Em formação

1.2A: Micelas e bicamadas - Biologia


Certa vez, um pós-doutorado me disse que, para entender a bioquímica e a imunologia, ele precisava fingir que era uma molécula. Antes de ler a resposta, olhe para a imagem abaixo e pergunte-se: O que eu faria se fosse um anfifílico de cadeia simples pronto para pular na água?

Um anfifílico de cadeia simples salta para a água!

Quando adicionados à água, os anfifílicos de cadeia simples formam ambas as monocamadas na superfície da água e micelas, enquanto alguns monômeros permanecem em solução. Os anfifílicos de cadeia dupla formam bicamadas em vez de micelas. (Observação: anfifílicos de cadeia simples e dupla também podem formar outras estruturas agregadas multimoleculares, mas essas são as mais comuns e são as únicas que consideraremos.)

Figura: Estruturas de anfípilos de cadeia simples e dupla na água - Micelas e Bicamadas


Jmol atualizou Micelle Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

Jmol: Bilayer não hidratado atualizado Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)

O interior da micela é completamente apolar. Bicamadas esféricas que encerram um compartimento aquoso são chamadas de vesículas ou lipossomas. Micelas e bicamadas, formadas a partir de anfifílicos de cadeia simples e dupla, respectivamente, representam agregados não covalentes e, portanto, são formadas por um processo inteiramente físico. Nenhuma etapa covalente é necessária. A formação dessas estruturas pode ser compreendida a partir do estudo das forças intermoleculares (IMFs) envolvidas, bem como da termodinâmica. Primeiro, revisaremos os FMIs envolvidos. Considere as forças de atração. As cadeias de acila enterradas podem interagir e ser estabilizadas pelas forças de Londres. Eles são sequestrados da água. Essa visão se ajusta ao nosso axioma simples de "semelhante-dissolve semelhante". Os grupos de cabeça polares podem ser estabilizados por ligações íon-dipolo entre grupos de cabeça carregados e água. Da mesma forma, ligações H entre a água e o grupo de cabeça estabilizam os grupos de cabeça expostos na água. Forças repulsivas também podem estar envolvidas. Os grupos de cabeças podem se repelir por meio de fatores estéricos ou repulsão íon-íon de grupos de cabeças com cargas semelhantes. As forças de atração devem ser maiores do que as forças repulsivas, que levam a esses agregados moleculares. Um problema surge com esta explicação simples. Para que uma micela ou bicamada se forme, muitos monômeros devem se agregar para formar uma única micela ou vesícula. Isso sugere que a formação de micelas e vesículas deve ser desfavorecida entropicamente!

Os anfifílicos de cadeia única comuns que formam micelas são detergentes (como dodecilsulfato de sódio - SDS), bem como ácidos graxos, que são detergentes. O NaOH é escorregadio na pele, pois a base hidrolisa os ácidos graxos esterificados em lipídios da pele. Os ácidos graxos livres então agregam-se espontaneamente para formar micelas que agem como detergentes.


Perguntas pré-aula: Estrutura lipídica: B. Lipídios na água - Pergunta


Os lipossomas produzidos no laboratório podem ser unilamelares, consistindo em uma única bicamada envolvendo o compartimento aquoso interno, ou multilamelar, consistindo em múltiplas bicamadas envolvendo a solução aquosa fechada. Você pode imaginar as vesículas multilamelares semelhantes a uma cebola com suas várias camadas. Desenhos animados de lipossomas unilamelares e multilamelares são mostrados abaixo, onde cada círculo concêntrico representa uma bicamada.

Os lipossomas variam em diâmetro. Eles podem ser geralmente categorizados em pequenos (S, diâmetro <25 nm), intermediários (I, diâmetro em torno de 100 nm) e grandes (L, diâmetro de 250-1000 nm). Se essas vesículas forem unilamelares, serão abreviadas como SUV, IUV e LUV, respectivamente. Seus vários tamanhos são mostrados abaixo, em comparação com outras grandes estruturas biológicas. Neste laboratório, faremos e caracterizaremos o LUV.

A composição química dos lipossomas pode ser amplamente variada. A maioria contém fosfolipídios neutros como fosfatidil colina (PC), fosfatidiletanolamina (PE) ou esfingomielina (SM), suplementados, se desejado, com fosfolipídios carregados negativamente, como fosfatidilserina (PS) e fosfatidil glicerol (PG). Além disso, anfifílicos de cadeia simples como o colesterol (C) e detergentes podem ser incorporados na membrana da bicamada, que modula a fluidez e a temperatura de transição (Tm) da bicamada. Se presentes em uma concentração muito grande, anfifílicos de cadeia simples como detergentes, que formam micelas, podem romper a membrana tão completamente que os anfifílicos de cadeia dupla se incorporam às micelas de detergente, agora chamadas de micelas mistas, em um processo que efetivamente destrói a bicamada da membrana.

