Em formação

Existe uma diferença entre o Caldo Luria e o Caldo Lysogeny?


Existe alguma diferença entre Luria Bertani e Luria Broth? Ou ambos são a mesma coisa? É necessário autoclave o meio LB depois de feito?


Embora ambos os nomes sejam bastante comuns, ambos estão errados. No artigo original de 1951, Bertani estava estudando a lisogenia em E.coli, por isso ele chamou sua mídia para esse propósito de "Caldo de Lisogenia" ou, em suma, LB. Nas décadas subsequentes, esse nome foi transformado em "Luria Bertani" ou "Caldo de Luria", o que é incorreto. Veja as referências 1 e 2 para mais detalhes.

Para a segunda pergunta: É absolutamente necessário autoclave o meio após o preparo para evitar a contaminação e o crescimento de microrganismos que estão presentes em nosso ambiente. Apenas tornar a mídia estéril garante que possamos trabalhar com microorganismos definidos.

Referências:

  1. Estudos de Lisogênese I.
  2. As limitações do meio LB

Para que é usado o meio LB?

Clique para ler a resposta completa. Nesse sentido, por que usamos ágar LB?

Caldo Luria (LIBRA) é uma mídia rica em nutrientes comumente usado para cultivar bactérias no laboratório. A adição de ágar para LIBRA resulta na formação de um gel que as bactérias posso crescem, enquanto eles estão incapaz de digerir o ágar mas posso coletar nutrição do LIBRA dentro de.

Em segundo lugar, de que é feito o ágar LB? LIBRA Caldo, também conhecido como, LIBRA meio, caldo Lysogeny, caldo Luria ou meio Luria-Bertani, é um meio comumente usado nutricionalmente rico para a cultura de bactérias. Descrito pela primeira vez em 1951 por Giuseppe Bertani, um meio de 1 litro consiste em 10 gramas de triptona, 5 gramas de extrato de levedura e 10 gramas de cloreto de sódio.

A este respeito, qual é a diferença entre o ágar LB e o caldo LB?

Agar é um carboidrato gelatinoso complexo, e é adicionado ao Caldo LB, a fim de formar um gel para que as bactérias cresçam como uma cultura microbiana. LIBRA é um meio rico contendo peptona, extrato de levedura, NaCl e ágar (para meio sólido).


LB Media

LB é o meio mais comum usado para cultivar recombinantes Escherichia coli (E. coli) O LB media foi denominado por Giuseppe Bertani como “caldo de lisogenia” devido às pesquisas que realizava sobre lisogenia. LB é comumente referido incorretamente como Luria-Bertani media, Luria Broth ou Lennox Broth. A mídia LB também é usada para cultivar uma variedade de outros organismos facultativos.

Componentes da mídia LB

Uma razão pela qual o LB é comumente usado é porque ele é simples de fazer, com apenas alguns ingredientes, triptona, extrato de levedura e cloreto de sódio (NaCl). A triptona, uma mistura de peptídeos gerados pela digestão da caseína com a enzima pancreática tripsina, fornece nitrogênio e carbono. O extrato de levedura fornece vitaminas (incluindo vitaminas B) e alguns oligoelementos. O NaCl fornece íons de sódio para transporte e equilíbrio osmótico. E. coli derivada da cepa K-12, uma das cepas parentais mais comumente usadas de E. coli em uso na biologia molecular hoje são deficientes na produção de vitamina B.

Antecedentes históricos de LB

LB é um meio nutricionalmente rico que tem sido usado desde a década de 1950 para a cultura de Enterobacteriaceae e para ensaios de placa bacteriófago. LB permite um crescimento rápido com bons rendimentos de crescimento para muitas espécies. Em 1951, Giuseppe Bertani desenvolveu LB para otimizar a formação de placa em um Shigella cepa indicadora de Enterobacteriaceae. Hoje, a mídia LB é a mídia mais comum para o crescimento de cepas recombinantes de E. coli. Existem três formulações comuns de LB: LB Miller, LB Lennox e LB Luria. Todos são às vezes chamados de LB, embora a formulação de LB Miller seja a formulação comum ou mais padrão de LB. As formulações alternativas de LB variam na concentração de NaCl (Tabela 1).

Tabela 1. Formulações de LB.

Ingredientes % Luria (g / L) Lennox (g / L) Miller (g / L)
Triptona 1.0% 10 10 10
Extracto de levedura 0.5% 5 5 5
Cloreto de sódio (NaCl) 0,05, 0,5 ou 1,0% 0.5 5 10

A confusão sobre o nome LB é compreensível, dada a história de Bertani, Luria e Lennox. Giuseppe Bertani era membro do laboratório Luria na Universidade de Indiana quando formulou a mídia LB. Ed Lennox também foi membro do laboratório Luria e trabalhou com Bertani em alguns dos primeiros experimentos de lisogenia utilizando Shigella. Salvador Luria publicou um artigo em 1955 no qual copiava a formulação original de Bertani e LB às vezes é incorretamente atribuído a Luria devido à sua estatura científica e, portanto, também pode ser incorretamente referido como Caldo de Luria. A formulação original de Bertani era 1,0% de Bacto triptona (10,0 g / L), 0,5% de extrato de levedura (5,0 g / L), 1,0% de NaCl (10,0 g / L), 0,1% de glicose (1,0 g / L) pH ajustado para 7,0 com NaOH 1 N. A glicose foi adicionada após a autoclavagem. Com o tempo, a adição de glicose foi eliminada de todas as formulações de LB. O nome Miller vem da formulação do livro Experimentos em Biologia Molecular por Jeffery Miller, publicado em 1972, que não contém glicose. A formulação original e mais comum de LB, Miller, contém NaCl a 1,0%. Em 1955, Ed Lennox estava estudando mecanismos de síntese de DNA utilizando cepas de E. coli sensível ao estresse osmótico desenvolveu uma formulação de LB contendo metade do sal da formulação original, ou seja, 0,5% de NaCl. Esta formulação é conhecida como LB Lennox. Hoje, LB Lennox é usado para o cultivo de E. coli ao usar antibióticos sensíveis ao sal, como Blasticidina, Puromicina e Zeocina. Uma terceira formulação de LB, contendo a menor quantidade de sal, é referida como LB Luria. Esta formulação contém 0,05% de NaCl. LB Luria é usado para isolar organismos marinhos, como Vibrio cholerae.

Mecanismos de crescimento em LB

A mídia LB foi originalmente projetada para o crescimento de bactérias em baixas densidades. O crescimento exponencial, um período de crescimento em estado estacionário, é estimado para terminar quando o OD600 (densidade óptica a 600 nm) está entre 0,6 e 1,0. Sabe-se que o crescimento de E. coli em LB geralmente para quando o OD600 atinge aproximadamente 2,0 em condições normais de crescimento, correspondendo a aproximadamente 0,6 mg E. coli (peso seco) por mL. Em 2007, D’Ari e colegas realizaram um estudo abrangente das características de crescimento em LB, olhando especificamente para a fisiologia de E. coli K-12, uma das cepas mais comuns utilizadas na biologia molecular hoje. Eles demonstraram que as células K-12 cresceram no LB Miller com um OD final600 de 0,6 -1,0 nem sempre estão no mesmo estado fisiológico. D’Ari e colegas de trabalho confirmaram observações anteriores de crescimento diauxic (crescimento em duas fases) em LB e notaram que o crescimento exponencial parou em

OD600 0.3, muito mais cedo do que comumente se pensa. Sabe-se que E. coli é conhecido por ter um crescimento fraco quando o pH excede 9,0, e não é incomum que o meio LB mude para um pH próximo a 9,0. No entanto, quando D’Ari e colegas de trabalho ajustaram o pH de LB, não houve efeito na curva de crescimento, ao passo que, quando a glicose foi adicionada à mídia, as culturas puderam crescer para DO600 6,49. Isso sugere que o crescimento de E. coli em LB é limitado em carbono. Como observado, a formulação original de LB por Bertani continha 0,1% de glicose. Esta pesquisa demonstra que embora o LB seja um bom meio para o crescimento de rotina, ele não deve ser usado para estudos fisiológicos onde a reprodutibilidade e um período prolongado de crescimento exponencial são necessários.

