecido como ChIP-seq) tem sido amplamente utilizado para descrever a distribuição de proteínas em genomas. Não é amplamente reconhecido que este método meramente estima a distribuição de uma proteína e não pode revelar mudanças na ocupação entre as amostras. Para fazer isso, marcamos com o mesmo epítopo proteínas ortólogas em Saccharomyces cerevisiae e Candida glabrata, cujas sequências divergiram a um grau que a maioria dos fragmentos de DNA com mais de 50 bp são exclusivos de apenas uma espécie. Ao misturar números definidos de células C. glabrata (o genoma de calibração) com amostras de S. cerevisiae (os genomas experimentais) antes da fragmentação da cromatina e imunoprecipitação, é possível derivar uma medida quantitativa de ocupação (a taxa de ocupação - OR) que permite uma comparação de ocupações não apenas dentro, mas também entre genomas. Demonstramos pela primeira vez que este método de calibração de 'padrão interno' satisfaz a condição sine qua non para quantificar perfis ChIP-seq, ou seja, linearidade em uma ampla faixa. Crucialmente, ao empregar proteínas marcadas funcionais, nosso processo de calibração descreve um método que distingue a associação genuína dentro dos perfis ChIP-seq do ruído de fundo. Nosso método é aplicável a qualquer proteína, não apenas às altamente conservadas, e evita a necessidade de quantificação demorada, cara e tecnicamente exigente de ChIP usando qPCR, que só pode ser realizada em loci individuais. Como demonstramos pela primeira vez neste artigo, o ChIP-seq calibrado representa um passo importante para documentar as distribuições quantitativas de proteínas ao longo dos cromossomos em diferentes estados celulares, que chamamos de cromodinâmica biológica.

© The Author (s) 2015. Publicado pela Oxford University Press em nome da Nucleic Acids Research.

Bonecos

Os perfis ChIP-seq não são afetados por ...

Os perfis ChIP-seq não são afetados pelas células de referência. Extratos brutos preparados a partir de um crescimento exponencial ...

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A taxa de ocupação (OR) não é afetada pela quantidade de células de referência. Experimentos ChIP-seq ...

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Usando ChIP-seq calibrado para medir a associação dependente do ciclo celular da coesina com o S.…

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Perfis convencionais de ChIP-seq de coesina (Scc1) durante síncrono S. cerevisiae ciclos celulares. O…

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Cromodinâmica de coesina: perfis ChIP-seq calibrados de Scc1 durante síncrono S.cerevisiae ciclos celulares. O…

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O ChIP-seq calibrado, ao contrário do ChIP-seq convencional, distingue os sinais do ruído. ( UMA ) Calibrado ...

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Perfis calibrados de ChIP-seq de tipo selvagem, mutante simulado de acetilação e mutante de hidrólise de ATPase Smc3.…

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Dinâmica da coesina ao redor do centrômero. O número de leituras por par de base (eixo Y) ...

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Coesina pericêntrica visualizada por ChIP-seq calibrado e imagens celulares. ( UMA ) Cohesin's ...


ChIP-seq FAQs

O kit ChIP Elute permite a eluição de DNA da proteína A / G agarose ou esferas magnéticas e reversão de reticulação em uma única etapa. Este kit é significativamente mais rápido e conveniente do que os métodos tradicionais. O kit ChIP Elute leva apenas uma hora (incluindo a purificação do DNA), enquanto os métodos tradicionais levam até a noite. Uma vez que o DNA de fita simples (ssDNA) é produzido usando o método ChIP Elute, este método é apropriado para experimentos ChIP que são seguidos por qPCR, ou experimentos ChIP-seq se estiver usando um kit DNA SMART ChIP-Seq (que são totalmente compatíveis com ssDNA entradas). Usar o método ChIP Elute em combinação com o kit DNA SMART ChIP-Seq torna o ChIP-seq menos tedioso e demorado.

Os resultados do ChIP-seq são os mesmos, quer eu use o método padrão ou o Kit ChIP Elute?

sim. Bibliotecas de sequenciamento geradas a partir de DNA eluído com o ChIP Elute Kit ou métodos tradicionais mostram métricas de sequenciamento comparáveis.