No laboratório (para aqueles que o fizerem), você fará lipossomas contendo apenas PC natural a partir de gema de ovo fresca. Lembre-se de que os dois ácidos graxos nos fosfolipídios que ocorrem naturalmente podem ter múltiplos comprimentos e graus de insaturação. A composição média de ácidos graxos da gema de ovo PC (peso molecular médio = 750) é mostrada na tabela abaixo, obtida de Lipossomas: uma abordagem prática, editada por R.R.C. Novo.

tabela 1
Ácido graxo% De ácido graxo em C1% De ácido graxo em C2
16:068.81.8
18:025.81.2
18:14.748.9
18:20.211.1
18:30.5-
20:4-2.1
20:5-7.1
22:5-2.6
22:6-25.2
  • Avanti Polar Lipids (de onde obtemos nosso ovo PC): Distribuição de ácidos graxos para diferentes tecidos

Dado o alto grau de insaturação em C2, o que você espera que seja a temperatura de transição de um lipossoma composto apenas de gema de ovo PC? (Vesículas feitas com PC mais saturado de fontes de mamíferos têm (T_m ) em torno de 40ºC.) Esse alto grau de insaturação torna a gema de ovo PC muito suscetível à oxidação, o que poderia alterar drasticamente as propriedades do lipossoma. O PC sintético feito com ácidos graxos saturados pode aliviar esse problema.

As propriedades dos lipossomas (densidade de carga, fluidez da membrana e permeabilidade) são determinadas pela composição lipídica e pelo tamanho da vesícula. As propriedades desejadas serão, por sua vez, determinadas pelo uso do lipossoma particular. As vesículas oferecem modelos simples e maravilhosos para estudar a bioquímica e a biofísica das membranas naturais. Na verdade, as proteínas da membrana podem ser incorporadas à bicamada do lipossoma usando o método exato que você usará. Mas, além desses propósitos, os lipossomas podem ser usados ​​para encapsular moléculas solúveis em água, como ácidos nucléicos, proteínas e drogas tóxicas. Estes lipossomas podem ser direccionados para células específicas se os anticorpos ou outras moléculas que se irão ligar especificamente à célula alvo puderem ser incorporados na bicamada da vesícula. O material intralipossômico pode então ser transferido para a célula por fusão da vesícula com a célula ou por endocitose da vesícula.


Fronteiras na Química

As afiliações do editor e dos revisores são as mais recentes fornecidas em seus perfis de pesquisa do Loop e podem não refletir sua situação no momento da revisão.



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Os ciclotídeos são uma família de proteínas circulares derivadas de plantas com potenciais aplicações terapêuticas decorrentes de sua notável estabilidade, ampla diversidade de sequência e gama de bioatividades. Acredita-se que sua atividade de ligação à membrana seja um componente crítico de seu mecanismo de ação. Usando calorimetria de titulação isotérmica, estudamos a ligação dos ciclotídeos prototípicos kalata B1 e kalata B2 (e vários mutantes) a micelas de dodecilfosfocolina e bicamadas lipídicas contendo fosfoetanolamina. Embora a ligação seja predominantemente um processo impulsionado pela entropia, sugerindo que as forças hidrofóbicas contribuem significativamente para a formação do complexo ciclotídeo-lipídio, a ligação específica ao grupo principal fosfoetanolamina-lipídio também é necessária, o que é evidente a partir das mudanças entálpicas na energia livre de ligação. Além disso, usando uma combinação de medições de microbalança de cristal de quartzo dissipativo e refletometria de nêutrons, elucidamos o processo pelo qual os ciclotídeos interagem com as membranas de bicamada. Inicialmente, um pequeno número de ciclotídeos se ligam à superfície da membrana e, em seguida, inserem-se primeiro no folheto da membrana externa, seguido pela penetração através da membrana e formação de poros. Em concentrações mais altas de ciclotídeos, ocorre a desestabilização das membranas. Nossos resultados fornecem uma visão mecanicista significativa sobre como os ciclotídeos exercem suas bioatividades.

Este trabalho foi financiado em parte pelo Australian Research Council Grant DP0984390. A viagem foi financiada pelo Grant 04/08-N-40 da Australian Nuclear Science and Technology Organization para refletometria de nêutrons.

Ambos os autores contribuíram igualmente para este trabalho.

Bolsista em início de carreira do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica.

Endereço atual: European Spallation Source ESS AB, P.O. Box 176, SE 22100 Lund, Suécia.


Estrutura e função do domínio âncora de membrana da proteína não estrutural 5A do vírus da hepatite C

A proteína não estrutural 5A (NS5A) do vírus da hepatite C (HCV) é um componente essencial associado à membrana do complexo de replicação viral. Aqui, relatamos a estrutura tridimensional do domínio âncora de membrana de NS5A conforme determinado por espectroscopia de NMR. Uma alfa-hélice que se estende do resíduo de aminoácido 5 a 25 foi observada na presença de diferentes meios miméticos de membrana. Esta hélice exibiu um lado Trprich hidrofóbico embutido em micelas de detergente, enquanto o lado polar carregado foi exposto ao solvente. Assim, o domínio de âncora da membrana NS5A forma uma alfa-hélice anfipática no plano embutida no folheto citosólico da bicamada da membrana. Curiosamente, as mutações que afetam o posicionamento de resíduos totalmente conservados localizados na superfície citosólica da hélice prejudicaram a replicação do RNA do HCV sem interferir na associação de membrana de NS5A. Em conclusão, o domínio âncora da membrana NS5A constitui uma plataforma única que provavelmente está envolvida em interações específicas essenciais para a montagem do complexo de replicação do HCV e que pode representar um novo alvo para intervenção antiviral.

