Em formação

É possível classificar as gotas dentro de uma fase de óleo com um FACS


Em suma, é possível FACS uma amostra que está em óleo em vez de um buffer (solução à base de água)? Eu apreciaria muito qualquer ajuda com isso. Obrigado


É possível que haja alguma máquina especializada modificada que possa fazer isso, mas as máquinas convencionais de citometria de fluxo não podem. Este artigo sugere uma abordagem possível:

Infelizmente, os instrumentos FACS são incompatíveis com suspensões não aquosas, portanto, para classificar uma emulsão água em óleo, é necessário realizar uma emulsificação adicional para produzir uma emulsão dupla água em óleo em água. A amostra resultante, agora dispersa em uma fase aquosa, é passível de classificação FACS.

- Um em um milhão: Classificação citométrica de fluxo de ensaios de lisado de célula única em gotículas de emulsão dupla de picolitro monodispersa para evolução direcionada

Existem também máquinas de microfluídica que podem fazer isso, mas acho que você teria que construir a sua própria em vez de poder comprar uma solução (o que seria caro em qualquer caso, eu acho).


É possível separar as gotas dentro de uma fase oleosa com um FACS - Biologia

um Instituto de Físico-Química, Academia Polonesa de Ciências, Kasprzaka 44/52, 01-224 Varsóvia, Polônia
O email: [email protected]

b Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade de Tartu, Riia 23, Tartu, Estônia

Resumo

A microfluídica de gota emergiu rapidamente como uma das tecnologias-chave abrindo novas possibilidades experimentais em microbiologia. A capacidade de gerar, manipular e monitorar gotículas transportando células únicas ou pequenas populações de bactérias de maneira altamente paralela e de alto rendimento cria novas abordagens para resolver problemas de diagnóstico e para pesquisas sobre evolução bacteriana. Esta revisão apresenta aplicações da microfluídica de gotículas em vários campos da microbiologia: i) detecção e identificação de patógenos, ii) testes de sensibilidade a antibióticos, iii) estudos de fisiologia microbiana e iv) seleção biotecnológica e aprimoramento de cepas. Também listamos os desafios no campo de desenvolvimento dinâmico e novos usos potenciais de gotículas em microbiologia.


Fundo

Um tecido é composto de muitos tipos de células especializadas, cada uma das quais pode ter vários estados biológicos. Em vez de estudar a expressão gênica global de um tecido como um todo, foi reconhecido que o perfil transcricional em uma resolução de célula única [1,2,3,4] fornece uma descrição muito mais completa e precisa de sua função biológica [5, 6]. Avanços recentes em tecnologias microfluídicas baseadas em gotículas tornaram possível capturar, indexar e sequenciar os perfis transcricionais de milhares de células individuais de uma maneira altamente paralela, ultrarrápida e acessível [7, 8].

No método ‘Drop-seq’ descrito por Macosko et al. [7], as células são encapsuladas separadamente em gotículas do tamanho de nanolitros juntamente com um único grânulo em um dispositivo microfluídico. Um grânulo entrega primers com código de barras, cada um abrigando um identificador de reação em cadeia da polimerase (PCR), um código de barras da célula e uma infinidade de identificadores moleculares únicos (UMIs), seguidos por uma sequência polyT. As contas são suspensas em um tampão de lise, resultando na lise da célula após a formação de gotículas. RNAs mensageiros celulares (mRNAs) são liberados e podem hibridizar com as sequências polyT dos primers de grânulos com código de barras. Após a coleta, as gotículas são quebradas e o mRNA é reversamente transcrito em DNA complementar (cDNA), amplificado por PCR e sequenciado em massa. A análise computacional nos permite atribuir distintamente quais mRNAs se originam da mesma célula por meio do código de barras da célula. Os UMIs são usados ​​para identificar e remover duplicatas de PCR e contar digitalmente moléculas de mRNA distintas.

Apesar do rápido aumento nos métodos de sequenciamento de RNA de célula única de alto rendimento (RNA-seq), incluindo versões comercializadas de plataformas automatizadas, como os sistemas Fluidigm C1, 10XGenomics ou 1CellBiO, comparativamente pouca atenção foi dada às limitações que precisam ser superado na preparação e manuseio de material de entrada celular [9]. Um grande desafio na obtenção de informações significativas é o uso de uma suspensão de célula única de alta qualidade que reflita apropriadamente o estado transcricional de cada célula em seu ambiente natural ou experimental. As etapas entre a coleta de células da cultura ou após a dissociação do tecido, isolamento de células individuais e captura de mRNA são particularmente críticas, pois são propensas a introduzir alterações no transcriptoma e degradação do RNA. Requisitos como a necessidade de agrupar células de vários tecidos ou condições de cultura, possivelmente combinados com experimentos ao longo do tempo, representam uma restrição adicional.

Em princípio, muitos desses problemas poderiam ser resolvidos com a ajuda da fixação química. Ao contrário dos aldeídos, o metanol e o etanol são fixadores coagulantes que não modificam quimicamente os ácidos nucléicos [10, 11]. Os álcoois agem por desidratação: em álcool acima de 65% e na presença de sais, os ácidos nucléicos ocorrem em estado de colapso que pode ser revertido à sua forma original por uma simples reidratação. Nós mostramos anteriormente que a fixação com 80% de metanol é compatível com o sequenciamento de próxima geração e preparação de biblioteca para mRNAs e pequenos RNAs [12]. A fixação era extremamente necessária para o perfil de expressão gênica bem-sucedido em todo o genoma de estágios classificados de uma a quatro células Caenorhabditis elegans embriões, um tecido complexo que sofre mudanças transcricionais rápidas e dinâmicas [12].

Aqui, adaptamos o protocolo de fixação à base de metanol de Stoeckius et al. [12] para preservar as células para posterior criação de perfis de transcriptomas de uma única célula por Drop-seq. Analisamos primeiro as misturas vivas e fixas de células humanas cultivadas (HEK) e de camundongo (3T3) para demonstrar que a fixação de metanol não altera o número de genes e transcritos (definidos como o número de UMIs) detectados por célula ou interfere na atribuição inequívoca de leituras para uma ou outra espécie. Em seguida, aplicamos a fixação de metanol para uma análise em maior escala de

9.000 células primárias de dissociadas Drosófila embriões ou células do rombencéfalo de camundongo selecionadas. Demonstramos que o perfil Drop-seq de transcriptomas de célula única com células fixadas em metanol funciona bem com células cultivadas e primárias.

Além disso, fornecemos um recurso computacional para facilitar a exploração de dados de sequenciamento de célula única com base em gotículas. 'dropbead' pode ser prontamente usado para visualizar estatísticas básicas e parâmetros quantitativos, comparar diferentes amostras e filtrar amostras antes da análise subsequente.


Resultados

3dPCR é um primo do ddPCR comum, exceto que em vez de realizar ensaios de PCR de molécula única em gotículas de emulsão única de água em óleo, ele realiza as reações em gotículas de emulsão dupla. O benefício disso é que as emulsões duplas, ao contrário das emulsões simples, são suspensas em uma fase portadora aquosa, permitindo que sejam lidas e classificadas usando instrumentos comuns de citometria de fluxo 23. Usando reações específicas de PCR realizadas em cada gota, cada molécula da amostra é “lida” em um local específico para determinar se é uma molécula alvo. Nesse caso, o ensaio de PCR produz um sinal fluorescente que preenche a gota de encapsulação, permitindo que seja detectado e recuperado por classificação FACS. Usando TaqMan PCR com sondas de cores diferentes, o método pode ser multiplexado, para diferenciar entre moléculas que compartilham homologia parcial e classificar com base em regras combinatórias, como uma dada molécula contendo duas sequências específicas.

O objetivo do 3dPCR é permitir a detecção, quantificação e isolamento de moléculas de DNA específicas em uma amostra heterogênea. Para conseguir isso, 3dPCR encapsula DNA de uma amostra em gotículas de emulsão dupla (Fig. 1a) e realiza uma reação de PCR específica em cada gotícula interrogando as sequências alvo (Fig. 1b). Se as sequências estiverem presentes, a amplificação por PCR ocorre, gerando um sinal fluorescente que pode ser detectado no FACS (Fig. 1c) e usado para classificar e recuperar as sequências alvo (Fig. 1d). As gotículas selecionadas podem ser agrupadas e analisadas como uma mistura ou distribuídas individualmente em poços. Embora usemos técnicas de PCR padrão para detectar a amplificação, com a fluorescência SYBR ou TaqMan como a leitura, outras reações e leituras são aplicáveis, incluindo a amplificação isotérmica (MDA, LAMP, RPA) e sondas (faróis moleculares, sondas escorpião).

Uma amostra heterogênea de DNA é encapsulada em gotículas de emulsão dupla microfluidicamente (uma) e ciclado termicamente (b) Gotículas contendo a sequência alvo sofrem amplificação, produzindo um sinal fluorescente que pode ser detectado no FACS (c) e usado para quantificação e classificação (d).

Emulsões duplas 3dPCR

O 3dPCR é possibilitado pela capacidade dos dispositivos microfluídicos de formar gotículas monodispersas de uma amostra contendo uma mistura de moléculas de DNA. Ao controlar a concentração de moléculas na amostra, o número encapsulado em cada gota pode ser ajustado para moléculas individuais 24. Fundamental para o uso de emulsões duplas para detecção por PCR de moléculas alvo é a estabilização das gotículas por meio de reações de ciclo térmico. Neste trabalho realizamos isso utilizando óleos fluorados com fluorosurfactantes devido à incrível estabilidade das emulsões que eles formam, inclusive para as altas temperaturas de PCR. Usamos dois surfactantes, dependendo do ensaio de PCR conduzido nas gotículas: um surfactante Krytox de polietilenoglicol não iônico (PEG) e um surfactante Krytox iônico (Fig. 2).

Formamos emulsões duplas microfluidicamente, que são estabilizadas por um PEG-Krytox não iônico (uma) ou surfactante iônico Krytox (b) Ambos produzem gotículas extremamente estáveis ​​que sobrevivem ao ciclo térmico. No entanto, as gotículas incham durante o ciclo para equilibrar a osmolalidade do núcleo interno da gotícula com o transportador aquoso miscível (c) (Pré = pré-ciclagem térmica Pós = pós-ciclagem térmica Vuma = volume da fase aquosa da emulsão dupla Vo = volume da fase oleosa da emulsão dupla).

O surfactante não iônico compreende um grupo de cabeça PEG covalentemente ligado a duas caudas de copolímero em bloco fluorado, o PEG é solúvel em água, enquanto as caudas fluoradas são solúveis na fase oleosa de nossas emulsões 25. Quando esta molécula anfifílica se adsorve à interface água-óleo de uma gota, o grupo de cabeça de PEG reveste a superfície interna da gota de água. O PEG é eficaz na prevenção da adsorção de proteínas a interfaces hidrofóbicas, o que é importante para manter as enzimas na maior parte da gota, onde podem realizar PCR. Para detectar os produtos de amplificação das reações, adicionamos corante SYBR Green à fase portadora após a amplificação. SYBR Green torna-se fluorescente quando intercalado em DNA 26 e prontamente divide-se através da fina camada de óleo das emulsões duplas, manchando as gotículas positivas e tornando-as detectáveis ​​via FACS. As emulsões duplas formadas com este surfactante são monodispersas e sobrevivem ao ciclo térmico da PCR (Fig. 2a).

Embora o surfactante não iônico forneça boa estabilidade e permita PCR eficiente em emulsões duplas, as cascas realmente vazam para tingir as moléculas, exploramos isso para manchar gotículas positivas com SYBR pós-ciclo térmico. No entanto, esse vazamento também cria um desafio ao realizar TaqMan PCR nas gotículas: a reação usa sondas de DNA marcadas com um corante fluorescente e supressor na amplificação, a sonda é clivada, liberando o corante para fluorescência. No entanto, o corante não amarrado pode facilmente particionar através do invólucro de emulsão dupla, vazando das gotículas e resultando na perda do sinal TaqMan.

Para resgatar o sinal, devemos conter o corante, o que alcançamos introduzindo uma barreira para seu particionamento através da casca. Mudamos para o surfactante iônico Krytox que, em contraste com o surfactante PEG, prontamente adsorve proteínas para a interface da gota 25. Isso normalmente seria prejudicial para a PCR, uma vez que adsorveria as polimerases, mas também incluímos albumina de soro bovino (BSA) na gota em alta concentração. O BSA é frequentemente adicionado à PCR para aumentar a eficiência da reação 27 e, sendo uma proteína, é prontamente adsorvida à interface de gotículas estabilizadas com Krytox iônico 28,29,30. Na interface, ele forma uma "pele" que impede a absorção adicional de proteínas e fornece uma barreira para a partição das moléculas de corante liberadas 30. Isso torna as gotículas positivas do TaqMan detectáveis ​​no FACS. Este surfactante também forma gotículas de emulsão dupla monodispersas estáveis ​​à ciclagem térmica (Fig. 2b).

As gotículas de emulsão dupla, independentemente do surfactante usado, incham durante a PCR (Fig. 2c). Acreditamos que isso seja devido à partição de água e moléculas tampão através das conchas, para equilibrar as osmolaridades das fases aquosa interna e externa. A permeabilidade da casca deve, portanto, ser cuidadosamente considerada ao realizar reações em gotículas de emulsão dupla, mas também fornece um meio fácil de modular o conteúdo das gotículas pela adição de compostos à fase transportadora.

3dPCR monocromático com leitura SYBR

3dPCR, como ddPCR, pode ser usado para contar moléculas de DNA alvo em uma mistura heterogênea. Para demonstrar isso, analisamos amostras do vírus Lambda em diferentes concentrações (Fig. 3). Colocamos DNA Lambda na mistura de PCR com primers direcionados a uma parte do genoma Lambda (35.515–35.664 pb). Emulsionamos duplamente e realizamos um ciclo térmico na amostra e, em seguida, adicionamos SYBR à fase portadora para manchar as gotículas positivas (Fig. 3a). Para analisar o

5 milhões de gotas de emulsão dupla, usamos um citômetro de fluxo. As emulsões duplas são monodispersas e grandes em comparação com as células (

40 μm) e, assim, aparecem como uma nuvem compacta em alta intensidade nos canais de dispersão frontal e lateral (Fig. 3b, deixou) Detritos aparecem em eventos de dispersão mais baixos e gotículas de óleo resultantes de emulsões duplas rompidas como uma distribuição de eventos de dispersão lateral baixa e alta. Emulsões duplas grandes e multicores são ocasionalmente produzidas pelo fabricante de gotas microfluídicas e aparecem como uma população de dispersão lateral e frontal relativamente estreita e muito alta. Com base nas contagens de eventos para as populações de dispersão lateral e frontal, cerca de 75% sobrevivem ao ciclo térmico e à detecção de FACS. Para analisar a população de emulsão dupla de núcleo único, colocamos a nuvem correspondente nos canais de dispersão (círculo vermelho) e plotamos a fluorescência desta subpopulação (Fig. 3b, direito) Observamos duas populações no canal de fluorescência, uma fraca correspondendo a gotículas negativas desprovidas do alvo, e uma brilhante correspondendo a gotículas contendo o alvo. Para medir a concentração alvo na amostra, calculamos a proporção de gotículas escuras e brilhantes, normalizando por volume para converter em unidades de concentração. Realizamos esta análise em seis amostras variando na concentração do vírus Lambda por

5 ordens de magnitude e descobrir que, como esperado, a fração de gotas brilhantes escala em proporção à concentração de entrada (Fig. 3c).