LB e Seleção

Há uma variedade de aditivos que podem ser adicionados ao meio LB para identificação ou seleção de uma população de organismos. Os antibióticos são frequentemente adicionados ao meio LB para selecionar células que foram projetadas para ter resistência a um ou mais antibióticos. X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo) ou Bluo-Gal (indolil-β-galactosídeo halogenado) pode ser adicionado ao meio LB para triagem azul-branca para inserção de sequência em um local de clonagem múltipla (MCS) em um plasmídeo contendo o fragmento α do gene da β-galactosidase. Para induzir a expressão de genes controlados pelo promotor lac, o análogo da lactose não metabolizável IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo) é adicionado ao meio. Em bactérias onde não há sequência inserida no plasmídeo, as colônias de MCS serão azuis, uma vez que X-Gal ou Bluo-Gal serão clivados pela β-galactosidase para formar 5-bromo-4-cloro-indoxil. Para plasmídeos onde há uma inserção, não haverá uma β-galactosidase funcional e as colônias permanecerão brancas.


Lisogenia em meados do século XX: P1, P2 e outros sistemas experimentais

A maioria de nós que faz pesquisas tem um material preferido, um conjunto de técnicas bem testadas, uma lista permanente de problemas não resolvidos, maneiras de ver ou de fazer as coisas, que compartilhamos em grande parte com colegas no mesmo laboratório e outros em a mesma área de especialização, sejam eles amigos, ex-associados ou concorrentes. Tudo isso e muito mais está englobado pelo conceito de & # x0201sistema experimental & # x0201d, conforme apresentado e usado por Hans-J & # x000f6rg Rheinberger (76, 77), um historiador da ciência. Seu conceito, bastante flexível e rico em metáforas, pode ser facilmente adaptado à presente narrativa, que parte de uma visão pessoal e não de um exame histórico crítico. Uma restrição cuidadosa de material, técnicas e nomenclatura permite interações mais construtivas entre diferentes laboratórios e diferentes gerações de cientistas no mesmo campo. É claro que, levado a cabo em excesso, esse processo vai sufocar o desenvolvimento de novas áreas e adiar algumas descobertas. Max Delbr & # x000fcck, que no início dos anos 40 havia defendido vigorosamente o estudo do bacteriófago como a estrada real para os segredos da replicação e recombinação, foi bastante franco sobre a necessidade de os trabalhadores dessa estrada usarem um material comum (os fagos T em Escherichia coli B) e técnicas precisamente padronizadas (1). Claro, os fagos T são geralmente parasitas virulentos e não prisioneiros de bactérias e, portanto, não poderiam nos instruir sobre as interações mais sombrias entre bacteriófagos & # x0201cweaker & # x0201d e seus hospedeiros bacterianos: sobre a lisogenia, onde a infecção encontra a hereditariedade.

O termo lisogênico & # x02014gerando lise & # x02014 foi aplicado logo após a descoberta dos bacteriófagos e foi usado inicialmente de maneiras amplamente descritivas e acríticas. Por outro lado, as culturas bacterianas que espontaneamente (ou seja, na ausência de infecção óbvia do exterior) produziram bacteriófagos, mas cresceram bem, sem evidências grosseiras de lise, foram isoladas já em 1922. Interpretações variadas foram debatidas para frente e para trás por vários anos, de forma bastante feroz na comunidade francófona de pesquisa médica. Embora o desenvolvimento do conceito tenha sido bem resumido (68), ele merece um olhar sério do ponto de vista da história e da filosofia da ciência. O sabor dos debates é transmitido por um dos participantes, Paul Flu (42, ver também a referência 84). Eug & # x000e8ne Wollman (90, 91) do Institut Pasteur foi um dos poucos que viu na época as implicações genéticas dos conceitos de lisogenia. A genética era então bastante subdesenvolvida nos países latinos da Europa, sendo a imunologia a estrela do dia nos bairros médicos. Além disso, o debate raramente se concentrava em um tipo de experimento com material bem definido e geralmente disponível. No início dos anos 30, chegou-se a uma definição de lisogenia (26) que ainda é válida, obviamente sem implicações moleculares modernas. Anlage, uma palavra alemã usada em embriologia, foi aplicada por Burnet e McKie (27) ao que hoje chamamos de profago. O conceito de Anlage ou profago baseava-se no fato de ninguém ter conseguido, por diversos métodos, demonstrar a presença de partículas fágicas infecciosas no interior de uma bactéria lisogênica. A Segunda Guerra Mundial interrompeu grande parte desse trabalho. Os Wollmans morreram e Flu mal sobreviveu nos campos de concentração nazistas. Burnet assumiu um trabalho mais voltado para a área médica.

Eu encontrei a lisogenia no início de 1949 enquanto estava em Cold Spring Harbor como pesquisador no laboratório de Milislav Demerec. Eu estava estudando mutação espontânea e induzida em um dependente de estreptomicina E. coli Cepa B. Nunca havia trabalhado com bactérias antes. Intrigado uma vez com uma colônia que parecia setorialmente mordiscada, mostrei-o a Evelyn Witkin e ao falecido Gus Doermann, que, felizmente para mim, tinham seus laboratórios ao lado do meu quarto. Eles sugeriram a explicação óbvia, contaminação por fago, mas um deles adicionou & # x0201cHá também algo chamado lisogenia & # x02026 & # x0201d (Na verdade, naquela época a palavra em inglês usada era lisogênese ou lisogenicidade.) Eu nunca tinha ouvido falar de lisogenia antes (embora eu tivesse sido exposto aos trabalhos de Paul Buchner [25] sobre endossimbiose) e comecei a procurar mais informações na biblioteca.

Quase ao mesmo tempo, sem que eu saiba, dois eventos importantes aconteceram. Em Madison, Esther e Joshua Lederberg, no decorrer de seu trabalho na cepa K-12 de E. coli, então a única bactéria & # x02014 se separa de Pneumococo& # x02014 conhecido por trocar material genético, isolou um mutante que lisou inesperadamente quando em contato com a cepa parental. Eles chegaram à conclusão de que a cepa K-12 original era lisogênica para um fago anteriormente insuspeitado, que chamaram de lambda, pensando que poderia ser algo como o fator kappa de Tracy Sonneborn em Paramecium. Isso foi brevemente comunicado na primeira edição (janeiro de 1950) da publicação real do Boletim de Genética Microbiana informal de Witkin muito mais tarde (58). Em Paris, Andr & # x000e9 Lwoff, um conhecido protozoologista e fisiologista bacteriano, levantou a questão de como as partículas de fago são produzidas por bactérias lisogênicas. O problema foi bravamente atacado por micromanipulação direta de um indivíduo, ou um pequeno número de bactérias lisogênicas, o superdimensionado Bacillus megaterium, cultivada em uma gota de caldo sob o microscópio. Em intervalos, o líquido ao redor da bactéria era removido, substituído por caldo fresco e, em seguida, testado para a presença de bacteriófago. Ao mesmo tempo, o número de bactérias na gota foi registrado e a gota foi examinada em busca de bactérias que pudessem estar em lise. Um resultado importante foi que, quando a gota continha fagos, eles estavam presentes em grande número, como se poderia esperar da súbita lise de uma ou mais bactérias. Por outro lado, foi mostrado que a bactéria pode crescer e se dividir várias vezes sem produzir qualquer fago. No entanto, a correlação da produção de fago com a lise celular não pôde ser demonstrada imediatamente. Isso foi posteriormente esclarecido pela descoberta de que B. megaterium as células tinham a propriedade de lisar espontaneamente e não produtivamente, deixando um fantasma celular visível, enquanto a lise ligada à produção de fago era extremamente rápida e não deixava vestígios microscopicamente visíveis dos corpos bacterianos (69, 70).