Copyright 2004 Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular, Inc.


Materiais e métodos

Materiais

Os lipídios usados ​​para preparar os NPs investigados são DOTAP, DOPC e DOPE-PEG2000 (referido aqui como PEG2K-lipídio), que foram adquiridos como soluções de clorofórmio da Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Para experimentos de fluorescência, os lipossomas foram preparados com 0,2% em peso de Texas Red & # x000ae - 1,2-dihexadecanoil- sn-glicero-3-fosfoetanolamina, sal de trietilamônio (Texas Red & # x000ae DHPE, excitação / emissão 595/615 nm) de Invitrogen (Carlsbad, CA). Quatro tipos distintos de DNA foram usados ​​para formar nanopartículas UltraPure Salmon Sperm DNA Solution (S-DNA) (Invitrogen (Carlsbad, CA)), Lambda Phage DNA (& # x003bb-DNA) (Thermo Scientific (Waltham, MA)), pGL3 DNA do plasmídeo Luciferase Reporter (pGL3) (Promega (Fitchburg, Wisconsin)), que foi propagado via Qiagen Plasmid Plus Mega Kit (Venlo, Limburg) e DNA de 11 bp (adquirido como fita simples da Sigma-Genosys (Sigma-Aldrich (St. Louis, MI) e entregue como um filme liofilizado). Fios simples complementares foram misturados a uma razão equimolar, diluídos para uma concentração final de 10 mg / mL, aquecidos em banho-maria e mantidos a 90 & # x000b0C por 15 min e lentamente resfriado à temperatura ambiente para permitir a hibridização completa. Para estudos de fluorescência, o DNA foi marcado usando YOYO-1 (Invitrogen (Carlsbad, CA)) de acordo com o protocolo do fabricante e # x02019s.

Preparação de lipossomas

Os lipossomas foram preparados misturando lípidos em soluções de clorofórmio na razão molar desejada em frascos de vidro. O solvente foi então evaporado usando uma corrente de nitrogênio seguido por dessecação a vácuo por 12 horas. A quantidade apropriada de água de alta resistividade (18,2 M & # x02126 & # x000b7m & # x022121) foi adicionada ao filme lipídico seco e incubado a 37 & # x000b0C durante a noite. As soluções de lipossomas foram sonicadas com um sonicador de ponta para produzir pequenas vesículas unilamelares.

Microscopia Eletrônica Cryo

As amostras foram preparadas misturando soluções de lipídio e DNA em uma concentração final de 3 mg / ml ou 30 mg / ml e incubando a solução CL & # x02013DNA por 20 minutos. Todas as amostras crio-EM foram formadas em água de alta resistividade, exceto para a Fig. 2A e a Fig. 3A, que foram formadas a NaCl 50 mM. Em seguida, 3 & # x000b5L de suspensão de amostra foi adicionado a um plasma limpo de fresco (limpador de plasma Solarus (Gatan Inc. (Pleasanton, CA) 25% O2, mistura de 75% de Ar) grade de 400-mesh grade Cflat, manchada com papel de filtro por 9 segundos e imediatamente vitrificado em etano líquido usando um Vitrobot (FEI Co. (Hillsboro, OR)). As grades foram armazenadas sob nitrogênio líquido até a transferência para o microscópio eletrônico para geração de imagens. As grades de gelo vítreo foram transferidas para o microscópio eletrônico usando um cryo - estágio que mantém as grades a uma temperatura de & # x02212170 & # x000b0C. As imagens foram capturadas usando um Tecnai F20 TEM (FEI Co.) operando a 120 keV equipado com uma câmera Gatan 4k x 4k CCD (Gatan Inc. (Pleasanton, CA)) usando o sistema de software Leginon. 46 Imagens de alta ampliação foram adquiridas usando um tamanho de pixel de 0,22 nm, as condições de imagem nominal foram um subfoco de

2,5 & # x000b5m, e uma dose de elétrons de

20 e & # x02212 / & # x000c5 2. As transformadas de Fourier e integrações azimutais foram geradas usando ImageJ.