O DNA do vírus lambda é misturado com primers direcionados ao vírus e reagentes de PCR, formados em emulsões duplas, termicamente ciclados e corados com verde SYBR (uma) As gotículas são processadas por meio de FACS, bloqueado na dispersão para descartar todos os eventos de emulsão dupla não-single-core, o restante para os quais são plotados para valores de fluorescência (b) Seis amostras com diferentes concentrações de vírus Lambda são processadas e quantificadas, demonstrando que, como esperado, a proporção de gotículas fluorescentes escala com a concentração de entrada do vírus Lambda, de acordo com as estatísticas de encapsulamento de Poisson (c).

3dPCR multiplexado com uma leitura TaqMan

A PCR TaqMan aumenta a especificidade da PCR convencional usando uma sonda TaqMan para gerar a leitura de fluorescência. Somente se os produtos de amplificação forem homólogos à sequência da sonda TaqMan, o sinal fluorescente será gerado, reduzindo falsos positivos devido à amplificação não específica 31. O TaqMan PCR também permite que a reação seja multiplexada usando corantes de cores diferentes para marcar as sondas, para interrogar por várias sequências de DNA na amostra simultaneamente. Isso nos permite, por exemplo, distinguir entre gotículas contendo uma única sequência e outras contendo várias sequências. Para ilustrar isso, colocamos os genomas do vírus Lambda em uma amostra de ΦX174 genomas do vírus, variando a concentração do vírus Lambda ao longo

5 ordens de magnitude, mantendo o de ΦX174 fixo. Analisamos a amostra com 3dPCR usando ensaios TaqMan direcionados ao vírus Lambda (corante verde) e ΦX174 (corante vermelho) (Fig. 4a). Os genomas Lambda e ΦX174 são encapsulados aleatoriamente nas gotículas, de modo que esperamos quatro populações, gotículas desprovidas de ambos os alvos (dim), com um alvo (verde puro ou vermelho) e com ambos os alvos (amarelo).

Lambda- e DNA de vírus ϕX174 são misturados e combinados com primers e sondas TaqMan direcionadas a ambos os vírus. As amostras são formadas em emulsões duplas e termicamente cicladas (uma) As gotículas são processadas por meio de FACS, bloqueado na dispersão para descartar todos os eventos de emulsão dupla de núcleo não único, o restante para os quais são plotados para valores de fluorescência (b) Quatro populações fluorescentes são observadas, correspondendo às quatro combinações possíveis de Lambda e encapsulamento de vírus ϕX174. Seis amostras com diferentes concentrações de vírus Lambda com condições constantes de vírus ϕX174 são processadas e quantificadas, demonstrando que, como esperado, a proporção de ϕX174 gotas positivas é inalterada entre as amostras, mas a do vírus Lambda é dimensionada com a concentração de entrada, de acordo com Poisson estatísticas de encapsulamento (curva tracejada) (c).

Analisamos as gotículas com FACS e novamente bloqueamos a população de dispersão correspondente às emulsões duplas (Fig. 4b, deixou) Representamos graficamente a fluorescência vermelha e verde desta subpopulação e observamos os quatro grupos esperados (Fig. 4b, direito) Como os ensaios TaqMan produzem sinais "binários" nos quais as gotas positivas se agrupam e não se sobrepõem às gotas negativas, o número de eventos detectados em cada cluster é insensível à posição exata dos limites de passagem. Assim como no experimento de uma cor, a proporção de gotículas positivas e negativas que caem nas diferentes populações pode ser usada para estimar as concentrações dos diferentes genomas virais na amostra mista, em uma ampla faixa dinâmica (Fig. 4c). Isso mostra que 3dPCR com uma leitura TaqMan pode quantificar várias espécies de DNA em uma amostra simultaneamente. Além disso, permite que casos específicos em que dois alvos diferentes estão presentes na mesma gota sejam identificados (gotas amarelas, Fig. 4a). Isso não é possível com qPCR convencional e é útil para correlacionar diferentes sequências juntas, por exemplo, para caracterizar os comprimentos de moléculas de DNA com base na presença de sequências a distâncias definidas umas das outras 32,33 para caracterizar eventos de recombinação com base na presença de diferentes combinações de sequências dentro de uma única molécula 34 e para caracterizar associações combinatórias de moléculas distintas dentro de uma mesma entidade, como o DNA de vírus com genomas segmentados 35,36 ou a probabilidade de um patógeno específico infectar um determinado hospedeiro. Essas associações, normalmente, só são mensuráveis ​​com sequenciamento de DNA, mas 3dPCR fornece uma alternativa rápida e barata

Classificando moléculas de DNA individuais com FACS

3dPCR permite que um instrumento FACS "leia" uma sequência de DNA alvo usando um ensaio de PCR. No entanto, o FACS é capaz de mais do que detecção, ele também pode classificar com base na medição.Isso, em essência, permite que uma população mista de moléculas de DNA seja interrogada individualmente, para recuperar todas as moléculas que correspondem ao critério de ensaio de PCR, e também fornece uma nova maneira de enriquecer o DNA que oferece vantagens substanciais sobre os métodos convencionais baseados em PCR comum ou captura de oligo. Para demonstrar essa capacidade, classificamos as amostras de DNA usando 3dPCR. Nós colocamos o DNA do vírus Lambda em um fundo de S. cerevisiae DNA genômico e classificar a amostra com sondas TaqMan direcionadas a Lambda (Fig. 5a, deixou) As gotículas de emulsão dupla classificadas são TaqMan positivas, embora também haja muitas gotículas de óleo (Fig. 5a, direito) As gotículas de óleo são resquícios de emulsões duplas que explodem durante a detecção de FACS, rompidas pelas taxas de cisalhamento geradas pelo espaçamento do fluxo da bainha e pelas forças geradas pela classificação. Com base nos tamanhos de população de dispersão e imagens de gotículas classificadas, estimamos

40% das emulsões duplas sobrevivem através das etapas de PCR e FACS. A ruptura da dupla emulsão durante o FACS pode ser mitigada reduzindo o tamanho da dupla emulsão, aumentando o tamanho do bico do FACS e processando as gotas mais lentamente.

Lambda DNA é adicionado a S. cerevisiae DNA genômico na concentração de 1: 100, e processado através de (uma) 3dPCR (esquerda) e FACS (direita). Algumas emulsões duplas estouram durante o FACS, deixando para trás pequenas gotas de óleo na população classificada. Nós quantificamos o enriquecimento usando qPCR com primers direcionados a uma região do S. cerevisiae genoma e uma região diferente do genoma Lambda que foi amplificado na reação 3dPCR. Com base nas mudanças da curva, estimamos que a proporção de Lambda-para-S. cerevisiae O DNA aumenta em 83 vezes por classificação (b) O campo claro e a fluorescência são sobrepostos nessas imagens.

Para confirmar o enriquecimento obtido pela classificação das emulsões duplas, usamos qPCR, analisando as amostras classificadas e não classificadas com primers que visam uma região diferente do genoma Lambda e uma região do S. cerevisiae genoma (Fig. 5b). Os primers do vírus Lambda amplificam um pouco mais cedo na amostra classificada do que na não classificada (Fig. 5b, topo), embora a quantidade total de DNA seja a mesma, indicando que a classificação aumenta o número de genomas do vírus Lambda. Por outro lado, o S. cerevisiae os primers amplificam muito mais tarde na amostra classificada do que na não classificada, indicando que S. cerevisiae O DNA foi fortemente enriquecido por classificação (Fig. 5b, parte inferior). Com base nas mudanças da curva qPCR, estimamos a proporção de Lambda-para-S. cerevisiae O DNA mudou por um fator de 83, o que está próximo da expectativa teórica baseada no encapsulamento de Poisson das moléculas para nossa taxa de carregamento de gotículas lambda-positivas a 1%. Razões de enriquecimento mais altas podem ser alcançadas diluindo ainda mais a amostra, reduzindo a quantidade de S. cerevisiae DNA encapsulado nas gotas positivas, no entanto, isso também reduz a frequência de gotas positivas, necessitando de mais classificação para recuperar o mesmo número de eventos positivos. Isso demonstra que 3dPCR é um meio eficaz de separar o DNA alvo de uma amostra mista com FACS.

Distribuição de tamanho de DNA classificado

Uma vantagem do 3dPCR sobre outros métodos de enriquecimento de DNA é que ele permite que moléculas & gt100 Kbp de comprimento sejam recuperadas usando apenas

100 pb de sequência de identificação TaqMan. Para ilustrar isso, medimos os comprimentos das moléculas detectadas e recuperadas via 3dPCR com um ensaio multiplexado. Incluímos em cada gota vermelha (Cy5) e verde (FAM) sondas TaqMan direcionadas ao cromossomo XIV de levedura a distâncias definidas um do outro. Se uma gota contiver uma molécula de DNA mais curta do que a distância de separação das sondas, as gotas serão vermelhas ou verdes puras (Fig. 6a, à esquerda). Se, no entanto, o fragmento for maior do que a distância de separação, a gota pode ser duplamente positiva (amarela), o que nos permite estimar a fração de moléculas na amostra que estão acima do comprimento de separação contando o número de eventos positivos via citometria de fluxo (Fig. 6a, direita). Repetindo o experimento para pares de sondas vermelhas e verdes no aumento da separação (Fig. 6b), podemos estimar a distribuição do comprimento das moléculas na amostra.

S. cervisiae (levedura) o DNA genômico é encapsulado em emulsões duplas com conjuntos de iniciador / sonda Cy5 e iniciador / sonda FAM (uma) Os conjuntos de iniciador / sonda são separados por 10 Kbp a 500 Kbp ao longo do genoma de levedura (b) Após o ciclo térmico, as gotículas são fotografadas (c) e intensidades de fluorescência medidas com citometria de fluxo. Conforme a distância entre as sondas aumenta, a fração de gotículas duplamente positivas diminui, indicando que as moléculas longas são mais raras do que as moléculas curtas devido à fragmentação do DNA (d) Para confirmar isso, classificamos o DNA com uma única sonda FAM e interrogamos o comprimento da molécula com qPCR (e) com sondas secundárias a distâncias crescentes da sonda de classificação (f) Após a ciclagem térmica, gotículas positivas esparsas são evidentes (g) que são recuperados e analisados ​​(h) A classificação com qPCR confirma os resultados multiplexados mostrando que as moléculas longas são mais raras do que as curtas, mas que moléculas de até 500 Kbp estão presentes na amostra. Essas moléculas podem ser recuperadas por classificação usando um ensaio TaqMan multiplexado visando os dois extremos desta região.

Após a ciclagem térmica, as gotículas obtêm uma fluorescência que depende do número de sequências alvo que contêm, conforme mostrado pela imagem representativa na Fig. 6c. Repetindo isso para todos os pares de sondas, descobrimos que a fração de duplo-positivos é inversamente proporcional à distância de separação entre as sondas (Fig. 6d). Isso indica que moléculas longas estão presentes, mas são mais raras do que moléculas curtas. Com base nas frações 3dPCR, estimamos que 3% das moléculas têm comprimento & gt100 Kbp.

Como uma confirmação adicional dos comprimentos das moléculas obtidas por 3dPCR, realizamos um experimento no qual usamos uma única sonda para detectar o cromossomo XIV de levedura e FACS para recuperar essas moléculas, que são então interrogadas via qPCR (Fig. 6e). A sonda de detecção está centrada na posição 550 Kbp no cromossomo XIV da levedura, de modo que a maioria das moléculas recuperadas deve estar na posição 500–600 Kbp. Para confirmar isso, geramos quatro conjuntos de sondas qPCR em diferentes posições no cromossomo XIV de levedura (Fig. 6f). O DNA genômico da levedura é encapsulado em emulsões duplas e termociclado, gerando ocorrências de gotículas positivas (Fig. 6g). Instruímos o instrumento para recuperar essas gotículas e extrair os modelos de DNA e analisá-los com qPCR (Fig. 6h). Descobrimos que os conjuntos de sondas perto da sonda de detecção amplificam em ciclos baixos, enquanto os mais distantes amplificam em ciclos altos (Fig. 6h, inserção), indicando que fragmentos curtos são mais prevalentes do que fragmentos longos na amostra classificada. Usando os dados de qPCR, estimamos o número de moléculas modelo presentes na amostra em um determinado comprimento com base no valor de limiar cruzado dos traços de PCR e novamente descobrimos que moléculas longas são mais raras do que moléculas curtas, mas que uma fração significativa de moléculas longas estão presentes, mesmo até 500 Kbp. Isso confirma os resultados de nossos experimentos multiplexados. Além disso, o 3dPCR permite que moléculas acima de um comprimento alvo sejam recuperadas por classificação usando várias sondas TaqMan separadas por esse comprimento, o que permite a recuperação de modelos com centenas de quilobases de comprimento.