Devo limpar meu DNA de ChIP antes da preparação da biblioteca?

sim. O kit ChIP Elute inclui purificação e concentração de DNA baseada em coluna. O DNA do ChIP preparado usando este kit é diretamente compatível com o kit DNA SMART ChIP-Seq sem purificação adicional.

    • Se você usar outro método para reversão de reticulação e eluição de DNA, recomendamos o kit NucleoSpin Gel e PCR Clean-Up junto com Tampão NTB (disponível separadamente Cat. # 740595.150), que é especialmente formulado para acomodar amostras com altas concentrações de SDS.

    Observação: Se o seu DNA for de fita simples, você precisará usar o Buffer NTC (Cat. # 740654.100) com o gel NucleoSpin e o kit de limpeza de PCR.

    Estou usando o ChIP para observar as modificações das histonas com apenas 10.000 células. Os kits ChIP Elute e DNA SMART ChIP-Seq funcionarão com uma entrada tão pequena?

    sim. Analisamos DNA de pull-downs H3K4me3 usando 10.000 & ndash1 milhão de células, usando o kit ChIP Elute no final de nosso fluxo de trabalho ChIP seguido por um kit DNA SMART ChIP-Seq. Obtivemos um rendimento razoável de 10.000 células usando 18 ciclos de PCR.

    Preciso tratar minhas amostras com RNase antes da preparação da biblioteca?

    Não. RNases residuais na amostra podem comprometer o sucesso da preparação da biblioteca. Além disso, a desoxinucleotidil transferase terminal não usará RNA como um molde na etapa de cauda T, e o uso de um primer poli (dA), em vez de um primer poli (dT), torna improvável a iniciação para RNA.

    Que tamanho de fragmentos o kit DNA SMART ChIP-Seq pode acomodar?

    Fragmentos de DNA com mais de 100 bp podem ser usados ​​com o kit DNA SMART ChIP-Seq. If desired, fragments several kb in length can easily be amplified however, this kit has been tested specifically with ChIP DNA fragments ranging from 100 to 500 bp (with an average of 200&ndash400 bp). The PCR cycling guidelines in the DNA SMART ChIP-Seq User Manual are based on DNA fragments in this range. If your DNA is substantially longer or shorter, the optimal number of PCR cycles will need to be determined empirically.

    Why are size selection and cleanup not performed before the PCR step as in other kits?

    In ligation-based kits, a pre-PCR cleanup step is required to remove adapter dimers. The DNA SMART ChIP-Seq Kit does not use ligation, and high-quality ChIP-seq libraries can be obtained without size selection. However, specific applications such as identification of transcription factor binding sites may benefit from stringent size selection. We have found that pre-PCR size selection reduces the complexity of the final library, with increased PCR duplicates (see our tech note for more information). Our single-tube workflow allows for size selection and cleanup following the PCR step, and our protocol provides guidance for more or less stringent size selection. We have found that the basic protocol (Option 1) removes larger PCR fragments (that do not cluster well) without compromising library complexity.

    How much sequence is added to my samples in the final library?

    Together, the DNA SMART Oligo, DNA SMART Poly(dA) Primer, and the Indexing Primers for Illumina add 153 bp to the initial DNA fragment length.

    Why don’t I see anything when I run the libraries on an agarose gel?

    We do not recommend running the final libraries on an agarose gel. To minimize biases, ChIP-seq libraries (as well as other types of next-generation sequencing libraries) should not be overamplified. The low concentration of the final library makes visualization on agarose gels very difficult. Instead, we recommend quantifying the libraries with a Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific) with the Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Cat. # Q32851 and Q32854). To evaluate library quality, run 1 µl of the library on an Agilent 2100 Bioanalyzer using the High Sensitivity DNA Kit (Agilent, Cat. # 5067-4626).

    Observação: For optimal resolution, if the library concentration is >2 ng/µl, dilute the library in water or Library Elution Buffer to a concentration of 1&ndash2 ng/µl prior to running on the Agilent Bioanalyzer.

    What library yield should I expect?