No outono de 1949, ingressei em Salvador Luria na Indiana University em Bloomington. Enquanto estávamos fazendo planos de trabalho, propus que estudasse a lisogenia. Luria não gostou muito disso, pois tinha em mente outros problemas relacionados ao desenvolvimento do virulento fago T2 (no qual, entretanto, trabalhei por vários meses). Talvez & # x02014 estou supondo & # x02014ele não mencionou a lisogenia em sua proposta de bolsa de pesquisa. & # X02009. & # X02009. & # X02009. Mesmo assim, ele foi muito cooperativo e prometeu tentar obter algumas cepas que eu pudesse usar para estudar a lisogenia. Na verdade, em janeiro de 1950, recebemos do Lederbergs cepas indicadoras que poderiam ser utilizadas com K-12 e também a cepa clássica Lisbonne, um lisogênico E. coli cepa isolada no início dos anos 20 por M. Lisbonne e L. Carr & # x000e8re, juntamente com seus Shigella indicador. Eu imediatamente comecei a trabalhar em ambos os conjuntos de linhagens, observando suas propriedades culturais e tentando otimizar o crescimento e a formação de placas. A vantagem óbvia do K-12 e do lambda era que se podia combinar o estudo do fago com o da recombinação bacteriana, como os Lederbergs de fato também haviam começado a fazer. A alternativa exigia o uso de Shigella, oficialmente um patógeno, o que exigiria precauções de segurança de laboratório mais rigorosas do que o uso de E. coli. Infelizmente, algumas semanas depois, Luria conheceu Joshua Lederberg em alguma reunião e entendeu que ele e Esther teriam preferido se eu não trabalhasse com lambda. Fiquei um tanto aborrecido na época, embora reconhecesse que o pedido dos Lederbergs estava dentro de seus direitos, já que sua descoberta de lambda ainda não havia sido publicada na literatura aberta. Luria, Jim Watson (então em seu último ano de pós-graduação em Bloomington) e eu estávamos compartilhando um pequeno laboratório, do qual um canto fora aberto para a mesa de Luria. Num fim de tarde, tivemos uma séria discussão sobre como proceder em vista do pedido dos Lederbergs. Lembro-me de Jim declarando no topo de sua voz que ele não gostaria de estar em um laboratório onde se usava rotineiramente o presumivelmente patogênico Shigella. Mesmo assim, Luria me convenceu a deixar lambda em paz, pelo menos por um tempo, e aceitei o desafio de ter um cuidado extra no manuseio Shigella. Olhando para trás, no entanto, parece que esse episódio menor nunca me permitiu desenvolver o sentimento adequado & # x0201 pelo organismo & # x0201d (43) com respeito a lambda.

Usando a linhagem Lisbonne (simbolizada por brevidade como Li) e Shigella, Comecei a investigar essencialmente o mesmo problema de Lwoff. Tendo sofrido os cansaços da micromanipulação no decorrer do meu trabalho de tese (4), nunca me passou pela cabeça a ideia de utilizar a sua abordagem. Além disso, a produção de fagos em lisogênicos B. megaterium é incomumente alto (por exemplo, uma partícula de fago livre para cada duas bactérias) em comparação com outras cepas lisogênicas (uma pequena porcentagem de fago livre), de modo que a abordagem microscópica direta dificilmente teria sucesso com a maioria das cepas. Eu me isolei pela primeira vez de Shigella um mutante resistente à estreptomicina (mais tarde conhecido como Sh / s ou Sh-16) e mostrou que o fago produzido pelo lisogênio Li não foi afetado pela estreptomicina. Em seguida, configurei o que chamei de um experimento de explosão única & # x0201cmodificado & # x0201d, no qual bactérias lisogênicas em crescimento exponencial (lavadas para eliminar qualquer fago livre) foram distribuídas entre um conjunto de tubos e, após incubação adicional, todo o conteúdo de cada tubo foi plaqueado com o indicador resistente à estreptomicina e uma gota de estreptomicina. Esta técnica classifica apenas o fago livre presente no momento do plaqueamento e não o fago que a bactéria lisogênica produziria, na ausência de estreptomicina, nas placas. Se o fago fosse produzido continuamente durante o crescimento do lisogênio, as placas teriam placas distribuídas aleatoriamente. Se as culturas lisogênicas produzissem fago em & # x0201cbursts, & # x0201d como quando uma célula sensível a fago é infectada por um fago virulento, a maioria das placas não teria placas e algumas teriam um grande número de placas, isto é, presumivelmente, toda a progênie de fago de uma bactéria. Uma vez que os parâmetros foram ajustados, o experimento funcionou perfeitamente (5). Ele confirmou que a produção de fago por um lisogênio era descontínua, envolvendo raros e grandes surtos de fago. Assim, um dia de trabalho permitia medir a frequência da produção espontânea de fagos, mesmo em níveis muito baixos (uma explosão por 45.000 gerações de células para a cepa Li), e o tamanho médio da explosão: mais do que se poderia obter em meses de micromanipulação. Mas havia uma surpresa guardada: enquanto o fago recuperado de culturas da cepa Li era conhecido por ser bastante heterogêneo quanto ao tamanho da placa, em meu experimento as placas pareciam diferentes em explosões diferentes. Uma investigação posterior mostrou que a cepa Li de fato produziu três tipos imunologicamente distintos de fagos, que denominei P1, P2 e P3, todos os três capazes de estabelecer de forma independente a lisogenia no Shigella cepa e que via de regra foram produzidos em bursts homogêneos, independentes um do outro (5). Continuei trabalhando com os fagos da cepa Li, dando atenção especial ao P2, no qual era relativamente fácil reconhecer vários mutantes do tipo placa.

Enquanto isso, no Pasteur, Lwoff e vários colaboradores estavam procurando por condições que pudessem afetar a & # x0201cdecisão & # x0201d de uma célula lisogênica para mudar do crescimento normal para a produção suicida de uma explosão de fago. Após o fracasso de vários tratamentos químicos, eles obtiveram um sucesso dramático: a exposição a uma dose muito pequena de luz ultravioleta causou quase todas as bactérias em seus B. megaterium culturas para lisar e produzir uma explosão de fago (71). A descoberta da indução UV, como o novo fenômeno foi chamado, atraiu muita atenção para a lisogenia. Mesmo Delbr & # x000fcck, que apenas alguns anos antes havia expressado dúvidas sobre isso (39), abraçou a lisogenia, principalmente, deve-se acrescentar, por meio do entusiasmo de seu colega Jean Weigle, professor de física da Universidade de Genebra, que teve só então aposentou-se precocemente e se comprometeu a pesquisar o fago (83). Logo foi descoberto que também um fago em Pseudomonas (51) e lambda em E. coli K-12 (89) pode ser induzido por luz ultravioleta. Por outro lado, minhas tentativas de induzir as cepas Li ou Sh (P2) (ou seja, Shigella isolados tornados lisogênicos para P2) foram totalmente negativos. Isso foi decepcionante, mas também foi a primeira indicação de que pode haver diferenças biológicas básicas entre os sistemas lisogênicos.