Parte 2: Comportamento Multifásico Líquido do Núcleo

00: 00: 15.09 Oi.
00: 00: 16.21 Meu nome é Cliff Brangwynne, da Universidade de Princeton e HHMI,
00: 00: 19.20 e estou feliz em falar sobre
00: 00: 22.24 algum trabalho no comportamento do líquido multifásico
00: 00: 25,18 do nucléolo.
00: 00: 27.09 Então, estivemos discutindo esses corpos nucleares sem membrana
00: 00: 32.04 na primeira aula,
00: 00: 33.21 e estou particularmente interessado nesses tipos de estruturas,
00: 00: 37.13 esses condensados ​​dentro do contexto do núcleo das células.
00: 00: 43,13 É importante ter em mente que
00: 00: 45,22 o núcleo do. da célula.
00: 00: 47.10 que é a sede do genoma,
00: 00: 49.11 e toda a organização que ocorre
00: 00: 51.20 dentro do núcleo está inteiramente na ausência
00: 00: 54.09 de qualquer organização semelhante a uma vesícula ligada à membrana.
00: 00: 59.17 Então, esses corpos nucleares sem membrana
00: 01: 02.18 são realmente estruturas-chave
00: 01: 05.26 para organizar o conteúdo do núcleo
00: 01: 07.19 e organizando o genoma e a expressão gênica.
00: 01: 09.18 Eles incluem estruturas como nucléolos que serão o foco desta palestra
00: 01: 13.07 outras coisas, como transcricional.
00: 01: 15.29 essas fábricas de transcrição que estão regulando
00: 01: 18,21 expressão de genes individuais
00: 01: 21.15 esses corpos PML, que também estão desempenhando papéis
00: 01: 23,29 no fluxo de informações genéticas
00: 01: 25.18 ou corpos de Cajal e Snurposomes,
00: 01: 28.11 envolvido no splicing, novamente, na regulação do gene.
00: 01: 30.27 Então, gostaríamos de tentar entender
00: 01: 33.26 como essas estruturas se formam e qual o papel que desempenham
00: 01: 36,28 na expressão gênica e na organização do genoma.
00: 01: 40,26 Então, nucléolo, ou nucléolo.
00: 01: 44.24 e seu plural é nucléolos.
00: 01: 47.12 essas são estruturas realmente fascinantes.
00: 01: 48.26 Eles são conhecidos há mais de 150 anos.
00: 01: 51.26 São uma das primeiras coisas que os primeiros microscopistas viram
00: 01: 54.18 quando olharam para as células,
00: 01: 56.23 por exemplo, células humanas como essas células HeLa.
00: 02: 01.24 Então, os nucléolos são os escuros.
00: 02: 04.12 grandes oclusões escuras dentro do núcleo
00: 02: 06,21 dessas células individuais.
00: 02: 09.01 Eles são realmente interessantes em pensar sobre
00: 02: 12.29 este fluxo de informação genética do DNA para o RNA para a proteína
00: 02: 16,21 porque eles estão parados em sites
00: 02: 19.18 onde há uma transcrição ativa dos genes do RNA ribossômico.
00: 02: 23.19 Então, eles são muito importantes para a transcrição do RNA ribossômico,
00: 02: 27.15 e o ribossomo é a máquina que realmente faz a proteína,
00: 02: 30.05 em última análise, no citoplasma,
00: 02: 32.06 então eles também são importantes para esta etapa do RNA para a proteína.
00: 02: 35.17 E assim, a maneira como pensamos sobre o nucléolo
00: 02: 38.08 é este condensado sem membrana
00: 02: 40.29 que está ajudando a facilitar
00: 02: 43.22 as inúmeras reações necessárias
00: 02: 46.18 para processar esses transcritos de RNA ribossomal
00: 02: 49.16 para finalmente formar essas partículas pré-iribossômicas maduras
00: 02: 54.23 e, finalmente, o ribossomo, esta máquina de tradução de proteínas.
00: 02: 59.13 Então, começamos a pensar sobre o nucléolo, você sabe,
00: 03: 04.07 logo após os estudos iniciais que fizemos nos grânulos P
00: 03: 06.09 que te falei na última palestra.
00: 03: 08,05 O nucléolo.
00: 03: 11.11 você sabe, como este grande condensado sem membrana,
00: 03: 13.03 estávamos nos perguntando se.
00: 03: 15,26 se, você sabe, pudesse ser pensado como um conjunto separado da fase líquida
00: 03: 18,25 nas células.
00: 03: 20.23 Então, um pós-doutorado em meu laboratório, Steph Weber,
00: 03: 22.21 que agora é um membro do corpo docente da Universidade McGill,
00: 03: 25.20 comecei a lidar com essa questão usando C elegans como um sistema modelo.
00: 03: 28.21 E este filme mostra ciclos de montagem e desmontagem
00: 03: 32,28 dos núcleos individuais
00: 03: 36.04 dentro do embrião em desenvolvimento de C. elegans.
00: 03: 39.07 E o que você vê é que as proteínas nucleolares
00: 03: 42.06 estão se condensando fora do nucleoplasma
00: 03: 44.21 em muitas dessas gotículas,
00: 03: 46.25 e, em seguida, a resolução final em torno dos dois sites em C elegans
00: 03: 50.15 onde o RNA ribossomal está sendo transcrito ativamente.
00: 03: 53,28 E então, trabalhe com Steph
00: 03: 56.19, bem como nossos colaboradores, Mikko Haataja e Joel Berry,
00: 03: 59.22 levou a um mapeamento onde pudemos mostrar que
00: 04: 05.22 a dinâmica da montagem do nucléolo é.
00: 04: 08.22 pode ser bem descrito usando
00: 04: 13.00 teorias clássicas de separação de fases,
00: 04: 15.09 em particular este formalismo de Cahn-Hilliard,
00: 04: 17,16 que é uma espécie de a. uma forma de descrever,
00: 04: 20.19 o que é a difusão ascendente que é.
00: 04: 22,26 que é necessário para a separação de fases
00: 04: 25.04 para superar aquele efeito entrópico de que falamos
00: 04: 28,12 na última aula.
00: 04: 29,24 Então, nucléolos realmente são, você sabe,
00: 04: 32,27 um tipo de condensado líquido.
00: 04: 38.03 E, na verdade, o primeiro estudo que fizemos foi neste sistema de oócitos de rã
00: 04: 39,28 para olhar para esses nucléolos
00: 04: 42.04 e começar a fazer esse tipo de pergunta
00: 04: 44.19 sobre o que são como objetos biofísicos
00: 04: 46,24 e como pensar sobre sua montagem e estrutura e assim por diante.
00: 04: 51.01 Xenopus laevis é um sistema realmente poderoso.
00: 04: 55.01 É um. é um. forma um oócito, ou um ovo,
00: 04: 58,28 que está pronto para ser fertilizado. quando.
00: 05: 02.25 é muito grande. Então, tem cerca de um milímetro de tamanho.
00: 05: 06.12 Ele contém um único núcleo grande que também é bastante grande -
00: 05: 10.15 tem cerca de 600 mícrons de diâmetro.
00: 05: 12.22 E dentro deste grande núcleo,
00: 05: 15.15, existem inúmeras
00: 05: 17,19 - na verdade, centenas ou até mil -
00: 05: 19.15 nucléolos, que você pode ver nessas gotículas individuais.
00: 05: 22.12 estruturas que parecem gotículas no interior.
00: 05: 25.09 E então, este foi um sistema poderoso para nós
00: 05: 28.03 porque poderíamos realmente começar a interrogar essas propriedades biofísicas
00: 05: 31.28 dentro deste grande núcleo que contém muitos nucléolos.
00: 05: 36.03 E o que mostramos foi que esses nucléolos.
00: 05: 38.04 quando os colocamos juntos, eles se fundem
00: 05: 40.09 se começarmos a separá-los,
00: 05: 42.16 eles realmente passarão por esses eventos de ruptura da ponte líquida,
00: 05: 44.14 que você vê neste filme.
00: 05: 46.07 E isso nos permitiu começar a medir
00: 05: 49,03 as propriedades, a viscosidade e a tensão superficial,
00: 05: 51.24 dessas estruturas para realmente mostrar que eram semelhantes a líquidos,
00: 05: 55.11 mas há uma reviravolta interessante nisso,
00: 05: 57.14 que é essa liquidez, essa fluidez,
00: 06: 00.14 é dependente de processos biológicos de não equilíbrio
00: 06: 05.19 que ocorrem em toda a célula.
00: 06: 08.29 E então, isso está mostrando que se nós.
00: 06: 11.13 se esgotarmos a célula de ATP,
00: 06: 14.02 que é uma espécie de bateria do celular,
00: 06: 16.01 então a viscosidade aparente dessas estruturas
00: 06: 18.25 aumenta significativamente.
00: 06: 20.26 Portanto, parece haver características de dinâmica de não equilíbrio
00: 06: 23,24 que regulam a fluidez dessas estruturas,
00: 06: 26.06 e nós. é por isso que nos referimos a eles como líquidos ativos,
00: 06: 28.16 uma espécie de condensado líquido ativo.
00: 06: 32.03 Com o espírito de fazer a pergunta mais simples
00: 06: 35.02 que podemos pensar ao iniciar nossa pesquisa,
00: 06: 39.05 aqui fizemos a pergunta,
00: 06: 41.00 se forem realmente líquidos.
00: 06: 45.00 se forem condensados ​​líquidos dentro do núcleo desta rã.
00: 06: 50.08 deste oócito de rã,
00: 06: 53,23 então por que eles não se fundem em uma única estrutura maior?
00: 06: 57.06 Por que eles permanecem como gotículas distintas,
00: 06: 59,23 quando mostrei que se. você sabe, se nós os empurrarmos juntos,
00: 07: 02.12 eles parecem se fundir prontamente?
00: 07: 04.00 Então, por que eles não estão todos se fundindo em uma gota grande?
00: 07: 06.08 E isso é um. aquilo é um. claramente, uma pergunta muito simples,
00: 07: 10.14 e acho que é poderoso, e nos levou a alguns caminhos interessantes.
00: 07: 14.15 Então, ao tentar responder a essa pergunta,
00: 07: 18.09 Quero apresentar-lhe algumas ideias muito fundamentais
00: 07: 20.24 que são importantes em muitas áreas da biologia celular.
00: 07: 24.08 É importante pensar neles.
00: 07: 27.02 Então, o movimento browniano foi descrito pela primeira vez
00: 07: 30.24 por Robert Brown neste clássico
00: 07: 33.20 e muito interessante, papel altamente recomendado
00: 07: 36,09 de 1828.
00: 07: 38.08 Então, neste artigo, ele descreve o movimento aleatório das partículas de pólen
00: 07: 44.05 e outros tipos de partículas dentro de uma célula,
00: 07: 46.11 e a forma como realizam um passeio aleatório
00: 07: 49,29 quando visto no microscópio.
00: 07: 52.24 O papel é realmente fascinante por uma série de razões.
00: 07: 55.05 Uma delas é que ele está claramente muito desapontado
00: 07: 57.13 quando descobre que o movimento que vê é.
00: 08: 02.07 na verdade não tem nada a ver com a vida,
00: 08: 04.28 no sentido de que mesmo, você sabe,
00: 08: 07.13 pedaços triturados de quartzo e outros materiais mortos
00: 08: 10.21 submetem-se ao movimento browniano.
00: 08: 12.19 E então, ele estava muito chateado com isso.
00: 08: 14.11 Claro, é risível agora,
00: 08: 17.03 porque agora reconhecemos isso como um conceito absolutamente fundamental
00: 08: 19.21 que é importante não apenas para materiais não vivos
00: 08: 22.02, mas também dentro da célula.
00: 08: 25.09 E então, estes são.
00: 08: 28.03 este é um filme de partículas que estão passando por esse movimento browniano,
00: 08: 32.01 essas flutuações térmicas aleatórias
00: 08: 34,16 em uma solução de água.
00: 08: 37,27 E então, a ideia aqui é que a energia aleatória é.
00: 08: 43.00 pode-se pensar nisso como.
00: 08: 45,21 kT de energia, aquela escala de energia térmica de que falamos antes,
00: 08: 48.06 está chutando essas partículas
00: 08: 51.04 e fazendo com que eles passem por um processo aleatório. um passeio aleatório.
00: 08: 53.28 Agora, há alguns recursos matemáticos interessantes
00: 08: 56,24 da maneira como isso funciona
00: 08: 59.02 que quero chamar a sua atenção.
00: 09: 00.25 Em primeiro lugar, o movimento browniano é diferente do movimento dirigido.
00: 09: 05.01 Portanto, o movimento dirigido é. se você está andando em linha reta
00: 09: 08.02 ou se você estiver dirigindo,
00: 09: 10,23 você sabe, em uma rodovia reta
00: 09: 12,29 e você está apenas dirigindo.
00: 09: 15.01 Então, em movimento dirigido, podemos pensar.
00: 09: 18.00 se estivermos nos movendo a uma velocidade constante ou velocidade,
00: 09: 20,24 se nós. se passarmos o dobro do tempo,
00: 09: 25.29 então percorremos o dobro da distância.
00: 09: 28.15 Isso faz sentido -
00: 09: 31.01 você sabe, você senta no carro o dobro do tempo, você se move na mesma velocidade,
00: 09: 33.20 você foi o dobro.
00: 09: 35.14 E então, se eu perguntasse sobre o quadrado desta quantidade
00: 09: 38.11 - qual é o quadrado do deslocamento? -
00: 09: 41,04 então eu diria, ok, bem, eu apenas elevo ao quadrado ambos os lados desta equação,
00: 09: 45.02 e eu tenho algum prefator v-quadrado
00: 09: 47,02 e então tenho o tempo ao quadrado,
00: 09: 49.00 e isso faz todo o sentido.
00: 09: 50.25 Então, se eu, você sabe, esperar o dobro do tempo,
00: 09: 53,04 então o quadrado da distância deve ser.
00: 09: 55.06 você sabe, deveria ser quatro vezes maior.
00: 09: 58,23 Agora, o que é interessante é para o movimento difusivo
00: 10: 01.07 o quadrado da distância é.
00: 10: 03.04 não é como o quadrado do tempo,
00: 10: 05.04, mas só ocorre linearmente com o tempo.
00: 10: 07,23 Então, isso é muito interessante.
00: 10: 10,03 Se eu esperar o dobro do tempo, não espero.
00: 10: 12.01 você sabe, esta quantidade, este delta-x-quadrado,
00: 10: 15.00 não é um fator quatro a mais.
00: 10: 17,10 É apenas um fator de dois a mais.
00: 10: 19,22 E assim, o prefator aqui é chamado de coeficiente de difusão.
00: 10: 22,21 É algo como a velocidade, mas um pouco diferente.
00: 10: 27.04 Tem unidades diferentes.
00: 10: 30.01 Em geral, esta ideia, porém,
00: 10: 32.08 que o movimento dirigido tem o. o significado.
00: 10: 35.16 o deslocamento médio ao quadrado, delta-x-quadrado indo como o tempo ao quadrado,
00: 10: 38,28 versus movimento difusivo, onde simplesmente passa como o tempo.
00: 10: 42.14 você pode ter algo intermediário em alguns casos.
00: 10: 44.12 Então, em geral, escreveríamos o quadrado do deslocamento
00: 10: 48.08 vai como o tempo para algum poder, alfa,
00: 10: 50.22 que chamaremos de expoente difusivo.
00: 10: 53,07 Então, o que costumamos fazer é levar filmes
00: 10: 55,23 como o que você viu aqui com as contas
00: 10: 57,21 e, em seguida, plote o quadrado do deslocamento -
00: 11: 00.01 deslocamento médio ao quadrado, ou MSD -
00: 11: 02.13 neste gráfico de registro. gráfico log-log,
00: 11: 05.19 e a inclinação, então, é este expoente difusivo.
00: 11: 08,21 Então, você pode ver. estes são na verdade dados de um filme
00: 11: 11,16 assim como aquele aqui,
00: 11: 13,16 e você pode ver que o deslocamento médio ao quadrado
00: 11: 15,24 é linear em função do tempo neste gráfico log-log,
00: 11: 18.10 e isso diz que o expoente difusivo é 1,
00: 11: 20,27 que é exatamente o que esperamos para o.
00: 11: 22.25 você sabe, pela descrição simples da difusão browniana.
00: 11: 26.01 Portanto, é importante manter essas ideias em mente
00: 11: 28.04 no que vou dizer a seguir
00: 11: 30.25 porque o que tentamos fazer neste sistema
00: 11: 33,21 ao abordar a questão
00: 11: 37.01 do motivo pelo qual todas essas gotículas não se fundem umas com as outras
00: 11: 40.02 é que perguntamos, podemos introduzir partículas de sonda
00: 11: 43.16 para o núcleo desta célula e pergunte,
00: 11: 46.04 eles estão livres para se movimentar?
00: 11: 48.00 Então, como pequenas sondas do meio ambiente,
00: 11: 50.08 algo como as gotas,
00: 11: 52.22 e perguntando se eles estão livres para se movimentar.
00: 11: 55,26 A isso chamamos de microrreologia.
00: 11: 57.14 Esse é um termo. reologia é o estudo do comportamento de fluxo e deformação em materiais.
00: 12: 03.21 Microrreologia é isso, apenas em escala microscópica.
00: 12: 05.25 Então, um estudante de graduação muito talentoso no meu laboratório,
00: 12: 07.24 que agora é pós-doutorado em NIH, Marina Feric,
00: 12: 10.13 injetou pequenas partículas de sonda no núcleo.
00: 12: 14,14 Então, essas são pequenas contas inertes,
00: 12: 17,15 contas microscópicas,
00: 12: 19.14 que ela injetou no núcleo,
00: 12: 21.28 e perguntou, essas contas estão livres para se espalhar ao redor ou não?
00: 12: 23,24 Eles são limitados de alguma forma?
00: 12: 25,26 E então, o que Marina encontrou foi.
00: 12: 28.07 você sabe, nos estudos iniciais, ela disse,
00: 12: 30,23 bem, eles não parecem particularmente restritos.
00: 12: 32.19 Se eu colocar partículas muito pequenas.
00: 12: 34.11 são esferas de 0,2 mícron / 200 nanômetro
00: 12: 37.11 injetado neste núcleo, neste GV, ou vesícula germinativa,
00: 12: 40.10 o que ela descobriu é que as contas realmente parecem ser
00: 12: 44.08 dançando e passando pelo que realmente parece ser o movimento browniano.
00: 12: 47.02 Então, eles parecem bem livres para se moverem.
00: 12: 48,28 Então, isso no início foi surpreendente.