CL & # x02013 NPs de DNA sobrecarregados coexistem com lipossomas e micelas filiformes tor & # x003c1chg & # x0003e 1 (razão molar de carga de lipídio catiônico para DNA aniônico) (A, B) Micrografia Cryo-EM de CL & # x02013 NPs de DNA formados em uma razão molar de 80/15/5 DOTAP / DOPC / PEG2K-lipídeo em & # x003c1chg = 3 com S-DNA. Em (A), a amostra foi preparada a 30 mg / mL, que é a concentração comumente usada em experimentos de raio-x de pequeno ângulo. A amostra em (A) foi extensivamente centrifugada para formar um pellet, ressuspensa e fotografada, mas mostra NPs sub-200 nm bem definidas. Em & # x003c1chg= 3, CL & # x02013 NPs de DNA (setas sólidas), lipossomas catiônicos (setas tracejadas) e micelas pequenas, ramificadas, semelhantes a fios (setas pontilhadas) coexistem em equilíbrio. Algumas das micelas filiformes parecem ser saliências de NPs de CL & # x02013DNA (setas vermelhas). Em (B) a amostra foi preparada a 3 mg / mL. (C) Uma amostra preparada em & # x003c1chg = 10 e 3 mg / mL (razão molar de lípido de 80/15/5 DOTAP / DOPC / PEG2K-lípido). A proporção de lipossomas (setas tracejadas) para CL & # x02013 NPs de DNA (setas sólidas) aumenta com & # x003c1chg como esperado. Pequenas micelas esféricas também são observadas (setas pontilhadas). (D) O potencial zeta de CL & # x02013 NPs de DNA em vários mol% PEG2K-lipídio saturado próximo a & # x003c1chg& # x02248 5. As linhas cinza tracejadas horizontais e verticais indicam & # x003b6 = 0 mV e & # x003c1chg = 1, respectivamente. (E) Gráfico do potencial zeta máximo e mínimo para NPs CL & # x02013DNA. Este potencial depende fortemente da% molar de lipídio catiônico. (F) Uma amostra de controle contendo apenas lipossomas (sem DNA). Mesmo com apenas 5% molar de PEG2K-lipídio, os lipossomas unilamelares (seta sólida) coexistem com micelas esféricas (setas pontilhadas). (G, H) Regiões cortadas (caixas tracejadas) de C, F). Pequenas micelas sub 5 nm são vistas (setas pontilhadas) DNA de salmão foi usado em todos os resultados mostrados.

CL & # x02013 NPs de DNA coexistem com micelas filiformes em altas concentrações. (UMA) NPs formados em & # x003c1chg = 3 com DOTAP / DOPC / PEG2K-lipídeo em uma razão molar de 80/15/5. com DNA de salmão. Perto da borda do buraco de carbono, CL & # x02013DNA NPs (seta sólida), lipossomas (seta tracejada) e micelas (setas pontilhadas) coexistem. Os lipossomas deformados (setas vermelhas) sugerem que a espessura da película de água suspensa é comparável ao diâmetro dos lipossomas. Isso é ainda comprovado pela organização espacial de todos os objetos com base no tamanho. O centro do filme de água mostra micelas semelhantes a fios altamente ordenadas com espaçamento uniforme. As extremidades das micelas filiformes são claramente visíveis (setas amarelas). Algumas regiões apresentam o que parecem ser pilhas de micelas ordenadas 2D (setas laranja). (B) Uma transformada de Fourier 2D da região em caixa em (A), mostrando dois anéis. (C) Uma integral radial da transformada de Fourier em (B) mostra dois picos de fator de estrutura sobrepostos em um fator de forma fraco. As posições de pico correspondem a qsobre= n (2 & # x003c0 / d) onde d = 14,3 nm (o espaçamento médio entre o centro de duas micelas). A mudança na inclinação em qm = 1,672 nm & # x022121 representa um fator de forma mínimo correspondente à espessura das micelas (& # x003b4m= 3,727 nm).

Espalhamento Dinâmico de Luz

As medições de tamanho e carga efetiva de complexos CL & # x02013DNA e nanopartículas (NPs) foram realizadas usando um Malvern Nanosizer ZS (Malvern Worcestershire, Reino Unido). Um total de 2 & # x000b5g de DNA e a quantidade apropriada de lipossoma (para atingir a razão de carga lipídica / DNA desejada) foram misturados em 1 mL do tampão apropriado (água de alta resistividade ou DMEM como indicado nas figuras) e incubados à temperatura ambiente por 20 minutos. A solução foi então transferida para cubetas para medição subsequente. Os gráficos mostram o diâmetro médio z Dz que é definido como Dz = & # x02329D 6 e # x0232a / & # x02329D 5 e # x0232a. 47 Todas as medições de potencial zeta foram realizadas em água de alta resistividade. Todos os pontos de dados para espalhamento de luz dinâmico e potencial zeta são a média de duas medições realizadas na mesma amostra. As barras de erro mostram o desvio padrão.