Várias questões interessantes sobre a lisogenia foram abertas. Em uma bactéria lisogênica estabelecida, haveria uma cópia do profago ou muitas cópias? Se fosse apenas um, como seria segregado regularmente na divisão celular? E qual era o modus operandi da imunidade à superinfecção? Imunidade era devido a um produto específico de profago difusível (& # x0201 substância imunológica & # x0201d, & # x0201crepressor & # x0201d), que bloquearia o desenvolvimento de um fago superinfetante, ou era o resultado de alguma interação necessária com um sítio bacteriano especial ? Cruzamentos bacterianos preliminares por Esther Lederberg, mencionados em seu relatório de 1950, indicaram algum tipo de ligação, embora complexa, entre a lisogenia lambda e certos marcadores genéticos no K-12. A possibilidade de controle cromossômico de uma população de elementos citoplasmáticos (como no caso de kappa em Paramecium) não foi excluída. Eu usei mutações do tipo placa P2 como marcadores na superinfecção de Sh (P2) células lisogênicas, tentando seguir o destino do fago superinfetante. Este último, descobriu-se, não foi degradado ou rejeitado pelo sistema de imunidade do lisogênio, ele só foi bloqueado em sua replicação (como & # x0201csuperinfecção pré-profago & # x0201d) e distribuído aleatoriamente para as células filhas à medida que o lisogênio continuou a crescer e se dividir . Quando uma célula que o carregava acontecia de lisar, o fago superinfetante participaria da explosão essencialmente em pé de igualdade com o profago. Em raras ocasiões, o profago residente (ou alguns de seus genes) seria substituído pelo tipo superinfetante. Ainda mais raramente uma cepa estável duplamente lisogênica seria estabelecida. Um mutante P2 (o tipo de placa clara & # x0201cweak virulent & # x0201d) que perdeu a capacidade de lisogenizar pode ser transportado no estado bloqueado por várias gerações de células e, raramente, até se comportar como um segundo profago, ou seja, ser herdado por todos células descendentes, enquanto o profago original (tipo de placa turva) estava presente, ele se comportou como esperado de um mutante com uma mutação recessiva afetando a imunidade. Esses resultados (6, 7, 8, 9, 10), embora abertos a interpretações mais complexas, apoiaram bem tanto a ideia de um profago, ou excepcionalmente dois, por célula bacteriana (mais precisamente, por nucleóide) e o conceito de um específico produto profago interagindo com o fago superinfectante. Enquanto isso, uma nova variedade de E. coli, mais tarde chamado C (16), apareceu em cena, indiretamente resultado de um achado de Cavalli e Heslot (35). A cepa C foi sensível a lambda e a todos os fagos da cepa Li, deu placas decentes com P2 e, além disso, (35) cruzaria com as cepas K-12. Gradualmente, mudei de Shigella para a cepa C na maior parte do trabalho com P2, e então os cruzamentos bacterianos para estabelecer a localização cromossômica do profago poderiam ser realizados (10, 14). Embora eu aqui enfatize o trabalho com P2, a maioria dos leitores saberá que durante aquele período (1951 a 1957) um rápido progresso foi feito na compreensão da genética do K-12 e lambda, conforme então revisado (53) por dois de seus principais colaboradores . Ficou bastante claro que o próprio profago lambda estava na verdade ancorado em um local específico, a princípio considerado o único possível, no cromossomo bacteriano. Uma análise detalhada de ligação (28) e as então novas noções de circularidade cromossômica levaram à proposta de Allan Campbell de seu conhecido modelo de integração.

Fora da lisogenia, P1 e P2 também contribuíram de forma mais geral para o progresso inicial da genética bacteriana. (Pouca coisa já foi feita com P3.) Um exemplo é a descoberta da & # x0201 variação controlada pelo preço & # x0201d, agora mais comumente chamada de & # x0201 restrição e modificação. & # X0201d Notei isso em (usando a cepa B como o hospedeiro de restrição P2 , Shigella sendo o host padrão) e não sabia o que fazer com isso. Jean Weigle, com quem frequentemente me correspondia, percebeu isso em lambda (usando a cepa C como hospedeiro permissivo, sendo K-12 o hospedeiro padrão). Estando ciente dos meus resultados, ele reconheceu imediatamente as semelhanças entre as duas descobertas. Pouco antes disso, um pequeno acidente de laboratório, como relatado por Luria (66), levou à descoberta de outro caso, embora mais complexo, de variação controlada pelo hospedeiro (67). Embora nenhuma explicação mecanicista satisfatória estivesse à vista na época, Jean e eu ficamos encorajados com o paralelismo entre nossos dois sistemas totalmente independentes & # x0201sistemas & # x0201d e decidimos publicar nossas descobertas juntos (16). Raramente acontece que um novo fenômeno, observado em dois sistemas diferentes, em laboratórios diferentes, seja descrito no mesmo artigo, de forma comparativa. Isso fortaleceu a evidência e deu a entender a generalidade do fenômeno, enquanto marcava um ponto para cooperação versus competição na ciência e nos assuntos humanos. (Um caso semelhante, vários anos depois, foi o de um artigo de Ren & # x000e9 Thomas e Elizabeth Bertani [87], que relatou experiências paralelas com lambda e com P2 para definir mais precisamente o modo de ação do repressor da imunidade.) Crescimento P2 em E. coli B levou a outro achado inesperado: a presença de um profago defeituoso (relacionado a P2, mas com uma especificidade de imunidade diferente) nesta cepa hospedeira de fago mais tradicional (37). Hoje, os profagos defeituosos são uma descoberta quase diária nas análises genômicas de bactérias.

P1 também deu algumas surpresas. Seu estabelecimento de lisogenia em Shigella foi quase absolutamente controlada pela temperatura (17): frequências muito altas de lisogenização e nenhuma produção de fago imediata quando as bactérias infectadas foram mantidas a 20 & # x000b0C após a infecção, 100% de lise com produção de fago a 40 & # x000b0C. Esta propriedade foi aparentemente perdida quando P1 foi & # x0201 adaptado, & # x0201d por meio de pelo menos duas etapas mutacionais, k e c (60, 88), para crescer de forma mais eficiente no K-12, e ninguém voltou ao estudo do tipo selvagem original em Shigella. A razão para essa negligência, é claro, é o fato de que P1 foi considerado capaz de transdução e começou a ser usado quase exclusivamente em derivados K-12. Transdução, descoberta em 1951 por Zinder e Lederberg em Salmonella (94), e correlacionado ao fago P22, permitiu a análise genética de mutações intimamente ligadas, mas nenhum mapeamento bruto. Por outro lado, o mapeamento de estrutura fina ainda era impraticável com E. coli K-12. O crédito por descobrir essa capacidade de P1 vai para Ed Lennox, um físico então em processo de conversão para a biologia, que certa manhã no início de 1954 entrou em nosso laboratório proclamando: & # x0201cJoe, vamos tentar ver se seus fagos podem transduzir! & # x0201d Eu tinha então alguns mutantes auxotróficos da cepa C que poderiam ser usados ​​para testar a ideia. Fizemos o experimento no dia seguinte e descobrimos que de fato P1 (mas não P2) era um transdutor muito eficiente. Ainda tenho a cópia de uma carta para Jean Weigle, datada de 16 de abril, onde escrevi com entusiasmo excessivo: & # x0201c Passamos uma semana de grande empolgação (ou seja, Ed Lennox e eu). Meu fago P1 pode fazer a transdução. P1 cultivado em Shiga pode transduzir o caractere de arginina em coli C, um marcador de Galactose também em coli C, e um marcador de estreptomicina em coli B. Suficiente? & # X02026 Será possível estudar transdução e recombinação genética no mesmo organismo, comparar o efeito da temperatura na lisogenização e talvez na transdução, talvez ter sucesso na transdução do profago P2 através do fago P1 et cetera et cetera. & # X0201d O achado foi relatado na reunião de Oak Ridge sobre recombinação genética naquela mesma primavera (59) e foi seguido por um artigo muito abrangente de Lennox (60). Ambos Lennox (60) e Jacob (52) demonstraram cotransdutibilidade do profago lambda com marcadores bacterianos. Posteriormente, os profagos P2 em três locais diferentes foram co-transduzidos e orientados por meio de P1 (31).