00: 12: 51.06 Dissemos, bem, se isso está acontecendo, então por que não são estes.
00: 12: 53.25 você sabe, esses condensados ​​líquidos se espalhando por aí também?
00: 12: 57.15 E dissemos, bem, vamos olhar para contas de tamanhos diferentes
00: 13: 00.08 e pergunte o que acontece.
00: 13: 02,23 Então, novamente, no.
00: 13: 05.12 se eu plotar o deslocamento médio ao quadrado dessas contas muito pequenas,
00: 13: 07.10 assim como o que eu mostrei antes,
00: 13: 09.16 você vê que há essa dependência linear do tempo,
00: 13: 12,05 então o expoente difusivo aqui eu chamaria de 1.
00: 13: 14,17 Mas à medida que vamos para tamanhos de grânulos cada vez maiores,
00: 13: 18.11 o que você vê é que o expoente diminui.
00: 13: 20.07 Então, a inclinação da curva desce e desce e desce.
00: 13: 24,22 E assim, parece haver uma restrição crescente
00: 13: 27.16 sobre o movimento das partículas
00: 13: 30.04 conforme chegamos a tamanhos de partículas cada vez maiores.
00: 13: 31,26 E você pode ver que aqui na posição os traços das contas.
00: 13: 35.29 As pequenas contas realmente passam pelo movimento browniano,
00: 13: 39.00 difundindo ao redor.
00: 13: 40.14 E você chega às partículas maiores,
00: 13: 42.01 vemos esta intermitência, onde eles parecem estar pulando,
00: 13: 43,24 talvez entre os poros, se quiser,
00: 13: 45.14 e as partículas maiores estão realmente começando a ficar altamente restritas
00: 13: 49,19 dentro do núcleo.
00: 13: 51.16 E então, se eu plotar a inclinação dessas curvas,
00: 13: 54.15 aquele expoente difusivo,
00: 13: 56,27 em função do tamanho das partículas,
00: 13: 58.25 Vejo um rastro muito claro.
00: 14: 03.08 Então, vai de um expoente difusivo próximo a 1,
00: 14: 05.06 perto da difusão simples, para pequenas partículas,
00: 14: 08.07 mas para partículas maiores diminui, então.
00: 14: 11.10 novamente, consistente com algum tipo de restrição no movimento das partículas
00: 14: 16.23 uma vez que são maiores do que um determinado tamanho,
00: 14: 17.16 que, você sabe, é algo como algumas centenas de nanômetros / 0,2 mícrons.
00: 14: 23.01 Então, começamos a pensar sobre isso.
00: 14: 26.09 Então, parece que as partículas estão restritas
00: 14: 29.00 por alguma rede que tem uma escala de tamanho
00: 14: 32.15 que são algumas centenas de nanômetros.
00: 14: 34.20 Na verdade, os dados que obtivemos aqui.
00: 14: 37.05 neste sistema se parece muito com alguns dados
00: 14: 39.17 que outras pessoas viram ao observar um movimento semelhante do talão
00: 14: 43,27 em redes purificadas
00: 14: 46,24 que são reconstituídos a partir da proteína actina
00: 14: 50.09 e os filamentos que formam a actina.
00: 14: 52.01 Então, a actina forma essas lindas redes filamentosas.
00: 14: 54.19 E se você colocar partículas lá, você verá realmente o mesmo tipo de coisa,
00: 14: 58.04 onde se as partículas forem grandes comparadas
00: 15: 02,05 para o espaçamento médio entre os filamentos,
00: 15: 05.15 então o movimento é altamente restrito
00: 15: 07.11 - você pode ver isso aqui neste preto.
00: 15: 09,23 esta curva preta na parte inferior -
00: 15: 11,17 e se as partículas forem muito menores
00: 15: 14.03 do que o tamanho médio da malha da rede,
00: 15: 16.09 então você tem algo que parece movimento difusivo,
00: 15: 18,22 como você pode ver nesta curva superior.
00: 15: 23.05 Também vemos nestes dados a intermitência
00: 15: 25,23 de pular entre os diferentes estados.
00: 15: 27,24 Então, começamos a nos perguntar, bem,
00: 15: 30.11 talvez haja uma rede citoesquelética como a actina
00: 15: 34.14 que está dentro do núcleo.
00: 15: 36.04 E isso seria um pouco surpreendente,
00: 15: 38.29 porque a actina é bem conhecida no citoplasma
00: 15: 41.05, mas geralmente não é considerado tão importante estruturalmente dentro do núcleo.
00: 15: 45.21 E então, começamos a nos perguntar sobre isso.
00: 15: 47,28 É possível que o movimento dessas contas
00: 15: 49.19 é restringido por algum tipo de rede
00: 15: 53.14 - talvez seja até uma rede de actina nuclear -
00: 15: 56,08 dentro deste. dentro deste núcleo?
00: 15: 58.15 E então, a imagem, então,
00: 16: 01.02 seria que as pequenas contas são capazes de se mover
00: 16: 04.02 nos interstícios, mas as contas grandes estão meio que presas nesta rede.
00: 16: 07.05 Então, tentamos testar essa ideia.
00: 16: 09.24 E o principal experimento foi então,
00: 16: 12.18 bem, vamos tentar destruir a rede de actina
00: 16: 15.12 e veja o que acontece com o movimento dessas contas.
00: 16: 17.26 E então, fizemos aquele experimento,
00: 16: 20.08 e se esta fosse uma audiência ao vivo, eu poderia perguntar ao público,
00: 16: 23,14 você sabe, o que você esperaria.
00: 16: 25,28 Então, o que você esperava? Você pode refletir por um momento.
00: 16: 29.04 Se você tem ouvido os últimos slides,
00: 16: 31.01 então você diria, bem, o expoente difusivo
00: 16: 33,16 deve ser 1 se for uma difusão simples.
00: 16: 35,22 Então, se eu for uma rede de actina
00: 16: 37.27 e eu iríamos acabar com a rede de actina,
00: 16: 40,07 então esta curva deve basicamente subir até 1.
00: 16: 43.02 Todos esses pontos devem estar acima de um expoente difusivo de 1.
00: 16: 46.06 Então, fizemos esta experiência.
00: 16: 49.09 Acontece que há várias maneiras de interromper
00: 16: 52.20 uma rede actina, e tentamos todos eles.
00: 16: 55.23 E o que vimos de forma muito consistente foi em todos os casos
00: 17: 00.03 o movimento do cordão agora exibia um expoente difusivo
00: 17: 03.16 que era consistente com difusão simples
00: 17: 06.03 na ausência de qualquer restrição elástica.
00: 17: 09.18 Então, todas as contas, agora,
00: 17: 10.21 foram capazes de se difundir livremente dentro deste núcleo.
00: 17: 14.22 Então, realmente parece que há uma rede de actina nuclear
00: 17: 19.07 que está formando um andaime dentro deste núcleo.
00: 17: 22,27 Agora, isso tudo foi para estudar a mecânica e estrutura
00: 17: 27.19 usando essas partículas de sonda.
00: 17: 29.15 A verdadeira questão chave neste momento é,
00: 17: 31.08 e as gotículas de proteína de RNA embutidas?
00: 17: 34.09 E quanto a esses condensados ​​nucleares
00: 17: 39.16 que estão sentados dentro desta rede de actina?
00: 17: 41,15 E por falar nisso, esta é uma foto que dá uma boa visão da rede.
00: 17: 43.21 Você pode dizer, bem, por que não olhamos para aquela foto
00:17:45, 29 em primeiro lugar?
00: 17: 47.19 E a razão para isso é porque há alguma controvérsia
00: 17: 49,23 em torno de como alguém visualiza isso,
00: 17: 52,03 e isso é realmente representativo da rede.
00: 17: 55,29 Mas isso é. é assim que a rede se parece,
00: 17: 58.11 e isso é consistente com todos os dados que acabei de mostrar.
00: 18: 00.21 Então, nós temos essas gotículas, esses nucléolos,
00: 18: 03.01 as gotículas vermelhas que estão dentro desta rede,
00: 18: 07.06 e. você sabe.
00: 18: 10.29 e aparentemente restrito na rede.
00: 18: 13.21 Então, a pergunta que tínhamos era,
00: 18: 16.07 bem, o que acontece com essas estruturas
00: 18: 18,23 quando interrompemos a actina?
00: 18: 20,27 Então, o que acontece com os nucléolos?
00: 18: 22.28 E então, fizemos um experimento em que interrompemos
00: 18: 27.05 esta rede de actina e depois olhou, não para as contas,
00: 18: 29.27, mas agora nos nucléolos, que são marcados em verde aqui.
00: 18: 32.03 E algo que acho bastante notável aconteceu,
00: 18: 34.17 que nós. pelo qual estávamos realmente fascinados.
00: 18: 36.12 Então, muitas vezes olhamos para essas amostras
00: 18: 38,26 no microscópio,
00: 18: 40.26 onde estamos olhando para baixo e mostrando filmes olhando para baixo.
00: 18: 44.20 a câmera está projetando através de um avião como este.
00: 18: 48.05 Mas o que decidimos fazer foi olhar de lado,
00: 18: 50.06 então fomos capazes de fazer pilhas dessas imagens
00: 18: 53,04 e olhe de lado.
00: 18: 55.10 E este é um filme, então, olhando.
00: 18: 57.02 do lado para o que acontece
00: 18: 59.07 quando interrompemos esta rede de actina.
00: 19: 01.04 E vou mostrar que é bastante notável.
00: 19: 03.15 O que acontece é o nucléolo dentro deste núcleo
00: 19: 08.03 todos desabam no fundo do núcleo,
00: 19: 10.13 aparentemente sedimentando sob as forças gravitacionais.
00: 19: 15.02 Então, isso é realmente surpreendente, e interessante,
00: 19: 17.29 porque normalmente pensamos na gravidade como sendo insignificante
00: 19: 20,18 nas células vivas.
00: 19: 22,23 Mas, neste caso, aparentemente isso não é verdade.
00: 19: 25.05 Então, a rede de actina parece estar mantendo esses nucléolos no lugar,
00: 19: 30.03 e quando nos livramos dele, todos eles desabam no fundo.
00: 19: 32.19 Então, isso foi genuinamente surpreendente para nós.
00: 19: 34,22 E então, também é. também é interessante.
00: 19: 39,11 se você. se você deixar o sistema parado por tempo suficiente,
00: 19: 42.12 esses nucléolos, quando eles chegam ao fundo,
00: 19: 44.27 todos eles se aglutinam no que eu.
00: 19: 48.00 o que pode muito bem ser o maior nucléolo do mundo.
00: 19: 50.21 Esta estrutura agora é sobre, você sabe,
00: 19: 54.11 100+ mícrons de diâmetro.
00: 19: 57.12 É maior do que muitas células individuais.
00: 20: 00.03 E assim, todas as gotículas nucleolares coalesceram na parte inferior
00: 20: 03.14 quando interrompemos a rede de actina.
00: 20: 05.27 Então, por que a gravidade é importante?
00: 20: 09.03 Você sabe, por que geralmente ignoramos a gravidade nas células,
00: 20: 11,21 mas neste caso parece ser importante?
00: 20: 14,22 Então, parece que esta física deste
00: 20: 18.09 é muito interessante.
00: 20: 20.01 Então, há algo chamado escala de comprimento gravitacional.
00: 20: 22.05 Tem nomes diferentes
00: 20: 25.00 algumas pessoas se referem como o número Péclet gravitacional.
00: 20: 27.21 Reflete a competição entre a gravidade e as flutuações térmicas aleatórias
00: 20: 30.20 que deseja. deseja randomizar as posições dessas partículas.
00: 20: 35.27 É um efeito entrópico,
00: 20: 38.14 que você vai se lembrar da primeira aula,
00: 20: 40,08 onde entropia.
00: 20: 42.13 você sabe, esta escala de energia térmica, kT,
00: 20: 46.08 basicamente chuta tudo e quer bem misturado.
00: 20: 48.15 Então, isso tenderia a ter partículas que fluem
00: 20: 50.15 e distribuir uniformemente.
00: 20: 52,23 Mas a gravidade, se cada uma dessas partículas tem uma massa,
00: 20: 54.28 quer puxar as partículas para a superfície.
00: 20: 57.15 Então, há uma competição entre esses dois efeitos,
00: 21: 01.02 e isso dá origem a isso.
00: 21: 03.15 o que estou chamando de l-sub-gravidade,
00: 21: 06.10 a escala de comprimento gravitacional.
00: 21: 08.02 Então, kT é uma escala de energia
00: 21: 10.12 tem unidades de energia.
00: 21: 12,21 E mg, a massa vezes a aceleração gravitacional,
00: 21: 15.08 isso é uma força.
00: 21: 16.25 Portanto, uma energia dividida por uma força é uma escala de comprimento.
00: 21: 20,07 E então, esta escala de comprimento é basicamente a escala de comprimento
00: 21: 22.19 sobre o qual o perfil de concentração decai
00: 21: 26.25 conforme você sobe mais e mais.
00: 21: 29.06 Agora, a física disso que estou descrevendo
00: 21: 33.09 é exatamente por isso que a atmosfera
00: 21: 36.14 afina em grandes altitudes.
00: 21: 38,01 Então, você sabe, se um está ligado
00: 21: 41.27 o 3º, 4º ou 25º andar de um edifício,
00: 21: 45.00 você normalmente não percebe que a atmosfera está mais rarefeita.
00: 21: 47.12 E então, por que isso?
00: 21: 49.20 Bem, é porque. voce sabe, se eu pensar sobre isso,
00: 21: 52.03 se eu estiver no segundo andar de uma casa ou, você sabe, mesmo de um prédio alto,
00: 21: 55,10 o tamanho disso. a altura daquele prédio
00: 21: 57,29 é menor do que esta escala de comprimento gravitacional
00: 22: 00.01 para algo como oxigênio.
00: 22: 02.06 Então, eu poderia colocar na massa de oxigênio
00: 22: 04.06 e essas outras coisas. você sabe, temperatura ambiente e assim por diante.
00: 22: 07.29 e eu terei uma escala de comprimento gravitacional que é algo como um quilômetro a mais.
00: 22: 11,05 Então, eu não noto a atmosfera
00: 22: 14.10 afinando em grandes altitudes.
00: 22: 16.06 Mas notarei se for escalar uma montanha alta
00: 22: 18.25 ou, você sabe, voar para La Paz, Bolívia, por exemplo.
00: 22: 22.01 Vou notar que a atmosfera é muito mais fina,
00: 22: 25.21 e isso porque agora estamos começando
00: 22: 28.19 para se aproximar, ou mesmo exceder, potencialmente,
00: 22: 30,25 nesta escala de comprimento.
00: 22: 32.17 Então, essa mesma física, notavelmente,
00: 22: 34.29 está em jogo e é relevante dentro dessas células.
00: 22: 39.13 Então, achamos que geralmente ignoramos a gravidade dentro das células
00: 22: 42.17 porque a ideia é que as células,
00: 22: 45.01 em geral, são menores do que esta escala de comprimento gravitacional
00: 22: 47.01 para qualquer uma das estruturas que estaríamos considerando.
00: 22: 49.21 A única mudança que faríamos nesta equação
00: 22: 51.19 é em vez de massa, colocaríamos um flutuante ..
00: 22: 53,26 uma massa flutuante, então algum volume vezes a diferença de densidade.
00: 22: 56,25 No. esses ovócitos de rã muito grandes,
00: 23: 01.26 o que parece estar acontecendo é que a célula ficou muito grande
00: 23: 05.11 que agora está excedendo esta escala de comprimento gravitacional
00: 23: 08.26 para essas estruturas,
00: 23: 10.18 e agora a gravidade se torna realmente importante.
00: 23: 12.07 Podemos realmente quantificar isso
00: 23: 15,22 e, com todas as medições que fizemos,
00: 23: 17.12 podemos determinar as escalas de comprimento gravitacional
00: 23: 21.01 e descubra tudo isso, e faça o que chamarei de diagrama de estado para isso.
00: 23: 24.07 E o que isso mostra é que para células grandes
00: 23: 27,22 - aqui, estamos traçando-o como uma função do compartimento relevante,
00: 23: 31.21 que é o núcleo, mas também poderíamos colocá-lo em função das células -
00: 23: 35.17 a gravidade começa a se tornar importante
00: 23: 38.16 conforme você fica maior e maior.
00: 23: 40.19 E então, este é, eu acho, um sistema muito interessante,
00: 23: 43.21 e é um lugar onde há física divertida em jogo,
00: 23: 47.14 o que foi meio inesperado
00: 23: 50.17 até começarmos a fazer essas observações
00: 23: 53,17 e esta descoberta.
00: 23: 56.09 Agora, deixe-me mudar um pouco de assunto
00: 23: 59.04 e falar sobre algumas outras observações realmente interessantes
00: 24: 02.02 que fizemos neste sistema.
00: 24: 06.01 Agora, a estudante de graduação, Marina Feric,
00: 24: 09.02 que mencionei anteriormente.
00: 24: 10.17 no decorrer desses experimentos em que ela estava interrompendo a rede de actina
00: 24: 13.01 e olhando como os nucléolos coalescem uns com os outros,
00: 24: 17.06 você sabe, formando este tipo de nucléolo do tamanho de um recorde mundial,
00: 24: 21.12 o que ela notou é que os nucléolos coalescem de uma forma muito interessante.
00: 24: 27.09 se começarmos a rotular. etiqueta fluorescente
00: 24: 30.22 as diferentes subpartes do nucléolo.
00: 24: 34.02 Então, este é um filme que vou mostrar a vocês
00: 24: 37.06 onde rotulamos um conjunto de proteínas em verde
00: 24: 39,03 - essa é a proteína fibrilarina,
00: 24: 41.07 que é uma proteína associada ao núcleo interno do nucléolo -
00: 24: 43,29 e outro conjunto de proteínas.
00: 24: 47.03 Estou rotulando aqui nucleofosmina,
00: 24: 49.23 que está associada a esta camada externa de proteínas nucleolares.
00: 24: 53.29 E o que Marina percebeu é que quando ela interrompe a rede de actina
00: 24: 58.17 e deixa esses nucléolos coalescerem uns com os outros,
00: 25: 00.17 eles realmente formam gotículas que ficam cada vez maiores,
00: 25: 03.10 mas os núcleos também,
00: 25: 08.23 este núcleo rico em fibrilarina dentro do nucléolo,
00: 25: 10.22 também se aglutinam.