Microscópio Fluorescente

Amostras para microscopia de fluorescência foram preparadas usando os corantes descritos em Materiais. Um total de 50 & # x000b5L de amostra foi preparado na mesma concentração que para DLS (0,1 & # x000b5g de DNA e a quantidade apropriada de lipídeo com base na razão de carga desejada), e 2 & # x000b5l desta solução foi colocada entre uma lamela de vidro e lâmina e selada com graxa para vácuo. A solução foi fotografada com uma Nikon Diaphot 300 (Nikon (Tóquio, Japão)) equipada com uma Nikon 1.4 NA 60x Plan Apo DIC Objective e Sensicam QE CCD (PCO (Kelheim, alemão)).


Resumo

As interações de spin anisotrópicas medidas para proteínas de membrana em micelas fracamente orientadas e em bicamadas lipídicas orientadas fornecem restrições de alta resolução independentes e potencialmente complementares para determinação de estrutura. Aqui, mostramos que a proteína de membrana CHIF adota uma estrutura semelhante em micelas e bicamadas lipídicas, permitindo que as restrições de amostras de micelas e bicamadas sejam combinadas de forma complementar para melhorar a informação estrutural. O cálculo retroativo e a atribuição do espectro de NMR de CHIF em bicamadas lipídicas orientadas, a partir da estrutura determinada em micelas, fornece restrições adicionais para a determinação da estrutura, bem como a orientação global da proteína na membrana. O uso combinado de solução e restrições NMR de estado sólido também permite validação cruzada para a análise estrutural.

Em artigos com mais de um autor, o asterisco indica o nome do autor a quem as perguntas sobre o artigo devem ser dirigidas.


6. Estudos de difusão em bicelas

A difusão molecular, particularmente a difusão translacional, é o processo de transporte mais fundamental na natureza. É importante ressaltar que o movimento browniano em bicamadas lipídicas governa uma variedade de processos biológicos importantes que variam da transdução de sinal ao transporte de nutrientes através das membranas celulares, de modo que um corpo significativo da literatura é dedicado a este assunto. No entanto, o movimento browniano nas membranas lipídicas pode ser extremamente complexo devido à heterogeneidade da maioria dos sistemas biológicos, apenas um único coeficiente elegante, ou seja, o coeficiente de difusão lateral, ou seja, o componente do tensor de difusão que é perpendicular à bicamada normal, é necessário para descrever este processo complicado. A elegância desse coeficiente está na profundidade das informações que contém, principalmente na relação entre o difusor e seu ambiente. Os coeficientes de difusão lateral em uma membrana celular variam em ordens de magnitude: desde os fosfolipídios que se difundem rapidamente até as proteínas da membrana multi-hélice que se movem lentamente. Para espécies cujos tamanhos são comparáveis ​​ao de um lipídeo, seus coeficientes de difusão parecem seguir o modelo de volume livre, enquanto espécies maiores se difundem de acordo com o modelo hidrodinâmico. Atualmente, a maioria dos coeficientes de difusão são obtidos por meio de recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP), enquanto o rastreamento de molécula única é cada vez mais usado para estudar a difusão de moléculas no local. Essas técnicas ópticas são valiosas no fornecimento de informações detalhadas sobre a difusão molecular. No entanto, essas técnicas só funcionam se as moléculas são inerentemente fluorescentes. Portanto, uma abordagem alternativa é necessária para moléculas que não possuem essa propriedade óptica e onde a introdução de uma etiqueta fluorescente não é uma opção.

A espectroscopia de NMR fornece um meio alternativo de medir os coeficientes de difusão em um sistema de membrana modelo. Em particular, a técnica de RMN de gradiente de campo pulsado (PFG) introduzida por Stejskal e Tanner [66] evoluiu para uma ferramenta poderosa capaz de determinar os coeficientes de difusão para uma ampla gama de sistemas macromoleculares. O PFG NMR permite a determinação rápida e simultânea de múltiplos coeficientes de difusão de diferentes espécies, desde que suas ressonâncias sejam resolvidas. O uso do eco estimulado (STE) foi posteriormente considerado vantajoso para a medição dos coeficientes de difusão [170]. As publicações seminais [66,170] fornecem a estrutura teórica básica para medições de difusão de PFG NMR. Portanto, apenas uma breve descrição será dada aqui. O coeficiente de difusão de uma espécie, D, sob condição isotrópica, pode ser extraído de um experimento de STE-PFG NMR medindo a atenuação do sinal em função da duração do gradiente (& # x003b4), amplitude de gradiente (g) e tempo de difusão (& # x00394) conforme indicado na sequência de pulso da Fig. 9. A intensidade de NMR observada é atenuada de acordo com

Sequência de pulso de STE-PFG NMR composta por três pulsos de freqüência de rádio 90 & # x000b0 e dois pulsos de gradiente de amplitude e duração idênticas. O experimento de STE-PFG NMR é organizado de modo que o declínio da intensidade do eco, como uma função de & # x003b4, g ou & # x00394, é proporcional ao coeficiente de difusão da espécie de interesse.

Onde & # x003b3 é a razão giromagnética do núcleo observado e eu e eu0 são a intensidade do sinal observada e inicial, respectivamente [66,170].