Enquanto os geneticistas mais velhos infectavam e se cruzavam, os métodos do que hoje é a biologia molecular entraram em cena, na esteira da microscopia eletrônica e da ultracentrifugação. Ao longo de algumas décadas, o entusiasmo pelo lambda como um sistema experimental fez do lambda o paradigma para a lisogenia (47, 48, 75, 82). Agora é tão conhecido até o nível molecular que é modelado in silico com utilidade (2). P1 também atraiu numerosos seguidores, a princípio como uma ferramenta na transdução e depois por conta própria (93), devido ao seu comportamento cromossômico incomum (50). Alguns, inclusive eu, continuaram trabalhando no P2, embora às vezes com um sentimento de isolamento e a preocupação de que talvez suas diferenças de lambda não fossem suficientemente importantes para justificar o esforço. Isso, creio eu, acabou não sendo o caso (12).

As partículas de P2 e lambda diferem estruturalmente. Ao contrário de lambda, a replicação do DNA P2 segue um modelo típico de círculo rolante ao longo de seu ciclo reprodutivo (54, 64, 73, 79). Isso foi sugerido por duas descobertas impressionantes, os requisitos estritos da replicação do DNA P2 para a função Rep da célula hospedeira (32) e para um cisproteína de fago de ação (62), como é o caso do fago virulento muito diferente, & # x003c6X174. A encapsidação ocorre diretamente dos círculos monoméricos (74). Vários locais de fixação específicos de P2, diferentes daquele de lambda, existem no cromossomo bacteriano (3, 14, 33, 55). A recombinação genética em infecções mistas P2 ocorre com frequência extremamente baixa (11, 15): o mapa genético P2 (13, 61) teve que ser obtido com a ajuda da irradiação UV para estimular a recombinação. O circuito regulador P2, lise versus lisogenia, é mais simples (78) do que lambda. O mecanismo de integração do profago P2, embora seja uma recombinação local específica típica, tem características especiais (20, 30, 46), em parte responsável por bloquear o desprendimento do profago na desrepressão. Nenhum caso de transdução especializada é conhecido em P2, por outro lado, seu evento complementar & # x02014 redução de um marcador bacteriano & # x02014 foi descrito (56). Um grande impulso para os estudos P2 foi a descoberta em 1966 por Erich Six (81) do notável fago satélite P4 e suas interações complexas (& # x0201ctransativação & # x0201d) com P2 e fagos semelhantes a P2 (22, 29, 36, 65) . Uma série de observações muito intrigantes, peculiares a P2, permanecem incompletamente compreendidas e merecem um estudo mais aprofundado: efeitos metabólicos impressionantes na frequência de lisogenização (18, 19) sensibilização celular a um pequeno produto molecular (21) as interações complexas entre o gene P2 não essencial velho, a célula hospedeira e um fago lambda de co-infecção (24, 44, 63, 72, 80) e outros. Based on the results of screens of coliforms in Paris and Los Angeles (23, 53) and the Dhillons' extensive work in Hong Kong (40), it became clear that—to the extent that modern notions of segmental evolution (57) allow it— P2 and lambda are representative of two main groups of temperate phages for such bacteria. Within the P2-like group, phage 186 was studied in great genetic and molecular detail by Barry Egan and his students (41, 92) phage 299 was studied to a lesser extent by E. I. Golub (45). More recently, other phages obviously related to P2 have been encountered in several other species besides E. coli and as defective prophages in DNA sequencing studies (34).

The above recollections seem to indicate that at about the middle of the last century, starting before the formulation of the DNA structure and independently of the introduction and diffusion of “molecular” methods of analysis, there was a confluence of the rigorous approach of phage work with more traditional bacteriological perspectives, energized by the new remarkable findings about gene transfer. Studies of lysogeny were rather central in this process of broadening interest with respect to problems and materials. As a result, several new 𠇎xperimental systems” à la Rheinberger were developed in the fifties and sixties, lambda being the most successful. One is tempted to generalize these observations and suggest that it is the way of scientific progress to alternate between periods of broad and somewhat haphazard exploration and periods of highly focused in-depth analysis of particular problems or materials. On the one hand, as Francis Crick once wrote (38), �w molecular biologists would care to be caught studying the colour of butterflies' wings… .” The tendency in molecular biology (as it was, mutatis mutandis, in classical genetics) is for one to analyze the experimental material to the lowest possible structural level and thus invest heavily in one's system. On the other hand, the naturalist looks open mindedly for what may happen to be there and how it might be related to what has already been seen: in a way, he scouts for new experimental systems.

A comment may be made concerning induction: not lambda's, that of philosophers. It is hard to see how our intelligent species would have ever evolved without trusting induction, yet there are everyday examples of the risks of excessive reliance upon inductive predictions. Depois de B. megaterium phage, a phage in Pseudomonas, and lambda in K-12 were found to be inducible by UV light, it was hard to believe that P2 was not. How do you prove a negative? Similarly, after seeing that both lambda and P2 prophages were present in single copies, physically integrated in the bacterial chromosome at specific sites, it was very surprising when P1 was found to be present as one unattached copy and yet be regularly transmitted to the bacterial progeny without losses (50) or Mu to be capable of inserting itself anywhere in the chromosome (85, 86). Perhaps most surprising, after the early efforts had convinced everyone that lysogens produce phage through the lysis of individual cells, was the discovery that filamentous phages are indeed continuously secreted by growing cells, without lysis (49).

Postscript. My first paper on lysogeny (5), describing the modified single-burst experiment and the isolation of P1, P2, and P3, also contained the formula of the LB medium which I had concocted in order to optimize Shigella growth and plaque formation. Its use has since become very popular. The acronym has been variously interpreted, perhaps flatteringly, but incorrectly, as Luria broth, Lennox broth, or Luria-Bertani medium. For the historical record, the abbreviation LB was intended to stand for “lysogeny broth.”


PDusk and pDawn

The pDusk and pDawn plasmids are engineered DNA systems that allow someone to control gene expression using light. Both pDusk and pDawn make R e d Fluorescent Protein (RFP), wh ich makes the colonies reddish in color. The difference is that pDawn turns on the RFP gene when exposed to light, while pDusk will only make RFP when kept in the dark . The pDawn system allows you to control the expression of RFP in the light. This kit teaches you many basic molecular biology techniques, while also giving you the ability to perform cool experiments using light to control gene expression.

The pDusk and pDawn systems are activated by blue light but since most white light contains blue light any sort of ambient light should work.

  • 1 hour Make plates (set aside more time if it's your first time making plates)
  • streak out bacteria onto an LB Agar plate (takes

Day of experiment overview

    Mix bacteria t ogether with the plasmids, and transformation mix (takes

Incubate and wait for growth

1 hour, but leave more time if it&rsquos your first time)

Step by step walk-through of making plates with photos at: https://goo.gl/7yzpA1

Agar plates provide a solid media nutrient source for bacteri a to grow on. The standard media that is used is LB (Luria Broth, Lysogeny Broth, or Luria Bertani Broth). This contains a carbon source, a nitrogen source, and salt (many strains of bacteria like salt!).

The top of the plate is the larger part.

  1. Find the tube labelled &ldquoLB Agar M edia &rdquo dump its contents into the 250mL glass bottle. (You will need to make plates out of each kind of media . Rinse bottle between media. )
  1. Using the 50mL conical tube labelled &ldquo Tube for Measuring &rdquo, measure and add 150mL of water to the glass bottle.
  1. Making agar is like making jello-- heat the agar to dissolve it, then it will solidify when it cools. Heat the bottle in the microwave for 30 seconds at a time, being careful not to let the bottle boil over. DO NOT SCREW THE LID DOWN TIGHT! (just place it on top and give it a slight turn).
  1. The media is completely dissolved when the liquid looks yel low . This should take about 2 -3 minutes total of microwaving. Take the bottle out , (caution contents hot), and let it cool until you are able to touch it without much discomfort. This will take 20-30 minutes.
  1. While the bottle remains somewhat warm, pour the plates. One at a time, remove the lid of 7 plates and pour just enough of the LB agar from the bottle to cover the bottom half of the plate. Put the lid back on.