00: 25: 13,27 Então, é como se tivéssemos um líquido dentro de um líquido.
00: 25: 16.09 E você pode ver isso ainda melhor nessas imagens.
00: 25: 19.03 Estas são imagens de alta resolução dentro.
00: 25: 22.14 dentro da célula depois de deixarmos todos eles se unirem.
00: 25: 25.29 Você realmente tem essa sensação de que as proteínas ricas em fibrilarina
00: 25: 30.09 formam um núcleo, um líquido dentro do líquido externo rico em nucleofosmina.
00: 25: 36.10 E então, esta é uma ideia realmente interessante,
00: 25: 39.23 e começamos a pensar sobre o que isso significa
00: 25: 41,25 e como entendê-lo
00: 25: 45.13 de uma perspectiva da biofísica molecular.
00: 25: 46.29 Agora, algum outro trabalho que estivemos fazendo.
00: 25: 51.24 fomos capazes de mostrar que quando tomamos fibrilarina,
00: 25: 55.09 esta proteína associada ao núcleo, e purificá-la,
00: 25: 57.27 sua fase separa-se nessas lindas gotículas líquidas.
00: 26: 00.21 E isso pode não ser tão surpreendente
00: 26: 03.00 com base no que eu disse a vocês na última palestra,
00: 26: 04.25 porque a fibrilarina tem um estiramento significativo.
00: 26: 11.03 que é um heterogêneo conformacional. essas regiões intrinsecamente desordenadas,
00: 26: 15.01 que achamos que estão realmente conduzindo a separação de fases.
00: 26: 17.09 E então, mostramos que forma essas lindas gotículas de líquido.
00: 26: 19,07 E as outras proteínas?
00: 26: 21.15 Então, para esse trabalho, colaboramos
00: 26: 23.23 com Richard Kriwacki e Diana Mitrea em St. Jude,
00: 26: 26.23 que trabalhou com nucleofosmina in vitro,
00: 26: 30.09 com um sistema purificado.
00: 26: 32.04 E eles mostraram que a fase da nucleofosmina separa
00: 26: 34.14 nessas lindas gotículas de líquido in vitro.
00: 26: 36.06 E então, dissemos, ei, vamos apenas fazer
00: 26: 39.02 o que é um experimento simples e óbvio,
00: 26: 41.09 e pegue essas duas amostras e misture-as
00: 26: 44,10 e pergunte o que acontece.
00: 26: 46.11 E quando fizemos isso, de forma bastante notável, eu acho,
00: 26: 48.23 o que descobrimos é que as gotículas ricas em fibrilarina
00: 26: 50.26 e as gotículas ricas em nucleofosmina
00: 26: 53.04 são relativamente imiscíveis entre si -
00: 26: 54.28 eles não se misturam.
00: 26: 56,23 E, em vez disso, obtemos isso.
00: 26: 58.25 o que eu chamaria de sistema trifásico.
00: 27: 00.13 Há um. a região escura aqui
00: 27: 02.22 seria uma fase de baixa concentração de.
00: 27: 04.15 tem alguma nucleofosmina e alguma fibrilarina.
00: 27: 06.00 O ponto verde aqui dentro
00: 27: 08.14 são uma fase líquida rica em fibrilarina,
00: 27: 11.08 e a fase externa vermelha ou meio alaranjada
00: 27: 14.02 é uma fase rica em nucleofosmina.
00: 27: 17.05 Então, isso é realmente, eu acho, bastante notável,
00: 27: 19,27 e é notável por alguns motivos.
00: 27: 21.14 Um deles é que este sistema de proteína purificada
00: 27: 25.03 essencialmente recapitula completamente
00: 27: 28.02 a organização in vivo dessas estruturas.
00: 27: 32.22 Então, in vivo, lembre-se que temos gotículas semelhantes a líquido ricas em fibrilarina
00: 27: 37.18 dentro de uma camada externa rica em nucleofosmina,
00: 27: 41.07 e é exatamente isso que o sistema purificado in vitro
00: 27: 43.20 parece.
00: 27: 45.11 Então, pensamos que era. isso foi incrível.
00: 27: 47.09 Com um sistema muito simples de um pequeno número de proteínas
00: 27: 51.10 e componentes de RNA,
00: 27: 53.20 conseguimos recapitular essa arquitetura de shell central
00: 27: 56,07 do nucléolo.
00: 27: 59.29 Agora, a ideia de imiscibilidade líquida
00: 28: 03.21 - tendo múltiplas fases líquidas imiscíveis
00: 28: 06.15 ou fases líquidas não misturáveis ​​-
00: 28: 08.18 é em si algo bem conhecido na engenharia química
00: 28: 12.05 e as comunidades físico-química e de matéria mole.
00: 28: 15.15 Este é apenas um exemplo de alguns líquidos imiscíveis
00: 28: 19.00 que se pode formar. pode formar a partir de, você sabe,
00: 28: 22.03 solventes orgânicos não vivos, água e óleos,
00: 28: 24.18 onde você pode conseguir essas coisas
00: 28: 28.05 que não se misturam.
00: 28: 31,04 Então, podemos ter separação de fases, então,
00: 28: 33.11 não apenas de formar duas fases, mas de fato formar muitas fases,
00: 28: 39.15 e a forma como essas fases interagem é bastante interessante
00: 28: 41.14 e uma espécie de rico conjunto de física
00: 28: 43.26 que ainda não foi totalmente compreendido.
00: 28: 46.23 Uma das perguntas que fizemos ao fazer esses experimentos é,
00: 28: 49.12 por que as gotículas de fibrilarina estariam no interior?
00: 28: 51,19 Então, em outras palavras,
00: 28: 53,23 por que o verde está dentro do vermelho?
00: 28: 55.16 Por que o vermelho não está dentro do verde, por exemplo?
00: 28: 58.12 Isso seria. isso seria aparentemente tão válido.
00: 29: 03.11 Você teria imiscibilidade
00: 29: 05.19 eles não estão se misturando.
00: 29: 07.29 Do ponto de vista da biologia,
00: 29: 10.14 que provavelmente seria um problema,
00: 29: 13,19 porque os processos que estão associados à fibrilarina
00: 29: 16.25 e a fibrilarina-densa. estado condensado ocorre primeiro,
00: 29: 21,26 e a ideia é que essas transcrições de RNA
00: 29: 24.17 são processados ​​de forma sequencial de dentro para fora.
00: 29: 27.16 Então, se a ordem não estivesse certa, isso provavelmente causaria
00: 29: 31,27 problemas para a biologia.
00: 29: 34.11 Então, por que é que a fibrilarina sabe
00: 29: 37.06 que deveria estar do lado de dentro,
00: 29: 39.03 e nucleofosmina e os componentes que
00: 29: 41.17 sabe que eles deveriam estar do lado de fora?
00: 29: 43.25 Bem, parece que uma chave para responder a essa pergunta
00: 29: 45,28 vem da tensão superficial.
00: 29: 47,28 Então, como o nome indica,
00: 29: 50.23 a tensão superficial é um tipo de tensão associada às superfícies
00: 29: 54.26 ou interfaces entre dois tipos diferentes de fases.
00: 29: 56,29 Em particular, é realmente.
00: 29: 59.10 é um custo de energia associado a ter uma interface,
00: 30: 02.05 e, na verdade, tem unidades de energia por unidade de área.
00: 30: 07.02 Você pode pensar sobre isso de uma forma simples.
00: 30: 09.14 o esquema simples refletindo o fato de que
00: 30: 14,23 moléculas dentro de uma fase em massa estão meio que experimentando
00h30: 17.06 um ambiente homogêneo cercado por.
00: 30: 20.20 por, você sabe, um determinado conjunto de moléculas,
00: 30: 25.21 mas na interface tem esse tipo de.
00: 30: 27.18 você sabe, de um lado, eles estão vendo a fase homogênea
00: 30: 29,27 do outro lado, eles estão vendo esse ambiente externo.
00: 30: 32.14 E isso configura um custo de energia.
00: 30: 35.10 A manifestação da tensão superficial
00: 30: 38,22 é algo com o qual estamos familiarizados
00: 30: 41.03 olhando para coisas como insetos que caminham na água
00: 30: 43,28 ou o fato de que podemos, em alguns casos,
00: 30: 46.06 fazer os clipes de papel realmente flutuarem na água
00: 30: 49.04 por causa desses efeitos de tensão superficial,
00: 30: 51.15 ou se você fosse lavar seu carro e colocar um pouco de cera no carro,
00: 30: 55.11 por exemplo, e depois assistir,
00: 30: 58.19 as gotas de água iriam se formar na superfície.
00: 31: 01.01 Esses são todos efeitos de tensão superficial -
00: 31: 03.06 a energia das interfaces entre as diferentes fases.
00: 31: 06.05 E verifica-se que a tensão superficial
00: 31: 08.17 é realmente conhecido por ser a chave na estruturação
00: 31: 13.13 líquidos multifásicos.
00: 31: 15.00 Portanto, em particular, para sistemas multifásicos
00: 31: 18.11 de matéria não viva,
00: 31: 20.03 sabemos que ter esse tipo de organização shell central
00: 31: 25.17 de um sistema trifásico,
00: 31: 27,22 a tensão superficial entre a fase 3,
00: 31: 29,27 esta fase verde,
00: 31: 32,05 e fase 1, a fase preta,
00: 31: 34,21 teria que ser grande. Então, se essa tensão superficial,
00: 31: 36.15 a energia associada a essa interface, é muito grande,
00: 31: 39,21 então o sistema pode minimizar a energia
00: 31: 43.15 fazendo com que essa interface desapareça -
00: 31: 45.15 em outras palavras, por ter a fase verde dentro da fase vermelha.
00: 31: 49.17 E então não há mais nenhuma interface entre, você sabe, 1 e 3.
00: 31: 53.08 Você pode fazer uma experiência muito simples.
00: 31: 56.24 Então, Marina realmente fez esse tipo de experimento realmente simples
00: 31: 58.25 você pode fazer na sua cozinha
00: 32: 01.06 tomando água, óleo de Crisco e óleo de silicone
00: 32: 03.25 e mostrando isso porque a interface água-óleo de silicone.
00: 32: 06,28 a tensão. a tensão superficial é grande,
00: 32: 09,24 maior do que entre a água e o óleo Crisco,
00: 32: 12.18 a coisa vermelha,
00: 32: 14.25 então o óleo de silicone fica incorporado no óleo Crisco.
00: 32: 18.05 Então, tínhamos uma previsão de que a arquitetura do shell principal,
00: 32: 21.27 a organização de casca do núcleo que vemos dentro do nucléolo,
00: 32: 24.26 estava refletindo essas tensões superficiais diferenciais.
00: 32: 27,24 Para tentar testar essa ideia,
00: 32: 31.07 pegamos as proteínas purificadas que formam esses líquidos
00: 32: 33.10 e perguntou como eles interagem com as superfícies
00: 32: 36,06 de hidrofobicidade diferente ?,
00: 32: 38.00 so que poderíamos tentar entender a força relativa
00: 32: 41.02 de suas interações,
00: 32: 45.22 a favorabilidade para interações com água versus óleo.
00: 32: 49.04 E então, pegamos uma superfície que é relativamente hidrofóbica -
00: 32: 51.21 esta não é uma superfície fortemente hidrofóbica, mas relativamente hidrofóbica
00: 32: 52,19 - e olhamos de lado,
00: 32: 56.00 novamente meio que visualizando de lado,
00: 32: 58.00 em como essas gotículas interagem com a superfície.
00: 33: 00.10 O que descobrimos é que as gotículas de nucleofosmina
00: 33: 03.20 tendem a se comportar como água,
00: 33: 08.10 em que eles tendem a empilhar nessas superfícies relativamente hidrofóbicas,
00: 33: 10.27 onde as gotículas ricas em fibrilarina tendem a umedecer melhor
00: 33: 14,14 essas superfícies hidrofóbicas,
00: 33: 16.26 e isso é consistente com a ideia
00: 33: 18.26 que a tensão superficial entre a fibrilarina,
00: 33: 21.02 o material verde,
00: 33: 23.12 e a água é maior do que entre a nucleofosmina,
00: 33: 26,05 a coisa vermelha e água.
00: 33: 29.01 E é por isso que as gotículas verdes estão embutidas nas vermelhas,
00: 33: 34.00 exatamente como você vê neste esquema aqui.
00: 33: 36.02 E então, essa ideia de tensão superficial e estruturação da tensão superficial
00: 33: 39.08 de líquidos multifásicos tem implicações
00: 33: 42.23 Acho que muito além do nucléolo,
00: 33: 44.26 que é o sistema, você sabe,
00: 33: 46.22 estamos estudando para elucidar essas ideias.
00: 33: 48.25 Em particular, se a interface
00: 33: 52.00 e a tensão superficial entre duas fases diferentes ..
00: 33: 55,01. digamos entre a fase 3 e a fase 2,
00: 33: 57,23 o vermelho e o verde.
00: 34: 00.03 se for realmente energeticamente caro -
00: 34: 02.24 em outras palavras, sempre que o vermelho estiver próximo ao verde, haverá um enorme custo de energia -
00: 34: 05.05 então o que acontece são estes dois tipos de líquidos
00: 34: 08.05 simplesmente nunca interagirá.
00: 34: 11.06 Eles nem se tocam.
00: 34: 12.28 E então, é provavelmente por isso que muitos dos condensados ​​nas células
00: 34: 16.11 na verdade não interagem de forma alguma.
00: 34: 17.16 Eles meio que não grudam uns nos outros, não se molham,
00: 34: 19,28 não envolvendo um ao outro e assim por diante.
00: 34: 21,23 Em outros casos, porém, pode haver umedecimento parcial,
00: 34: 25.06 onde as tensões superficiais são aproximadamente da mesma magnitude,
00: 34: 30.01 e então você pode ter gotículas
00: 34: 32.08 que não estão se envolvendo totalmente,
00: 34: 34.08 mas eles estão interagindo,
00: 34: 36.25 e você pode ter morfologias semelhantes a esta.
00: 34: 38.14 Achamos que isso é importante porque
00: 34: 41.02 existem muitas estruturas na célula
00: 34: 43.13 onde há interação parcial entre esses condensados,
00: 34: 46.07 por exemplo nesta linda micrografia de Joe Gall
00: 34: 49.08 mostrando corpos de Cajal e Snurposomes e o tipo de molhamento parcial
00: 34: 51.29 - esse tipo de ângulos de contato bem definidos e assim por diante -
00: 34: 56.00 que se pode começar a usar para medir as tensões superficiais entre essas gotículas,
00: 35: 01.17 e entre as gotículas e o nucleoplasma circundante, neste caso.
00: 35: 06.22 Portanto, nesta palestra, tentei transmitir a vocês um pouco da emoção
00: 35: 10.14 sobre o nucléolo e, de forma mais geral
00: 35: 13.11 a ideia de que esses estados condensados ​​da matéria biomolecular
00: 35: 17.20 são importantes dentro do núcleo.
00: 35: 20.28 O nucléolo é apenas um tipo dessas estruturas.
00: 35: 24.15 Concentramo-nos bastante nisso
00: 35: 27.13 porque é o maior dos corpos nucleares,
00: 35: 30.00 mas existem realmente dezenas de tipos diferentes dessas coisas dentro do núcleo.
00: 35: 36.25 E de fato, pensamos que o nucléolo provavelmente
00: 35: 38.28 é um exemplo hipertrofiado do tipo de separação de fases
00: 35: 45.01 e a forma como os condensados ​​que se formam estão impactando o genoma,
00: 35: 47.10 e potencialmente desempenhando um papel muito importante
00: 35: 49,27 no fluxo de informações genéticas.
00: 35: 52.07 Podemos pensar nesses condensados ​​como algo
00: 35: 55,21 como a condensação de água nisso.
00: 35: 58.22 nesta teia de aranha, que pode deformar a teia de aranha e.
00: 36: 04.14 e realmente reestruturá-lo de alguma forma.
00: 36: 06.11 E então, esses são os tipos de questões que estamos começando a abordar,
00: 36: 09.00 e há muito entusiasmo neste campo
00: 36: 12.00 em pensar sobre essas ideias no futuro.
00: 36: 14,22 Então, como os condensados ​​líquidos impactam a arquitetura e a atividade do genoma?
00: 36: 19.00 Então, como eles podem estar desempenhando um papel importante
00: 36: 21.18 na regulação da expressão de genes
00: 36: 23.15 que dão origem aos traços de um organismo?
00: 36: 26.16 A, você sabe, cor do cabelo e dos olhos, altura, peso,
00: 36: 30,27 número de braços e pernas e dedos dos pés,
00: 36: 33.21 e todos aqueles tipos de coisas que realmente tornam a biologia
00: 36: 38.28 tão interessante, que podemos ir dos genes às características.
00: 36: 42,12 Como. fazer essas transições.
00: 36: 44,26 então o. você sabe, eu tenho falado muito sobre o.
00: 36: 46,29 na última palestra também. sobre as transições entre estados líquidos
00: 36: 50,05 e estados sólidos,
00: 36: 52.01 esses líquidos e géis e amilóides.
00: 36: 53.26 Faça transições entre esses diferentes estados da matéria biomolecular
00: 36: 56.27 desempenham um papel na regulação dos genes?
00: 36: 59.18 Portanto, é uma questão realmente fascinante.
00: 37: 01.17 Temos muito pouco conhecimento sobre isso,
00: 37: 03.05 e acho que essa será uma das principais questões
00: 37: 05.11 avançando nesta área,
00: 37: 09,26 na interface da física da matéria mole, c
00: 37: 12,22 ell biologia, genética,
00: 37: 16,14 e provavelmente vários outros campos.
00: 37: 20.14 Então, há muito entusiasmo agora,
00: 37: 22,22 e ficaremos felizes em ver isso avançar.
00: 37: 25.29 Quero agradecer a sua atenção.
00: 37: 28.07 Foi realmente um prazer trabalhar com algumas pessoas.
00: 37: 33.04 Mencionei Marina Feric, uma ex-aluna de graduação.
00: 37: 35.11 Temos um conjunto realmente maravilhoso de pessoas no laboratório,
00: 37: 37.01 e tive a sorte de interagir com
00: 37: 39.27 om muitos colaboradores realmente brilhantes.
00: 37: 42.14 Estou muito grato por isso e pelo financiamento
00: 37: 45.09 que ajudou a tornar possível parte do trabalho que estamos fazendo em nosso laboratório.
00: 37: 48.10 Muito obrigado pela sua atenção.