A difusão lateral em um ambiente de bicamada lipídica é anisotrópica, de modo que o coeficiente de difusão é representado como um tensor de difusão de acordo com

Há simetria uniaxial em relação ao normal da bicamada e, portanto, apenas dois componentes principais são necessários para representar o sistema. Esses dois componentes correspondem à difusão molecular ao longo da perpendicular (D& # x022a5) e paralelo (D||) direções para a bicamada normal, conforme ilustrado na Fig. 8.

Em um sistema de bicamada lipídica, apenas dois componentes são necessários para descrever o tensor de difusão. A orientação relativa da bicamada normal e, portanto, os principais componentes da difusão em relação ao campo magnético externo é descrita pelo ângulo & # x003b8. Ele determina o componente D z z lab do tensor de difusão que se alinha com o campo magnético e pode ser medido.

Se o gradiente for aplicado ao longo do laboratório z-eixo, escolhido ao longo da direção do campo magnético externo B0 (ver Fig. 8), então apenas o Dzz componente do tensor de difusão na estrutura do laboratório é medido. O relacionamento entre Dzz e os componentes principais na estrutura molecular, que se alinham paralelamente e perpendicularmente em relação à bicamada normal, conforme descrito acima, são dados por

Se as moléculas que formam a fase têm uma concentração micelar crítica baixa (CMC), como é típico para lipídios em geral, então não há difusão detectável paralela ao normal da bicamada, D|| = 0. Assim, apenas o termo Dzz = D& # x022a5pecado 2 & # x003b8 permanece na Eq. (3). Curiosamente, para o caso em que a bicamada normal é perpendicular ao gradiente aplicado, o coeficiente de difusão observado na estrutura do laboratório (Dzz) é igual ao da difusão lateral (D& # x022a5) na bicamada lipídica. Portanto, a fim de medir o coeficiente de difusão de uma molécula em um sistema de bicamada lipídica, uma amostra alinhada é necessária e as bicelas fornecem um meio adequado para o propósito. Recentemente, Soong e Macdonald [171] demonstraram a viabilidade de medir a difusão de um lipídio enxertado com polímero, ou seja, DMPEPEG2000, em bicelas alinhadas magneticamente usando a técnica de NMR STE-PFG, a sequência de pulso é mostrada na Fig. 9.

O coeficiente de difusão é medido monitorando a decadência da intensidade do sinal de 1 H dos lipídios enxertados com polímero em função da duração do gradiente. O rápido movimento interno do PEG produz uma ressonância de 1 H estreita, o que tornou a medição viável. O coeficiente de difusão medido foi considerado comparável em magnitude às medições FRAP de DMPC na fase líquido-cristalina [171]. Portanto, isso ilustra a viabilidade das bicelas como um meio para os estudos de difusão lateral de anfifílicos associados à membrana em um ambiente de bicamada. Os resultados também demonstram a possibilidade de extrair o coeficiente de difusão de uma proteína de membrana via STE-PFG NMR, o que é importante para o nosso entendimento do tráfego de proteínas em bicamadas lipídicas. Portanto, isso ilustra que as bicelas são mais do que um mero meio de reconstituição de proteínas de membrana, na verdade, elas podem ser usadas como uma plataforma para estudos de difusão lateral via NMR. Um resultado interessante com relação à morfologia das bicelas também foi obtido nessas medidas de difusão: os constituintes moleculares exibem difusão livre em distâncias de mícrons. Esta observação é consistente com a morfologia das lamelas perfuradas de bicelas [172] e também corrobora com dados SANS [159] e estudos de difusão de tetrametilsilano em soluções diluídas de bicelas [156].

Estudos de difusão também podem ser feitos em bicelas com baixa q proporções (0,5 & # x02264 q & # x02264 1). Devido ao seu pequeno tamanho, essas bicelas giram isotropicamente, portanto, são adequadas para estudos de alta resolução de proteínas de membrana. Curiosamente, bicelles com um baixo q razão existem como agregados em forma de disco e são relativamente monodispersos em seu diâmetro e espessura. No q = 0,5, seu diâmetro estimado é de cerca de 8 nm, o dobro da espessura assumida da bicamada [152]. O diâmetro dessas bicelas de queda rápida muda na presença de peptídeos associados à membrana. Recentemente, essas bicelas têm sido utilizadas para a medição dos coeficientes de difusão lateral de peptídeos de ligação à membrana e os resultados são comparáveis ​​aos valores da literatura. Embora esses experimentos demonstrem a viabilidade do uso de bicelles para estudos de difusão, é preciso ter cuidado, pois o coeficiente de difusão lateral é medido em um sentido relativo, pois todos os componentes da amostra se difundem em taxas diferentes. Em particular, a bicela lipídica como um todo não fornece um quadro de referência estacionário, uma vez que ela mesma sofre uma difusão lateral substancial. No entanto, essas bicelas são excelentes sistemas de membrana modelo para a investigação da cinética de ligação de peptídeos associados à membrana e anfifílicos.