    Our guidelines typically result in a final library yield of >5 ng/µl (>20&ndash25 nM). Lower yield (2&ndash3 ng/µl) may be typical for very low inputs (100 pg), but is still enough for sequencing. If you obtain >25 ng/µl, consider reducing the number of cycles to minimize potential biases.

    Where are the indexes in the final ChIP-seq libraries?

    Indexed adapters for Illumina sequencing are present in the PCR primers used to amplify the ChIP-seq library. The Index 1 (i7) sequence is found on the Reverse PCR Primer HT while the Index 2 (i5) sequence is found on the Forward PCR Primer HT. When selecting settings for sequencing, HT indexes should be used. The specific sequence of the indexes on these primers is the same as the standard Illumina HT indexes, and can also be found in the DNA SMART ChIP-Seq Kit User Manual.

    Overview of template switching in the DNA SMART ChIP-Seq Kit. The Index 1 (i7) sequence (indicated in yellow) is found on the Reverse PCR Primer HT while the Index 2 (i5) sequence (indicated in pink) is found on the Forward PCR Primer HT.

    Which indexes are included in the DNA SMART ChIP-Seq kits?

    There are three versions of the DNA SMART ChIP-Seq Kit. They all contain PCR primers with indexes identical to those in the Illumina TruSeq DNA HT Sample Prep Kit. Forward PCR Primers contain the i5 index, and Reverse PCR Primers contain the i7 index.

    • The 12-reaction kit (Cat. # 634865) includes 1 forward primer (with an index identical to D502) and 12 reverse primers (with indexes identical to D701&ndashD712)
    • The 48-reaction kit A (Cat. # 634866) includes 4 forward primers (with indexes identical to D501&ndashD504) and 12 reverse primers (with indexes identical to D701&ndashD712)
    • The 48-reaction kit B (Cat. # 634867) includes 4 forward primers (with indexes identical to D505&ndashD508) and 12 reverse primers (with indexes identical to D701&ndashD712)

    Together, the DNA SMART ChIP-Seq Kit - 48 A and the DNA SMART ChIP-Seq Kit - 48 B can be used to generate libraries incorporating all 96 high-throughput Illumina indexes. The nucleotide sequences for the indexes can be found in the DNA SMART ChIP-Seq Kit User Manual.

    How many samples can I multiplex per run?

    ChIP-seq libraries generated with the DNA SMART ChIP-Seq Kit contain adapters and indexes for Illumina sequencing. There are three versions of this kit that allow production of either 12 or 48 indexed libraries. It is also possible to use both versions of the 48-reaction kit (the DNA SMART ChIP-Seq Kit - 48 A and B) to generate the full 96 high-throughput Illumina indexes. Not all indexes can be pooled together consult the Illumina literature (such as the "TruSeq ® DNA Sample Preparation Guide") for appropriate pooling guidelines. If needed, compare the index sequences in the DNA SMART ChIP-Seq Kit User Manual with Illumina adapter sequences.

    Can I do paired-end sequencing with the DNA SMART ChIP-Seq Kit?

    Single-end sequencing with Read 1 is generally sufficient for ChIP-seq. However, if paired-end sequencing is desired, you should use the DNA SMART Custom Read2 Seq Primer provided in the kit (if your sequencing facility accepts custom primers). The custom primer can be used on an Illumina MiSeq ® instrument or sent along with your samples to your sequencing facility for a HiSeq ® run.

    Do I need to trim my reads before mapping?

    You should trim three nucleotides from the 5' end of your reads (Read 1). Optionally, you may also trim Illumina adapter sequences and stretches of poly(T), particularly if you read more than 50 nucleotides, as sequences from short inserts will contain the T-tail that is added in the library construction process.

    Some of my sequences (Read 1) have a poly(T) stretch at their 3' ends: what does this mean?

    The lower limit of the AMPure bead size selection is not a perfect cutoff a small proportion of the PCR products in the final library may have short inserts. In these cases, the sequencing from Read 1 will read through the T-tail added during library synthesis.

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    Assista o vídeo: High quality ChIP-seq experiments with Diagenode Automation instruments (Janeiro 2022).