4 Genômica de célula única

O sequenciamento de DNA de células individuais oferece oportunidades únicas para investigar a montagem de novo do genoma de micróbios raros ou não cultiváveis, 40, 41 heterogeneidade de células em um tumor (mutações de DNA) 42 ou aquisição de resistência durante o tratamento. 43, 44 A comparação extensiva da heterogeneidade genômica entre o tumor primário e os locais do tumor metastático levou a uma compreensão mais profunda da formação de metástases, 43 e uma compreensão das mudanças genéticas no ambiente do tumor que levam à resistência aos medicamentos. 44 Tecnologias para análise genômica de célula única que não usam microfluídica de gotícula, mas poços: sequenciamento de captura de retrotransposon de célula única (scRC-seq), sequenciamento de exoma de 45 núcleo único (nuc-seq / SNES) 46 ou válvulas: fase determinística direta ( DDP), 47 não serão revisados ​​aqui.

Uma etapa crítica na análise do genoma de uma única célula é a amplificação de quantidades de pico ou nanograma de DNA em quantidades de micrograma. Duas estratégias podem ser distinguidas para amplificar o material genômico derivado de uma única célula: i) amplificação do genoma direcionado (apenas fragmentos direcionados são amplificados), ou ii) amplificação do genoma completo (WGA).

A amplificação do genoma direcionado utiliza uma reação de PCR padrão. Os primers projetados se ligam apenas à sequência específica que flanqueia a sequência de interesse no genoma que é amplificado na próxima etapa. Em contraste, os primers usados ​​para WGA se ligam a muitos lugares no genoma para iniciar a replicação, assim, toda a fita de DNA é amplificada. Nesta seção, as tecnologias microfluídicas de gotículas para a análise do genoma de uma única célula são introduzidas e comparadas.

4.1 Análise de genoma direcionado

Três tecnologias microfluídicas de gota permitem a análise do genoma direcionado a uma única célula: amplificação genética de cópia única (SCGA), PCR com base em agarose e Seleção de células ativadas por PCR (PACS).

4.1.1 SCGA

A amplificação genética de cópia única (SCGA) 48 é baseada na geração de gotículas de nanolitro uniformes para realizar PCR de grânulos. Figura 4a mostra o fluxo de trabalho geral de SCGA. Resumidamente, as células individuais são co-encapsuladas em gotículas de água em óleo com: um grânulo de agarose marcado covalentemente com iniciadores reversos e mistura de PCR contendo iniciadores diretos marcados com corante e enzimas. Posteriormente, as gotículas são coletadas fora do chip, as células são lisadas e a emulsão sofre uma série de termociclos de PCR que geram produto de fita dupla marcado com corante na superfície do grânulo. Após a PCR de gotículas, a desemulsificação é induzida e as contas revestidas com os amplicons fluorescentes são recuperadas. A detecção do DNA alvo é realizada medindo a intensidade de fluorescência de esfera única por citometria de fluxo. Fragmentos de DNA de até 1139 bp foram obtidos usando SCGA com eficiência de PCR de 40%, o que significa que produtos ligados a grânulos podem servir como um modelo para sequenciamento em massa. Além disso, SCGA constitui um método de detecção rápido e barato, com apenas três etapas de alto rendimento: emulsificação, PCR e a detecção da intensidade de fluorescência dos grânulos usando citometria de fluxo. Uma desvantagem do SCGA é a baixa frequência de geração de gotículas (abaixo de 6 Hz). Para resolver esse problema, Zeng et al. criou um dispositivo gerador de emulsão microfabricado (MEGA) para geração de gotículas de alto rendimento. 49 O dispositivo MEGA de 96 canais atinge uma taxa de geração de gotículas de 940 Hz. Uma segunda desvantagem do SCGA é que a PCR de gotículas (dPCR) tem menor eficiência em comparação com a PCR em massa: 40% para dPCR em comparação com a PCR em massa, mas com concentrações de molde e grânulos equivalentes. Finalmente, SCGA encapsula grânulos e células em gotículas de soluções muito diluídas seguindo as estatísticas de Poisson, levando a uma baixa eficiência na co-encapsulação: 1 em 100 gotículas contendo uma única célula e uma única esfera.

4.1.2 ePCR microfluídico de gota de agarose

O grupo de Yang desenvolveu PCR de emulsão à base de agarose (ePCR). 50 A Figura 4b mostra o fluxo de trabalho geral. Uma solução de agarose é emulsionada a 540 Hz com células (2, 1 ou 0,5 células por gota) e mistura de PCR. Similarmente ao SCGA, a mistura de PCR contém primers e enzimas marcados com fluorescência. No entanto, neste caso, os primers reversos são covalentemente anexados à agarose em vez de serem anexados a uma esfera. Após a emulsificação, as gotículas são coletadas para posterior PCR para amplificar o DNA alvo de interesse. Subsequentemente, as gotículas de agarose são gelificadas em esferas sólidas com os amplicons de PCR marcados com fluorescência covalentemente ligados à matriz de agarose. Finalmente, as contas são lavadas para remover o excesso de primers diretos marcados com fluorescência que não foram usados ​​durante a reação de PCR e são então analisados ​​usando microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo.