Medições de difusão por PFG NMR foram usadas para investigar a morfologia de três meios que são comumente usados ​​no estudo de acoplamentos dipolares residuais, ou seja, bicelas lipídicas orientadas, brometo de cetilpiridínio e uma mistura de PEG e n-hexanol [156]. O raio hidrodinâmico de micelas e bicelas isotrópicas foi medido por gradientes pulsados ​​bipolares [173]. Nessas medições, a lisozima foi usada como um composto de referência para corrigir as diferenças no volume hidrodinâmico entre a proteína seca e hidratada, bicela ou micela. O movimento dos lipídios constituintes em bicelas isotrópicas foi estudado por relaxamento 13 C, PFG NMR e EPR [174]. Descobriu-se que a mobilidade local depende muito mais do detergente usado do que do tamanho da bicela. Diferentes peptídeos foram encontrados para ter um impacto na dinâmica aparente. Em um estudo posterior, as medidas de difusão foram usadas para estudar o tamanho e a forma de bicelas de baixo q razão que tomba isotropicamente [175]. Três diferentes componentes lipídicos de cadeia longa, a saber, dilauroilfosfatidilcolina (DLPC), DMPC e DPPC, foram usados ​​para estudar a dinâmica lipídica em função da espessura da bicamada [176].

A difusão rotacional diz respeito aos graus de liberdade rotacional de uma molécula em contraste com o movimento translacional discutido até agora. Os lipídios, bem como as proteínas em uma amostra de bicamada, sofrem difusão rotacional, que ocorre mais livremente em torno da bicamada normal. Geralmente é rápido na escala de tempo de RMN, desde que sejam estudados proteínas e peptídeos de tamanho molecular moderado. Em espectros de NMR, a difusão rotacional torna-se evidente a partir da forma de linha de NMR observada conforme a média das interações de spin anisotrópicas ao longo do eixo de rotação altera a forma de linha espectral e a magnitude da interação. Como consequência, as vesículas multilamelares (MLVs) podem fornecer potencialmente as mesmas informações que as amostras macroscopicamente orientadas [6,7,177,178], e a escolha é principalmente determinada pela facilidade de preparação e questões de sensibilidade. No entanto, foi relatado que medidas estruturais para o peptídeo antimicrobiano PGLa podem ser influenciadas por diferentes níveis de hidratação presentes nas MLVs em comparação com dados obtidos de amostras macroscopicamente orientadas feitas de pilhas de placas de vidro [7]. Para bicelas em forma de disco, a difusão rotacional sobre a bicamada normal foi encontrada para ser rápida o suficiente para fazer a média da distribuição cilíndrica sobre esse eixo, mesmo nos raros casos em que a própria proteína incorporada não sofre difusão rotacional rápida o suficiente para a média necessária [179 ] Como resultado, mesmo proteínas e complexos de proteínas muito grandes são passíveis de estudos em bicelas não invertidas.


O que são Micelles? (com fotos)

Micelas são esferas de lipídios que se formam em soluções aquosas. Em humanos, eles se formam a partir de sais biliares. Esses agregados micelares ajudam a transportar os produtos digestivos dos lipídios até o intestino para serem absorvidos. Além disso, eles são usados ​​como detergentes.

Uma parte da comida que comemos é composta de óleos e gorduras. Estes são degradados durante a digestão no estômago, por uma enzima lipase, em compostos semelhantes a lipídios, incluindo ácidos graxos. Degradação adicional ocorre no pâncreas usando uma lipase diferente. As lipases são solúveis em água, ao contrário dos compostos que degradam. A degradação requer a ajuda de detergentes biológicos conhecidos como sais biliares, secretados pela vesícula biliar e pelo fígado.

As micelas são produzidas a partir dos sais biliares que ajudam a tornar os ácidos graxos e outros produtos de decomposição de lipídios disponíveis para degradação por uma lipase. O princípio da formação de micelas é como o do óleo que não se mistura com a água. Muitas classes de lipídios têm um grupo principal que é polar e interage bem com a água. Eles também têm dois grupos de cauda que são hidrofóbicos. Esses grupos de cauda não interagem bem com a água e preferem estar em grupos com outras moléculas hidrofóbicas, como uma forma de óleo.

Em baixas concentrações, os lipídios e ácidos graxos são solúveis em água. O fator determinante para a formação de micelas é quando esses compostos atingem uma concentração mais elevada, conhecida como concentração micelar crítica (CMC). Em concentrações maiores do que o CMC, os grupos de cauda hidrofóbicos se juntam espontaneamente para evitar a água. Os grupos de cabeças polares se projetam, voltados para a água, enquanto o centro está cheio de caudas hidrofóbicas que excluem a água. This generally gives the miceller aggregates the structure of a sphere, although they can be shaped like a disk.

Mixed micelles can be composed of various compounds that are not very soluble in water. These compounds are dissolved in the center of the sphere where they can blend in with the hydrophobic tails. In this manner, they are transported by micellar aggregates of bile salts to the intestine to be further broken down. These structures are the major way in which lipids get to the cell surface of the intestine to be absorbed. The rate of transport can be increased 1,000 times over that of individual fatty acids.