Making Competent Bacterial Cells for Transformation

&lsquoCompetent&rsquo means the bacterial cells are able to intake foreign DNA. The cells&rsquo walls normally prevent things from entering , but mixing the bacteria with chemicals and salts that change the cells&rsquo walls, allow the cells take up DNA from the environment. This process is called a &lsquotransformation&rsquo. We put all the components into synthetic DNA to trick the bacteria into thinking that our DNA is its own DNA , so they make the RFP.

The bacterial transformation mix contains:

10% Polyethylene Glycol(PEG) 8000

PEG 8000 is thought to play several different roles in transformation, though nobody really knows for certain. Since both DNA and cell walls are negatively charged, they reject each other. PEG 8000 is thought to function by shielding the charge of the DNA, thereby making it easier to permeate the cell wall. PEG 8000 is also thought to help transport the DNA into the cell, as well as make the cell membrane itself more porous.

5% Dimethyl Sulfoxide (DMSO)

DMSO is sometimes used to treat ailments in humans. In a transformation it is thought to permeabilize the cell wall. Also, sometimes DNA folds into complex structures that make it more difficult to pass through the cell wall. DMSO also might help to break these DNA structures down.

25mM Calcium Chloride(CaCl 2 )

Similarly to PEG 8000, CaCl 2 is thought to shield and neutralize the negative charge of DNA, thereby making it more likely to enter into the cell.

    Take one of the tubes of dried E. coli BL21, add water to the top and shake till it is all dissolved. Next, using your pipette put 100uL of the bacteria solution onto a new LB plate you made and using an inoculation loop gently spread or &ldquostreak&rdquo the bacteria. Let the plate grow overnight

  1. Use a syringe to transfer 0. 1 mL of Transformation mix to a microcentrifuge tube with pDawn . Make sure you mix the transformation mix with the tiny droplet of pDawn DNA in the microcentrifuge tube. Repeat with with pDusk DNA using another syringe. (Syringes can be washed with soap and water for reuse!!)
  1. Using an inoculation loop, gently scrape an area of the size of a pencil eraser of bacteria off of your fresh plate and mix it into the transformation p Dawn mix. Mix until any big clumps have disappeared. Twirling the inoculation loop can work, but avoid making bubbles. Repeat with pDusk using a clean inoculation loop.
  1. Make a warm water bath for the next step. The water should be 42ºC (108ºF) water. You can approximate this temperature by using water that is warm, but comfortable enough such that you can still keep you hand in it.
  1. Add 1.5 mL of room temperature water (or fill to the top) to one of the LB media microcentrifuge tubes and shake to dissolve the LB.
  1. Using a clean syringe , add 0.5 mL of LB media to your competent cell mixture containing your DNA.
  1. Incubate the tube at 37 º C (99 º F) for 2 hour or 4 hours at room temperature. This step allows to bacteria to recover and replicate the DNA and perform the engineering process. Take an LB/ Kan plate out of the fridge and bring them to room temperature
  1. Pour half of the LB/competent cell mix to your LB/Kan plates and gently spread the bacteria around the plate with an inoculation loop. L et dry for 10 minutes before putting the lid back on.
  1. Flip the plate upside down to prevent condensation from forming and dripping onto your bacteria.
  1. Incubate the plate at room temperature for 24-48 hours. Keep pDusk in a dark place or wrap the plate with tin foil.
  1. If your transformation was successful, you should have a plate that looks like the one below. If you kept it in the dark the pDusk plate should look a little red. If you kept it in the light the pDawn plate should look red. If not, give it another shot, Science doesn&rsquot always work on the first try. Also, feel free to contact us at [email protected] and we will help you troubleshoot.

Now that you have colonies growing, you can do a couple of tests to see how pDusk and pDawn behave differently in light and in dark conditions.


Conteúdo

The most common growth media for microorganisms are nutrient broths (liquid nutrient medium) or lysogeny broth medium. Liquid media are often mixed with agar and poured via a sterile media dispenser into Petri dishes to solidify. These agar plates provide a solid medium on which microbes may be cultured. They remain solid, as very few bacteria are able to decompose agar (the exception being some species in the genera: Cytophaga, Flavobacterium, Bacilo, Pseudomonas, e Alcaligenes) Bacteria grown in liquid cultures often form colloidal suspensions. [4] [5]

The difference between growth media used for cell culture and those used for microbiological culture is that cells derived from whole organisms and grown in culture often cannot grow without the addition of, for instance, hormones or growth factors which usually occur na Vivo. [6] In the case of animal cells, this difficulty is often addressed by the addition of blood serum or a synthetic serum replacement to the medium. In the case of microorganisms, no such limitations exist, as they are often unicellular organisms. One other major difference is that animal cells in culture are often grown on a flat surface to which they attach, and the medium is provided in a liquid form, which covers the cells. In contrast, bacteria such as Escherichia coli may be grown on solid or in liquid media.

An important distinction between growth media types is that of defined versus undefined media. [1] A defined medium will have known quantities of all ingredients. For microorganisms, they consist of providing trace elements and vitamins required by the microbe and especially defined carbon and nitrogen sources. Glucose or glycerol are often used as carbon sources, and ammonium salts or nitrates as inorganic nitrogen sources. An undefined medium has some complex ingredients, such as yeast extract or casein hydrolysate, which consist of a mixture of many chemical species in unknown proportions. Undefined media are sometimes chosen based on price and sometimes by necessity – some microorganisms have never been cultured on defined media.

A good example of a growth medium is the wort used to make beer. The wort contains all the nutrients required for yeast growth, and under anaerobic conditions, alcohol is produced. When the fermentation process is complete, the combination of medium and dormant microbes, now beer, is ready for consumption. The main types are

  • cultural media
  • minimal media
  • selective media
  • differential media
  • transport media
  • indicator media

Culture media Edit

Culture media contain all the elements that most bacteria need for growth and are not selective, so they are used for the general cultivation and maintenance of bacteria kept in laboratory culture collections.

An undefined medium (also known as a basal or complex medium) contains:

  • a carbon source such as glucose
  • agua
  • various salts
  • a source of amino acids and nitrogen (e.g. beef, yeast extract)

This is an undefined medium because the amino-acid source contains a variety of compounds the exact composition is unknown.

A defined medium (also known as chemically defined medium or synthetic medium) is a medium in which

Examples of nutrient media:

Minimal media Edit

A defined medium that has just enough ingredients to support growth is called a "minimal medium". The number of ingredients that must be added to a minimal medium varies enormously depending on which microorganism is being grown. [7] Minimal media are those that contain the minimum nutrients possible for colony growth, generally without the presence of amino acids, and are often used by microbiologists and geneticists to grow "wild-type" microorganisms. Minimal media can also be used to select for or against recombinants or exconjugants.

Minimal medium typically contains:

  • a carbon source, which may be a sugar such as glucose, or a less energy-rich source such as succinate
  • various salts, which may vary among bacteria species and growing conditions these generally provide essential elements such as magnesium, nitrogen, phosphorus, and sulfur to allow the bacteria to synthesize protein and nucleic acids
  • agua

Supplementary minimal media are minimal media that also contains a single selected agent, usually an amino acid or a sugar. This supplementation allows for the culturing of specific lines of auxotrophic recombinants.