A ePCR microfluídica de gotículas de agarose oferece múltiplas vantagens em comparação com a SCGA. Em primeiro lugar, mostra um aumento de uma ordem de magnitude na eficiência de células e co-encapsulação de primers, uma vez que os primers são parte da fase líquida de agarose e, portanto, estão presentes em todas as gotículas, enquanto em SCGA os primers são carregados em grânulos sólidos (em 10 % das gotículas formadas). O aumento na eficiência da co-encapsulação permite a caracterização de populações de células inteiras e diminui a duração e os custos do experimento. Outra simplificação está relacionada ao uso de gotículas de agarose que superam a necessidade do uso de grânulos marcados com primers.

4.1.3 PACS

O PCR-Activated Cell Sorting (PACS) permite a classificação de bactérias com base na interrogação de pequenas regiões genômicas (centenas de bases). 51 O fluxo de trabalho geral do PACS é mostrado em Figura 5a. Bactérias e reagentes de PCR são co-encapsulados em gotículas. As células são lisadas e se seu DNA contiver a sequência de interesse, a sonda TaqMan (contendo um corante repórter e um supressor nas proximidades) se liga a ela. A hidrólise da sonda pela atividade de exonuclease da Taq polimerase permite a liberação do corante repórter da sonda e, assim, a fluorescência é aumentada devido à eliminação do efeito de extinção. Após a amplificação por PCR, a intensidade do sinal de fluorescência aumenta na gota a cada ciclo. Posteriormente, as gotículas fluorescentes são classificadas para análise a jusante de todo o genoma.

4.1.4 Desenvolvimentos Comerciais

A Mission Bio desenvolveu uma plataforma para análise do genoma de uma única célula e a comercializou como tecnologia Tapestri. 52 A Figura 5b apresenta o fluxo de trabalho. Primeiro, as células individuais são encapsuladas em gotículas com proteases. Após a lise das células nas gotículas, a temperatura é aumentada para inativar as proteases. Posteriormente, as gotículas contendo o genoma de células individuais são acopladas por eletrocoalescência com uma segunda gotícula contendo reagentes de PCR e grânulos de hidrogel com código de barras (na proporção de 1: 1). Os grânulos de hidrogel de código de barras são marcados com oligonucleotídeos contendo um código de barras específico da célula e uma sequência de iniciador específica do gene. Após a co-encapsulação dos grânulos de hidrogel com as gotículas contendo o genoma, os primers que marcam o grânulo de hidrogel são foto-liberados por exposição a UV e as sequências de DNA alvo são codificadas por barras de células por amplificação por PCR. Finalmente, a emulsão é quebrada e as bibliotecas são preparadas em massa, seguido de sequenciamento. Pellegrino et al. 52 mostrou um experimento de prova de conceito usando 62 alvos de DNA para analisar a heterogeneidade genética de células individuais de leucemia mielóide aguda.

4.2 Análise de todo o genoma

A análise do genoma inteiro no nível de uma única célula é desafiadora devido a: i) dificuldades em torno do isolamento de DNA de células individuais, ii) eficiência e confiabilidade da amplificação do genoma inteiro (WGA), iii) verificação de sequências que podem ser usadas para identificação de variantes e iv) análise e interpretação de dados. 53

Nesta seção, apresentamos primeiro as diferentes técnicas de amplificação do genoma completo, que têm sido um dos principais desafios técnicos na análise do genoma completo nas últimas décadas. Em seguida, descrevemos dois pipelines completos para análise de genoma de célula única usando microfluídica de gotículas: SiC-seq e CNV (10X Genomics).

4.2.1 Técnicas de amplificação do genoma inteiro

DOP-PCR

O conceito de reação em cadeia da polimerase com oligonucleotídeo degenerado ou amplificação baseada em PCR pura (DOP-PCR) foi introduzido em 1992 por Telenius et al. 54 O DOP-PCR baseia-se na utilização de um único primer contendo uma sequência aleatória (sequência degenerada). O DOP-PCR começa com alguns ciclos de pré-amplificação a uma temperatura de anelamento inicial baixa, a fim de permitir o anelamento de iniciadores aleatórios. Posteriormente, os amplicons de DNA são posteriormente amplificados por PCR.

O DOP-PCR tem duas vantagens principais: amplifica o DNA em vários loci e é independente da espécie. No entanto, o DOP-PCR fornece baixa cobertura do genoma, portanto, quaisquer diferenças na amplificação são exponencialmente aumentadas, resultando em regiões superamplificadas e subamplificadas ao longo do genoma.

A amplificação de deslocamento múltiplo (MDA), desenvolvida por Dean e colaboradores em 2001, 55 é baseada na amplificação isotérmica. Primers hexâmeros aleatórios são hibridizados com o molde, seguido pela síntese de DNA de deslocamento de fita pela polimerase de alta fidelidade ϕ29. A amplificação de DNA usando MDA resulta em uma cobertura do genoma muito maior em comparação com DOP-PCR. 56 No entanto, o MDA, de forma semelhante ao DOP-PCR, é baseado em uma amplificação exponencial que leva à superamplificação ou subamplificação dependente da sequência ao longo de todo o genoma, que não é reproduzível de célula para célula. Diferentes variações de MDA foram desenvolvidas para superar o viés de amplificação e melhorar o rendimento, ou seja, MIDAS, 57 IMS-MIDAS, 58 SNES, 46 ddMDA. 59 O MDA foi implementado com sucesso em microfluídicos de gotículas para aumentar sua eficiência. 60-62 A amplificação de deslocamento múltiplo em gotículas (sd-MDA) também foi demonstrada em genomas derivados de células individuais. 63

Métodos Híbridos

Os métodos híbridos pretendem superar algumas das deficiências dos dois métodos acima mencionados, combinando alguns de seus pontos fortes. Ciclos de amplificação com base em loop e recozimento múltiplo (MALBAC) e DOP-PCR de deslocamento (PicoPLEX) são exemplos de métodos híbridos que combinam a amplificação isotérmica seguida pela amplificação por PCR dos amplicons gerados. O MALBAC é baseado na amplificação quase linear que reduz o viés dependente da sequência, e a principal melhoria não é gerar cópias de cópias, mas, ao contrário, amplificar apenas a sequência original do genoma protegendo os produtos já amplificados. Isso é conseguido pela utilização de iniciadores aleatórios que possuem uma sequência (âncora) para promover o looping de amplicons e evitar a amplificação posterior antes do segundo PCR. Em contraste, o PicoPLEX usa iniciadores degenerados na primeira reação para adicionar uma sequência de âncora, seguido de iniciação para a sequência adicionada para a amplificação de PCR final. Yu et al. demonstraram um dispositivo microfluídico de câmara integrado projetado para reações MALBAC de célula única para identificar variações no número de cópias. 64 A comparação dos diferentes métodos de amplificação foi revisada em outro lugar e não será abordada posteriormente nesta revisão. 65, 66

4.2.2 SiC-Seq

Sequenciamento do genoma de uma única célula em ultrahigh-throughput (SiC-seq) desenvolvido por Lan et al. 67 foi a primeira plataforma para a análise do genoma de uma única célula, onde a maioria das reações são realizadas em gotículas. O SiC-seq rotula todo o material de DNA de uma célula individual com um código de barras exclusivo para essa célula. O fluxo de trabalho compreende as seguintes etapas (Figura 6a): 1) geração de gotículas de código de barras, 2) encapsulação celular em gotículas de agarose, lise, purificação de DNA genômico e gelificação dos grânulos celulares, 3) reencapsulação dos grânulos celulares purificados com reagentes de marcação, 4) fusão de gotículas contendo genoma etiquetado com gotículas contendo reagentes de PCR e gotículas de código de barras, 5) sequenciamento e análise de dados.

Na primeira etapa, o SiC-seq requer a preparação de uma biblioteca de gotículas de código de barras. Os oligonucleotídeos aleatórios de 15 bases flanqueados por sequências constantes são co-encapsulados com: reagentes e iniciadores de PCR (complementares às regiões constantes dos códigos de barras e contendo o adaptador de célula de fluxo Illumina P7). Posteriormente, o conteúdo das gotículas com todos os reagentes é amplificado via PCR digital de gotículas (≈10 milhões de gotículas com código de barras são geradas em poucas horas). Após a preparação da biblioteca de códigos de barras, as células individuais devem ser isoladas. A suspensão de células é fundida com uma corrente de agarose fundida usando um criador de gotas de co-fluxo. As gotículas de agarose são solidificadas por resfriamento e transferidas do óleo para o transportador aquoso. Os grânulos de agarose são permeáveis ​​a enzimas, detergentes e pequenas moléculas, mas prendem estericamente estruturas maiores como DNA genômico, tornando-os o substrato ideal para permitir que as etapas de lavagem sejam realizadas em células encapsuladas. Posteriormente, a parede celular é digerida, e uma série de tratamentos enzimáticos e detergentes (solubilização de lipídios e digestão de proteínas) são realizados. Micropérolas purificadas com DNA genômico são reencapsuladas em gotículas contendo reagentes de marcação para fragmentar o genoma e anexar sequências universais para atuar como alças de PCR. Após a marcação, essas gotas são, por sua vez, mescladas sequencialmente com duas outras gotas: uma gota contendo os reagentes de PCR e uma gota do código de barras. As gotículas obtidas são termocicladas para permitir a amplificação do produto e a ligação do adaptador P5 e P7 necessário para o sequenciamento Illumina. Após a preparação da biblioteca, as gotas são agrupadas para sequenciamento. Os dados de sequenciamento são filtrados para qualidade e agrupados por código de barras, fornecendo uma sequência genômica para todas as células.

SiC-seq tem várias vantagens em comparação com as ferramentas de análise de célula única de genoma direcionado descritas acima. Primeiro, SiC-seq permite uma análise imparcial do genoma de uma única célula. Além disso, todas as etapas podem ser realizadas usando microfluídica, limitando as etapas de manipulação manual e aumentando a reprodutibilidade. No entanto, a manipulação microfluídica é mais complexa e demorada em comparação com os métodos de análise do genoma direcionado.

4.2.3 Desenvolvimentos Comerciais

Variação de número de cópia de célula única (CNV) foi introduzida no mercado pela 10X Genomics para estudar a heterogeneidade genômica de célula única e evolução clonal de uma maneira de alto rendimento (centenas a milhares de células), 68 o fluxo de trabalho de CNV é mostrado na Figura 6b. Em primeiro lugar, células únicas são encapsuladas na diluição limite em uma matriz de gel com partículas paramagnéticas dentro de um chip microfluídico de uso único. Depois que as gotículas gelificam, as células ficam presas dentro das esferas e são submetidas à lise seguida pela remoção de todas as proteínas nucleares, enquanto o DNA genômico permanece preso na matriz do gel. Posteriormente, o DNA genômico purificado dentro dos grânulos de células é co-encapsulado em um segundo dispositivo microfluídico com grânulos de código de barras (10X Barcoded Gel Beads) e enzimas. É importante ressaltar que tanto os grânulos de células quanto os grânulos de código de barras são compactados, permitindo a co-encapsulação de alta eficiência de um grânulo de célula e um grânulo de código de barras em cada gota (≈80% das gotículas contêm um grânulo de célula e um grânulo de código de barras). O DNA dentro da gota é amplificado para gerar bibliotecas com código de barras de uma única célula prontas para sequenciamento e análise. É importante ressaltar que todo o DNA gerado a partir de células individuais compartilham um código de barras 10X comum.

Vale ressaltar que devido à perda recente de um processo de patentes movido pela Bio-Rad sobre o uso de canais não fluorados, a 10X Genomics teve que mudar o design do seu dispositivo. O novo “chip Next GEM” parece usar emulsificação por etapas em vez de foco de fluxo para geração de gotículas, embora não possamos verificar isso no momento.


2 gotas e vesículas

Gotículas são entidades líquidas para as quais um grau de imiscibilidade é necessário entre pelo menos duas fases (gás-líquido ou líquido-líquido), e as interações atrativas e repulsivas entre as moléculas na interface podem dar origem a uma tensão superficial, que define entre outras coisas na forma de uma gota. Os exemplos padrão incluem gotículas de água no ar [95], gotículas de água no óleo [5] e gotículas de óleo na água [24]. Além disso, as moléculas podem particionar preferencialmente na água ou na fase de óleo, dependendo de suas propriedades hidrofílicas ou hidrofóbicas. Por exemplo, corantes solúveis em óleo (por exemplo, Oil Red O, Sudan Black) são usados ​​para melhor visualização das fases de óleo, enquanto os sais inorgânicos (por exemplo, NaCl) se dissolvem preferencialmente em fases aquosas. No entanto, os surfactantes, que são moléculas anfifílicas contendo grupos hidrofílicos e hidrofóbicos, se automontam no limite de fase (Figura 1).Os surfactantes são compostos tensoativos que podem diminuir a tensão interfacial entre as duas fases. Obviamente, as gotículas também podem se formar na ausência de surfactantes, mas as moléculas de superfície ativa que se automontam no limite da gotícula são úteis na modulação da tensão interfacial da interface e, portanto, nas propriedades e comportamento das gotículas. Outro propósito dos surfactantes é estabilizar as gotículas diminuindo em geral a tensão interfacial e suprimindo a coalescência das gotículas.

(a) Uma representação de uma molécula de surfactante anfifílico que consiste em uma cabeça hidrofílica que se divide preferencialmente na fase aquosa e uma cauda hidrofóbica que se divide preferencialmente na fase oleosa. Diferentes arquiteturas de surfactantes em diferentes sistemas multifásicos: (b) gota de óleo na fase aquosa, (c) gota aquosa na fase oleosa, (d) vesícula consistindo de uma bicamada fosfolipídica.

(a) Uma representação de uma molécula de surfactante anfifílico que consiste em uma cabeça hidrofílica que se divide preferencialmente na fase aquosa e uma cauda hidrofóbica que se divide preferencialmente na fase oleosa. Diferentes arquiteturas de surfactantes em diferentes sistemas multifásicos: (b) gota de óleo na fase aquosa, (c) gota aquosa na fase oleosa, (d) vesícula consistindo de uma bicamada fosfolipídica.

Quando uma gota aquosa é coberta por uma bicamada lipídica contínua em uma fase aquosa principal, ela é chamada de vesícula [11]. As moléculas anfifílicas automontadas na superfície da vesícula definem a vesícula. Em princípio, uma vesícula é uma gota de água em óleo em água com um núcleo aquoso que pode conter moléculas solúveis em água e uma membrana de bicamada lipídica onde as moléculas solúveis em óleo podem ser incorporadas. As vesículas estão dispersas na fase contínua de água e variam em tamanho de dezenas de nanômetros a centenas de micrômetros. Para vesículas feitas artificialmente usando fosfolipídios ou lipídios derivados de biomembranas, o termo lipossomas é freqüentemente usado, e as aplicações de lipossomas variam de células artificiais [60] a entrega de drogas a microcontêineres [98].