Cholesterol secreted by the liver can also travel in bile, in micelles. It is virtually insoluble in aqueous solutions, but is soluble in mixed micelles. Sometimes the body produces super-saturated bile with a high ratio of cholesterol. This can lead to gallstone formation. Other types of compounds that travel in these micellar aggregates are lipid-soluble vitamins, such as A, D, E, and K.

The structure of micelles is very similar to the lipid bilayer of biological membranes. The bilayers have the same type of interactions. The lipids, however, face each other giving a double layer of lipids instead of a sphere. The principle is the same as the structure of micellar aggregates with a hydrophobic interior and a polar exterior. Some types of lipids can readily exchange into the cellular membrane, from the micellar aggregrate.

Lipid bilayers can join ends to form a circle known as a liposome. These structures have an internal compartment. Liposomes are being used medically as carriers for drugs and enzymes. This allows doctors to target particular organs. It helps to avoid side effects like tissue damage and drug breakdown that can happen as drugs are introduced into the body by normal methods.

The compounds that make up micelles are also known as surfactants. These are compounds that are soluble in both oil and water. They allow compounds that are barely soluble in water to accumulate to higher concentrations within the micellar aggregates. The surfactant properties of these aggregates make them useful as detergents. They can dissolve oily deposits on clothes that will not wash off in water.

There is another type of micelle that is the reverse of the oil-in-water type. It has water-soluble substances dissolved in an organic solution. In this case, however, the polar head groups are in the center of the micelles, while the hydrophobic groups are on the outside, interacting with the organic solvent.


Resumo

Cellular respiration, mediated by the passive diffusion of oxygen across lipid membranes, is key to many basic cellular processes. In this work, we report the detailed distribution of oxygen across lipid bilayers and examine the thermodynamics of oxygen partitioning via NMR studies of lipids in a small unilamellar vesicle (SUV) morphology. Dissolved oxygen gives rise to paramagnetic chemical shift perturbations and relaxation rate enhancements, both of which report on local oxygen concentration. From SUVs containing the phospholipid sn-2-perdeuterio-1-myristelaidoyl, 2-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (MLMPC), an analogue of 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC), we deduced the complete trans-bilayer oxygen distribution by measuring 13 C paramagnetic chemical shifts perturbations for 18 different sites on MLMPC arising from oxygen at a partial pressure of 30 bar. The overall oxygen solubility at 45 °C spans a factor of 7 between the bulk water (23.7 mM) and the bilayer center (170 mM) and is lowest in the vicinity of the phosphocholine headgroup, suggesting that oxygen diffusion across the glycerol backbone should be the rate-limiting step in diffusion-mediated passive transport of oxygen across the lipid bilayer. Lowering of the temperature from 45 to 25 °C gave rise to a slight decrease of the oxygen solubility within the hydrocarbon interior of the membrane. An analysis of the temperature dependence of the oxygen solubility profile, as measured by 1 H paramagnetic relaxation rate enhancements, reveals that oxygen partitioning into the bilayer is entropically favored (ΔS° = 54 ± 3 J K −1 mol −1 ) and must overcome an enthalpic barrier (ΔH° = 12.0 ± 0.9 kJ mol −1 ).


Department of Biology (M 694), University of Konstanz, 78457 Konstanz, Germany

Department of Biology (M 694), University of Konstanz, 78457 Konstanz, Germany

Professor of Molecular Physiology and Biological Physics, University of Virginia, PO Box 800736, Charlottesville, VA 22908-0736, USA

Resumo

Thermodynamic Stability of FepA in Detergent Micelles

Thermodynamic Stability of OmpA in Phospholipids Bilayers

Thermal Stability of FhuA in Detergent Micelles

Insertion and Folding of β-Barrel Membrane Proteins in Micelles

Oriented Insertion and Folding into Phospholipid Bilayers

Assemblies of Amphiphiles Induce Structure Formation in β-Barrel Membrane Proteins

Electrophoresis as a Tool to Monitor Insertion and Folding of β-Barrel Membrane Proteins

pH and Lipid Headgroup Dependence of the Folding of β-Barrel Membrane Proteins

Rate Law for β-Barrel Membrane Protein Folding and Lipid Acyl Chain Length Dependence

Synchronized Kinetics of Secondary and Tertiary Structure Formation of the β-Barrel OmpA

Interaction of OmpA with the Lipid Bilayer is Faster than the Formation of Folded OmpA

Multistep Folding Kinetics and Temperature Dependence of OmpA Folding

Characterization of Folding Intermediates by Fluorescence Quenching

The β-Barrel Domain of OmpA Folds and Inserts by a Concerted Mechanism

Stoichiometry of the Lipid–Protein Interface

Lipid Selectivity of β-Barrel Membrane Proteins

Lipid Dependence of the β-Barrel Orientation Relative to the Membrane

Inclination of the β-Strands Relative to the β-Barrel Axis in Lipid Bilayers