Examples of lysogeny broth in the following topics:

Culture Media

  • The most common growth media nutrient broths (liquid nutrient medium) or LB medium (LysogenyBroth) are liquid.

Plasmids and Lysogeny

  • Both plasmids and lysogeny are used by bacteria and viruses to ensure transfer of genes and nucleic acids for viral reproduction.
  • Lysogeny is the process by which a bacteriophageintegrates its nucleic acids into a host bacterium's genome.
  • Lysogeny is utilized by viruses to ensure the maintenance of viral nucleic acids within the genome of the bacterium host.
  • Lysogeny is one of two major methods of viral reproduction utilized by viruses.
  • An example of a virus which can promote the transformation of bacterium from a nontoxic to toxic strain via lysogeny is the CTXφ virus.

Temperate Bacteriophages: Lambda and P1

  • With phage the term virulent is often used as an antonym to temperate, but more strictly a virulent phage is one that has lost its ability to display lysogeny through mutation, rather than a phage lineage with no genetic potential to ever display lysogeny (which more properly would be described as an obligately lytic phage).
  • No lysogeny, P1 can exist within a bacterial cell as a circular DNA, in that it exists by replicating as if it were a plasmid and does not cause cell death.
  • No decorrer lysogeny, new phage particles are not produced.
  • A unique feature of phage P1 is that during lysogeny its genome is not incorporated into the bacterial chromosome, as is commonly observed during lysogeny of other bacteriophage.
  • This virus is temperate and may reside within the genome of its host through lysogeny.

History of Microbiology: Hooke, van Leeuwenhoek, and Cohn

  • Lazzaro Spallanzani (1729–1799) found that boiling broth would sterilise it and kill any microorganisms in it.
  • He also found that new microorganisms could settle only in a broth se o broth was exposed to the air.
  • By boiling the broth beforehand, Pasteur ensured that no microorganisms survived within the broths at the beginning of his experiment.
  • Nothing grew in the broths in the course of Pasteur's experiment.
  • This meant that the living organisms that grew in such broths came from outside, as spores on dust, rather than spontaneously generated within the broth.

Pasteur and Spontaneous Generation

  • In summary, Pasteur boiled a meat broth in a flask that had a long neck that curved downward, like a goose.
  • The idea was that the bend in the neck prevented falling particles from reaching the broth, while still allowing the free flow of air.
  • When the flask was turned so that particles could fall down the bends, the broth quickly became clouded .
  • In detail, Pasteur exposed boiled broths to air in vessels that contained a filter to prevent all particles from passing through to the growth medium, and even in vessels with no filter at all, with air being admitted via a long tortuous tube that would not allow dust particles to pass.
  • Nothing grew in the broths unless the flasks were broken open, showing that the living organisms that grew in such broths came from outside, as spores on dust, rather than spontaneously generated within the broth.

The Lytic and Lysogenic Cycles of Bacteriophages

  • Those phages able to undergo lysogeny are known as temperate phages.
  • Even though there are similarities between lysogeny and latency, the term lysogenic cycle is usually reserved to describe bacteriophages.

Pure Culture

  • Another method of bacterial culture is liquid culture, in which the desired bacteria are suspended in liquid broth, a nutrient medium.
  • The experimenter would inoculate liquid broth with bacteria and let it grow overnight (they may use a shaker for uniform growth).

Tissue Culture of Animal Viruses

  • Viruses cannot be grown in standard microbiological broths or on agar plates, instead they have be to cultured inside suitable host cells.

Complex and Synthetic Media

  • Luria Broth as shown here is made with yeast extract, as yeast extract is not completely chemically defined Luria Broth is therefore an undefined media.By Lilly_M [GFDL (http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html) or CC-BY-SA-3.0-2.5-2.0-1.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], via Wikimedia Commons

Minimal Inhibitory Concentration (MIC)

  • MICs can be determined on plates of solid growth medium (called agar, shown in the "Kirby-Bauer Disk Susceptibility Test" atom) or broth dilution methods (in liquid growth media, shown in ) after a pure culture is isolated.
  • For example, to identify the MIC via broth dilution, identical doses of bacteria are cultured in wells of liquid media containing progressively lower concentrations of the drug.
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VWR Life Science Premixed LB Broth

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Is there a difference between Luria Broth and Lysogeny Broth? - Biologia

Rich media used for routine culture of E. coli and other bacteria at high cell densities.

1L 5L Componente
10 g 50 g Tryptone
5 g 25 g Yeast Extract
10 g 50 g NaCl

Add dH2O to final volume. Autoclave. If mixing up large batches and aliquoting, be sure to add exact volumes to final media bottles so that they will be ready for addition of antibiotic to known concentrations.

This recipe is from Miller JH. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics. CSHL Press. Handbook Unit 25.5.

Note: Be aware that (1) there are several other formulations that may be called LB but vary the amount of NaCl. Using the wrong one can cause large changes in growth. (2) LB was originally supposed to stand for "Lysogeny Broth" and you may also see it called "Luria Broth" (more about this).

Expected results: E. coli strains grow to 5×10 9 cells/ml final density in LB.

Variant: 0.1×LB is made with 1 g Tryptone, 0.5 g Yeast Extract, and 10 g NaCl per liter. (It is 0.1× in the nutrients, but não the salt!)


Is there a difference between Luria Broth and Lysogeny Broth? - Biologia

When it comes to growing bacterial colonies, LB-agar steps up to the plate &ndash but first you have to get it into a gel state (a situation to which its friend agarose can surely relate!) &ldquo-ose&rdquo is an ending that&rsquos usually used to indicate something&rsquos a sugar &ndash and agarose é a sugar &ndash but so is agar! So what&rsquos the difference? They&rsquore related, but they differ by more than just a few letters and those differences make them useful for making gel matrices for different tasks &ndash agarose gels for separating DNA fragments by size and agar gel plates for growing bacteria)

A gar is a fish-like thing and AGAR (aka agar-agar (seriously!)) is a mistura of 2 sugars &ndash agaropectin & the one we&rsquore more familiar with, agarose. So you get agarose by purifying agar. And to understand why you&rsquod go through that trouble sometimes, but not other times, it helps to know a bit more about what these sugars are.

Agarose é um polissacarideo (&ldquopoly&rdquo means many & saccharide&rsquos sugar, so a polysaccharide is a long chain of repeating sugar subunits joined together). It&rsquos an example of a polymer. Polymersare long chains of repeating subunits. Different polymers have subunits of different types (e.g. nucleotide subunits link up to give you the polymers we call DNA or RNA amino acids join to form proteins and monosaccharide sugars chain-ify to give make complex carbs (like agarose!))

Sugars have lots of hydroxyl (-OH) groups (which water happily sticks to, helping you form a gel &ndash an &ldquoinfinitely&rdquo interconnected (like 7° of Kevin bacon) polymer mesh containing water. (more to come)). Individual sugar units (monosaccharides) often adopt ring structures (as is the case in agarose) in which the -OH groups stick out like legs. Sugars can have the same &ldquolinkage&rdquo but have the linked groups sticking out in different ways & we use &ldquoL&rdquo and &ldquoD&rdquo to refer to which direction in space the legs point. More on such stereochemistry here: bit.ly/2Q8Dnax

Monosaccharides can use their -OH&rsquos to link together. Linking 2 gives you a disaccharide . Add a few more and you get oligosaccharides (oligo means few). Link lots and you get a polysaccharide (poly meaning many).

And speaking of many, the multiple -OHs mean there are multiple potential linkage sites (which we specify by which number &ldquoaddresses&rdquo on the sugar rings are joined). You can get &ldquobranching,&rdquo but in agarose, you have linear chains (of about 400 subunits). (Although branches can be introduced using &ldquocrosslinkers&rdquo to strengthen agarose so that it can do things like make size exclusion chromatography (&ldquogel filtration&rdquo) resin which can withstand the high pressures generated in FPLC (Fast performance liquid chromatography).