As gotas podem ser produzidas de várias maneiras. Para produzir uma única gota ou algumas gotas, simplesmente pingar líquido de uma micropipeta ou seringa pode ser suficiente. Grandes quantidades de gotículas podem ser produzidas por uma ampla gama de técnicas, incluindo, por exemplo, atomizadores, nebulizadores e homogeneizadores de vários designs. Essas técnicas irão produzir milhares a milhões de gotículas dispersas na fase contínua como emulsões. As arquiteturas típicas incluem emulsões de óleo em água (Figura 1b) ou água em óleo (Figura 1c), mas também existem organizações mais complexas, como emulsões duplas [36]. A implementação de plataformas robóticas e microfluídicas para a geração e análise de gotículas foi demonstrada [43, 47, 49, 59, 74]. Em geral, as gotículas podem ser produzidas facilmente. No entanto, a estabilidade a longo prazo é tipicamente alcançada por meio da presença de surfactantes, que aumentam a estabilidade cinética do sistema.


Classificação de células vivas ativadas por fluorescência

Uma descrição da seleção de células ativadas por fluorescência de populações de células vivas.

A classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) de células vivas separa uma população de células em subpopulações com base na marcação fluorescente. A classificação envolve mecanismos mais complexos no citômetro de fluxo do que uma análise sem classificação. As células coradas usando anticorpos conjugados com fluoróforo podem ser separadas umas das outras dependendo do fluoróforo com o qual foram coradas. Por exemplo, uma célula que expressa um marcador de célula pode ser detectada usando um anticorpo conjugado com FITC que reconhece o marcador, e outro tipo de célula que expressa um marcador diferente pode ser detectado usando um anticorpo conjugado com PE específico para esse marcador. Esta é a tarefa básica da citometria de fluxo.

A classificação de células vivas vai um passo adiante:

  1. As células individuais são "interrogadas" pelo laser como em um citômetro de fluxo normal.
  2. A máquina é configurada de forma que cada célula individual entre em uma única gota ao deixar a ponta do bico. Essa gota recebe uma carga eletrônica, dependendo da fluorescência da célula dentro da gota.
  3. As placas de deflexão atraem ou repelem as células de acordo com os tubos de coleta.

Uma única célula corada com FITC em uma única gota receberia uma carga positiva e seria atraída para a direita. Os tubos de coleta à direita coletariam todas as gotículas de células coradas com FITC carregadas positivamente.

As células precisam permanecer viáveis ​​e sem contaminação para a cultura subsequente. Veja as dicas abaixo.


Ciência desleixada ou ideia inovadora? A teoria de como as células organizam os conteúdos divide os biólogos

Por 7 anos como presidente do Howard Hughes Medical Institute, Robert Tjian ajudou a direcionar centenas de milhões de dólares para cientistas que investigavam ideias provocativas que poderiam transformar a biologia e a biomedicina. Portanto, o bioquímico ficou intrigado alguns anos atrás quando seu aluno de graduação David McSwiggen descobriu dados que provavelmente estimulariam o entusiasmo sobre um processo chamado separação de fases, que já é um dos conceitos mais importantes da biologia celular.

Os defensores da separação de fases afirmam que proteínas e outras moléculas se auto-organizam em estruturas mais densas dentro das células, como gotas de óleo se formando na água. Essa classificação espontânea, afirmam os proponentes, serve como um mecanismo anteriormente não reconhecido para organizar o conteúdo da célula e reunir as moléculas necessárias para desencadear eventos celulares importantes. McSwiggen encontrou indícios de que a separação de fases ajuda os herpesvírus a se replicar dentro das células infectadas, acrescentando que o processo desempenha um papel em funções tão diversas como ligar genes, ancorar o citoesqueleto e reparar DNA danificado. “É bastante claro que esse processo está em ação em toda a célula”, diz o biofísico Clifford Brangwynne, da Universidade de Princeton.

A indústria farmacêutica está tão animada quanto alguns pesquisadores acadêmicos, dados os estudos que ligam a separação de fases ao câncer, esclerose lateral amiotrófica (ELA), diabetes e outras doenças. A Dewpoint Therapeutics, uma startup que busca tratamentos médicos voltados para gotículas celulares, assinou recentemente acordos de desenvolvimento no valor de mais de US $ 400 milhões com os gigantes farmacêuticos Merck e Bayer. E três outras empresas que buscam explorar o processo abriram suas portas no final do ano passado. Refletindo esse entusiasmo, Ciência escolheu a separação de fases como vice-campeã na edição Breakthrough of the Year de 2018.

Tjian diz que foi agnóstico no início sobre a importância do processo. Mas depois que as descobertas de McSwiggen o inspiraram e seus colegas a olharem mais de perto a gama de alegações, os pesquisadores começaram a ter dúvidas. Tjian e um grupo de biólogos igualmente céticos agora argumentam que a evidência de que condensados ​​semelhantes a líquidos surgem naturalmente nas células é amplamente qualitativa e obtida com técnicas que produzem resultados ambíguos - em resumo, eles acreditam que grande parte da pesquisa é de má qualidade.

Além disso, a alegação de que essas gotículas intracelulares desempenham papéis importantes "passou de dogma hipotético a estabelecido sem dados", diz Tjian, que deixou o cargo de presidente da Howard Hughes em 2016 e agora co-dirige um laboratório na Universidade da Califórnia ( UC Berkeley. “Isso para mim é tão perverso e destrutivo para o processo de descoberta científica.”

Embora os proponentes da separação de fases se refreiem com algumas dessas críticas, muitos cientistas concordam que a pesquisa requer um choque de rigor. “Não acho que todo o campo seja uma bobagem”, diz a biofísica Stephanie Weber, da Universidade McGill. “Mas precisamos ser mais cuidadosos” na identificação de instâncias de separação de fases nas células e na atribuição de funções a elas.

O processo pode ser menos importante do que muitos cientistas afirmam agora, acrescenta a bióloga celular quantitativa Amy Gladfelter, da Universidade da Carolina do Norte, em Chapel Hill. Alguns pesquisadores, diz ela, tentaram torná-lo "a resposta para tudo".

A separação de fases pode responder a uma pergunta fundamental que incomoda os biólogos há mais de 100 anos: como as células organizam seu conteúdo de modo que as moléculas necessárias para realizar um determinado trabalho estejam no lugar certo na hora certa? Uma maneira óbvia é com membranas internas, como aquelas que cercam os corpos de Golgi e as mitocôndrias. No entanto, muitas outras estruturas celulares bem conhecidas, incluindo o nucléolo - uma organela dentro do núcleo - e os corpos de Cajal que processam o RNA, não têm membranas.

A separação de fases é uma resposta atraente. Muitas proteínas apresentam manchas pegajosas que atraem outras proteínas do mesmo tipo ou de um tipo diferente. Estudos em tubos de ensaio mostraram que, sob certas condições, como quando a concentração de proteínas sobe acima de um certo nível, as moléculas podem começar a se agrupar, formando condensados ​​em forma de gotículas. Os pesquisadores entendem melhor a mecânica das proteínas, mas os ácidos nucléicos, como o RNA, também podem agregar às proteínas. Se o processo acontecer na célula, ele pode gerar e manter organelas e permitir funções únicas. “É um princípio que poderia explicar quantas coisas na célula e no núcleo estão organizadas”, diz o biofísico Mustafa Mir, da Universidade da Pensilvânia, que já trabalhou como pós-doutorando com Tjian.

Embora os biólogos tenham sugerido um papel para as gotículas intracelulares já na década de 1890, as evidências de que são vitais começaram a se aglutinar há pouco mais de 10 anos. Brangwynne, então pós-doutorado com o biólogo celular Anthony Hyman no Instituto Max Planck de Biologia Celular e Molecular e Genética, estava rastreando grânulos P, manchas de proteína e RNA que, em embriões de nematóides, marcam as células que vão produzir espermatozoides e óvulos. Para observar os movimentos dos grânulos, Brangwynne espremeu gônadas de vermes que abrigam as estruturas entre duas lamelas de microscopia. Sob pressão, os grânulos de P responderam não como sólidos, mas como líquidos, fluindo ao longo da superfície do núcleo e pingando, Brangwynne, Hyman e colegas relataram em Ciência em 2009. O comportamento aquoso dos grânulos “foi alucinante. Era tão diferente de tudo nas células ”, diz Weber, um ex-pós-doutorado de Brangwynne.

Os grânulos P (verdes), bolsas de proteína e RNA em embriões de vermes precoces que marcam onde os espermatozoides ou óvulos irão surgir, tornaram-se o exemplo clássico de regiões separadas por fase no citoplasma.

Em 2012, Brangwynne e colegas viram características semelhantes de fluido no nucléolo, uma densa mistura de proteínas, RNA e DNA que fabrica ribossomos, as fábricas de proteínas da célula. No mesmo ano, o biofísico Michael Rosen, do Southwestern Medical Center da University of Texas, e colegas mostraram que três proteínas que colaboram para organizar parte do citoesqueleto formam gotículas líquidas em uma solução de tubo de ensaio. Eles descobriram que o processo acelera a montagem de um tipo de fibra esquelética in vitro - e pode fazer o mesmo na célula. Desde então, os cientistas relataram dezenas de exemplos de estruturas celulares que são redondas, propensas a se fundir e tendem a formar gotas ou fluir através das superfícies - marcas registradas de gotículas formadas por separação de fases.

Para confirmar que um agrupamento molecular em uma célula é um líquido e não algo mais sólido, os cientistas costumam implantar uma técnica chamada recuperação de fluorescência após fotodegradação (FRAP). Usando uma célula que contém proteínas fluorescentes, os pesquisadores zapam a região em questão com um laser para escurecer as moléculas e, em seguida, rastrear quanto tempo a fluorescência leva para se difundir de volta de outras partes da célula. Um líquido, no qual as proteínas fluorescentes penetram facilmente, deve acender mais rapidamente do que um sólido. Outro teste envolve a aplicação de 1,6-hexanodiol, um composto que quebra algumas das interações moleculares que mantêm as gotículas juntas, para determinar se a estrutura se dissolve.

Rosen observa que três artigos publicados no ano passado em Célula oferecem algumas das evidências mais fortes para a separação de fases nas células. Um, do laboratório de Brangwynne, mostrou que uma proteína específica tinha que atingir uma concentração limite nas células para permitir a formação de grânulos de estresse - organelas que surgem durante tempos difíceis e foram atribuídas à separação de fases. Os outros dois estudos também identificaram condições de limiar para a separação de fases. Como um limite é um atributo do processo, os estudos fornecem “dados bons, mas não perfeitos, de que essas estruturas estão passando por separação de fases”, diz Rosen.


Condensados: um novo princípio de organização nas células?

Eu escrevi alguns anos atrás sobre a ideia de & # 8220condensar & # 8221 dentro das células & # 8211 gotículas de proteínas e outras biomoléculas semelhantes a líquido que se associam em alta concentração. Essa é uma ideia estranha para a maioria de todos nós, porque estamos acostumados a pensar que os compartimentos celulares são fechados por membrana e a anatomia celular é um pouco mais. . .definiram. Os condensados, por outro lado, são exatamente o oposto: não há nenhum saco ao redor deles e eles podem estar se formando, se fundindo e se desfazendo mais ou menos por conta própria. Esse tipo de coisa tem sido visto dentro das células há muitos anos e recebeu vários nomes (manchas nucleares, corpos de Cajal, corpos U e P, parapeckles, etc.), sem que houvesse um conceito unificador sobre eles.

O campo realmente tem decolado recentemente & # 8211 aqui & # 8217s uma revisão do ano passado & # 8211 e está parecendo cada vez mais com isso poderia ser um processo fundamental na biologia celular que (até recentemente) nós & # 8217 conhecemos totalmente esquecidas. Pode ser muito importante na transcrição, por exemplo. Como mencionado naquele post anterior, parece que proteínas intrinsecamente desordenadas são especialmente prováveis ​​de formar esses condensados, e as proteínas do fator de transcrição são notórias por essa propriedade.

Atualização: aqui & # 8217s uma boa visão geral das notícias sobre o campo que & # 8217s recentemente apareceu na Nature.

Pensar nesses termos realmente abre muitas possibilidades. Sempre foi difícil ter uma imagem mental realista do que realmente está acontecendo na célula viva, aquela massa quase gelatinosa de milhares e milhares de proteínas flutuando em uma sopa de íons, pequenas moléculas, metabólitos e o que você tem. Pode ser, de fato, que algumas dessas outras espécies estejam envolvidas no comportamento dessas gotículas de condensado separadas por fase. Há até mesmo uma proposta de que o ATP não é apenas a moeda energética chave da célula viva, mas que tem outra função como um & # 8220hidrotrópico & # 8221, uma molécula que & # 8217s realmente regula a solubilidade de proteínas hidrofóbicas e seu comportamento de condensação . Isso pode explicar por que está presente em concentrações ainda mais altas do que você acha que as células precisariam por razões puramente energéticas.

Outro aspecto interessante é a escala de tempo envolvida. Sabemos muito sobre agregados de proteínas irreversíveis, que se desenvolvem nas células ao longo de anos (amiloide, huntingtina e muitos outros). Os condensados, entretanto, são reversíveis e podem se formar, se formar e se espalhar em uma escala de segundos a minutos, o que os coloca na faixa de grande parte da biologia celular. Esse tipo de coisa também tem implicações óbvias para as teorias da origem da vida, se você puder começar a obter diferenciação de função sem necessariamente ter membranas (embora ainda haja um papel óbvio para ter um saco ao redor de tudo na célula- nível de membrana). Houve pressão evolutiva por esse tipo de comportamento nas sequências de proteínas?

Existem muitas questões em aberto. Como químico medicinal, fico imaginando como é a solubilidade das moléculas de drogas nesses ambientes. Eu estava falando sobre & # 8220versus a fase em massa & # 8221, mas você realmente deve se perguntar se há é uma fase em massa dentro de uma célula. Dizemos alegremente & # 8220citoplasma & # 8221 para descrever esse interior, mas isso pode ser um caso de reificação & # 8211 fazendo algo onde não há realmente algo definido a ser feito. Parece cada vez mais com a situação real muito mais heterogênea do que pensávamos, e que os físicos e químicos de polímeros podem ter tanto a nos dizer sobre o que está acontecendo quanto os biólogos celulares. Definitivamente, uma área para ficar de olho.


Assista o vídeo: BD FACS Lyric (Janeiro 2022).