In agarose, the repeating subunit is a sugar duo (disaccharide) of galactose (D-galactose to be precise) linked to a modified galactose monosaccharide, 3,6-anhydro-L-galactose. We call this duo AGAROBIOSE (Linking a galactose to a glucose gives you lactose, a disaccharide you might be more familiar with).

In galactose, the rings have 6 sides with 4 -OH legs, 5 -H legs, & 1 methylhydroxyl (-CH₂OH) leg. We often don&rsquot draw the &ldquo-H&rdquo legs because they hide the more interesting legs that are capable of reacting. In agarose&rsquos modified galactose, 2 of the -OH groups have linked up & kicked out a hydrogen (&ldquoanhydro&rdquo) so that the methyl hydroxyl arm is bridged to an -OH arm forming a &ldquobridge&rdquo over the ring.

About 2/3 of agar is agarose but, agar also contains AGAROPECTIN. It&rsquos really similar (it has alternating D & L galactoses) BUT many of those galactoses have modifications. There are several different modifications including adding sulfate(s), pyruvic acid, or methyl groups, or sneaking in one of those linked-leg versions like&rsquos in agarose.

Unlike the consistent repeating nature of AGAROSE, it&rsquos only the alternating D- & L- galactose &ldquoskeleton&rdquo that&rsquos consistent in agaropectin. Its modifications are scattered throughout the chain (for instance,

every 10th is attached to a sulfate through an -O-sulfate linkage, but that&rsquos just on average, and it&rsquos not likely they&rsquore precisely, evenly, distributed). And, while the chains tend to be shorter than the agarose chains, their length is also variable, so, agaropectin&rsquos really quite a mix & you never know quite what you&rsquore gonna get!

Why use one over the other?

DNA has a lot of negatively-charged phosphate groups (phosphorus surrounded by 4 oxygens). This will serve the basis for them moving through the gel towards the positive end. So we need the gel to be neutral.

Agar has a lot of sulphate groups (sulfur surrounded by oxygens). These are also negatively-charged, so they can interfere with how the DNA moves through the gel. So it would make a bad matrix for electrophoresis.

BUT agarose is neutral, making a good matrix for electrophoresis.

BUT agarose is also more expensive because it has to be purified. So if you don&rsquot need to worry about the physical charge issue, might as well use something that has a lower *monetary* charge! Because agar requires less processing, its cheaper & perfect for use as a matrix to hold bacteria food!.

In agar plates, it&rsquos not the agar itself that&rsquos providing nutrients. That&rsquos one of the great things about agar &ndash *most* bacteria can&rsquot eat it. Instead, the agar just provides &ldquoscaffolding&rdquo to house the nutrients the bacteria need. And often those nutrients are provided through a liquid bacterial food &ldquogrowth media&rdquo called LB, which, no matter what your textbooks might say, (originally at least) stands for Lysogeny Broth. Sometimes initials for Luria, Lennox, or Luria & Bertani get credit for the name, but it really stands for LYSOGENY BROTH and its recipe was first published (by Giuseppe Bertani) in 1951. He was using it when studying lysogeny (a process where a bacteria-infecting virus called a bacteriophage (&ldquophage&rdquo) inserts its own DNA into a bacteria&rsquos DNA & bides its time until conditions are right for entering the lytic phage where it cuts itself out, makes lots of copies and bursts open the cell) http://bit.ly/2HLuB1S

The point of LB is basically to give the bacteria what they need to grow, divide, and do what we want (like make copies of DNA we put in them and/or make copies of proteins using instructions from DNA we put in them). And to do it cheaply.

Note: For the protein-making and large-scale DNA-making, we grow bacteria in straight-up LB liquid &ndash &ldquoin suspension&rdquo with shaking &ndash but when we need to isolate specific groups of bacteria that are all derived from the same &ldquoparent cell&rdquo and thus genetically-identical, we embed that LB into a gel so that different genetically-distinct &ldquocolonies&rdquo don&rsquot intermingle, but instead grow as gloopy dots. If you want to learn more about various media for the suspension stuff check out this post http://bit.ly/bacterialmedia but today I&rsquom going to focus on the gel-trapped form.

We don&rsquot give the bacteria 5-star cuisine. Instead, we want to spend as little money as possible while still giving them the nutrients they need. At a minimum, we need to give them a source of energy, something they can break down (catabolize) to make ATP &ndash such things can be sugars, proteins, fats. In addition to breaking things down, they need to be able to make things like proteins and DNA (do the anabolic part of metabolism). This requires nutrients that provide the elements needed like carbon and nitrogen, which thankfully you can get with a simple recipe that&rsquos sufficient for lots of bacteria.

There are 3 main components (though 2 of those components themselves have a lot of components.

  • TRYPTONE -> this is a mix of peptides formed by the digesting a protein called casein with pancreatic enzyme -> this provides amino acids the bacteria can use to make new proteins
  • YEAST EXTRACT -> this &ldquoautolysate&rdquo of yeast is basically just whatever happened to be in yeast (organic compounds including vitamins, trace elements, etc.) &ndash and if it was good enough for the yeast&hellip
  • SODIUM CHLORIDE (NaCl)(table salt) -> allows for osmotic balance, transport, etc.

A few of the major LB formulations are the &ldquoMiller,&rdquo &ldquoLennox,&rdquo & &ldquoLuria&rdquo versions & they differ in the amount of salt they have. Miller & Bertani drown the bacteria in NaCl (10g/L) whereas Lennox just uses 5g/L and Luria just 0.5g/L -> such low salt recipes are good if you&rsquore using a salt-sensitive antibiotic. in the original paper, Bertani also added glucose, but most later recipes leave it out.

And speaking of leaving things out, we need to make sure we &ldquoleave out&rdquo bacteria we don&rsquot want, which we can do by &ldquoselecting for&rdquo the bacteria we Faz want using selection media, which contain things like antibiotics etc. that suppress the growth of things you don&rsquot want to grow. For example, when we put genes into bacteria, we normally do it in the form of circular pieces of DNA called plasmids. We design those plasmids to also have an antibiotic resistance gene, so we can spike the food with that antibiotic and it can still grow, but other stuff can&rsquot http://bit.ly/2tcW4ky

There&rsquos also differential media &ndash this allows for &ldquoscreening&rdquo as opposed to &ldquoselection&rdquo &ndash you don&rsquot keep things from growing, but you change how they appear &ndash for example, we use X-gal for blue-white screening http://bit.ly/2MxNPs2

After I put a plasmid with my gene into bacteria and get colonies, I pick a few of those colonies and put them in liquid LB (with antibiotic) to grow overnight to make lots of copies of the plasmid, then I can purify out those copies and send them for sequencing to check for typos before l enter the &ldquoexpression prep&rdquo part.

Regardless of what media you use, you need it to be sterile. So you autoclave it (stick it in a really hot, high pressure dishwasher) -> make sure the bottles aren&rsquot sealed tight or they&rsquoll explode (thankfully I haven&rsquot made this mistake) &ndash and don&rsquot re-tighten the lids until the bottles have cooled of or the lids will get stuck (I *have* made this one). Another mistake not to make -> don&rsquot add antibiotics before autoclaving, or you&rsquoll inactivate them. We usually don&rsquot add it until right before we&rsquore ready to use it.

In undergrad, I made all my own media, but here, we use so much of it, we have a &ldquomedia-maker&rdquo lab technician who&rsquos amazing and makes & sterilizes our bacterial growth media. You know something&rsquos been through an autoclave if the lines on its autoclave tape are black &ndash the tape is temperature-sensitive so it color-changes when it gets really hot. I really want to design a line of joke and/or trivia messaged autoclave tape &ndash so if the whole teaching thing doesn&rsquot work out, I guess I have a back up!