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Uma célula pode perder completamente a capacidade de sofrer apoptose?

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O que quero dizer é - pode uma célula super-cancerosa perder completamente a capacidade de se matar, perdendo todos os mecanismos relacionados à apoptose e tornando-se eternamente resistente a qualquer droga que tente induzir a apoptose direta ou indiretamente.


Apoptose vs. Necrose

Enquanto que apoptose é uma forma de morte celular que geralmente é desencadeada por processos normais e saudáveis ​​no corpo, necrose é a morte celular desencadeada por fatores externos ou doenças, como trauma ou infecção. A apoptose, que também pode ocorrer como mecanismo de defesa durante os processos de cura, é quase sempre normal e benéfica para o organismo, enquanto a necrose é sempre anormal e prejudicial. Embora a necrose esteja sendo pesquisada como uma possível forma de morte celular programada (isto é, um processo às vezes natural), ela é considerada um processo de morte celular "não programado" (não natural) atualmente. Como uma forma geralmente saudável do ciclo de vida de uma célula, a apoptose raramente exige qualquer forma de tratamento médico, mas a necrose não tratada pode causar lesões graves ou até a morte.


Canais iônicos e apoptose no câncer

Os humanos mantêm um número constante de células ao longo de sua vida. Este equilíbrio do número de células é alcançado quando a proliferação celular e a morte celular são mantidas em equilíbrio, atingindo um número de células em estado estacionário. Anormalidades no crescimento celular ou morte celular podem levar a uma superabundância de células conhecidas como neoplasias ou tumores. Embora a percepção do câncer seja frequentemente de uma taxa incontrolável de crescimento celular ou aumento da proliferação, uma diminuição na morte celular também pode levar à formação de tumor. A maioria das células, quando separadas de seu tecido normal, morre. No entanto, as células cancerosas escapam da morte celular, pondo a balança na balança para uma superabundância do número de células. Portanto, a superação dessa resistência à morte celular é um fator decisivo no tratamento do câncer. Os canais iônicos desempenham um papel crítico no câncer no que diz respeito à proliferação celular, angiogênese maligna, migração e metástase. Além disso, os canais iônicos também são conhecidos por serem componentes críticos da apoptose. Nesta revisão, discutimos os modos de morte celular com foco na capacidade das células cancerosas de escapar da apoptose. Especificamente, nos concentramos no papel que os canais iônicos desempenham no controle e regulação das decisões de vida / morte e como eles podem ser usados ​​para superar a resistência à apoptose no tratamento do câncer.

1. Introdução

O câncer não é apenas uma doença única, mas pode ser classificado em várias categorias com base no local de origem das células cancerosas, como carcinoma (pele ou tecidos que revestem os órgãos internos), sarcoma (osso, cartilagem, tecidos conjuntivos ou de suporte), leucemia (tecido formador de sangue) e linfoma ou mieloma (sistema imunológico). O câncer é geralmente considerado uma replicação incontrolável de células anormais que são capazes de invadir tecidos circundantes ou distantes. Dentro de um tecido, a proximidade das células umas com as outras permite a sinalização parácrina e endócrina essencial que é necessária para a sobrevivência. As células que se liberam ou se desprendem de um local ou tecido primário perdem essa sinalização de rede vital e normalmente sofrem apoptose, enquanto as células malignas podem lidar com seu novo ambiente e sobreviver.

2. Apoptose versus necrose

As células mortas encontradas acima do volume normal de células são tradicionalmente consideradas necróticas, sinalizando uma anormalidade ou desvio na homeostase do tecido normal. Historicamente, necrose tem sido um termo usado para descrever um modo acidental de morte celular resultante de danos químicos, insultos tóxicos contundentes ou lesões físicas. Este processo passivo de morte celular é caracterizado principalmente por sua distinta morfologia celular inchada que resulta de uma perda precoce de energia [1,2]. Essa morte celular catastrófica resultante da depleção de ATP carece da decomposição organizada do conteúdo celular observada em outros modos mais programados de morte celular. Além do inchaço celular, as células necróticas degradam aleatoriamente seu DNA, RNA e proteínas, têm um influxo maciço de cálcio, perdem a integridade da membrana, desencadeando uma resposta inflamatória na área ao redor da célula que está morrendo.

No início dos anos 1970, as observações morfológicas iniciais de Kerr et al. [3], a descrição da capacidade de uma célula de implodir e desintegrar levou ao conceito de um processo ativo de morte celular inerentemente controlado, agora conhecido como apoptose. Este modo fisiológico e, mais importante, não inflamatório de morte celular, também foi observado em tecidos de animais saudáveis ​​[4-6], em neoplasias malignas não tratadas [7] e em atrofia de órgãos após adição ou retirada de hormônios [ 5,8]. Assim, um modo de morte celular foi descrito em que a divisão celular equilibrada fornece um mecanismo para o corpo manter a homeostase celular adulta.

A apoptose é conhecida por ser uma morte celular organizada e demonstrou desempenhar um papel importante na embriogênese, no desenvolvimento de tecidos e órgãos e em diversos estados patológicos, por exemplo, câncer. A apoptose é caracterizada por um conjunto único de características morfológicas e bioquímicas que a diferenciam de outros modos de morte. Essas características incluem o encolhimento celular, a condensação nuclear, a clivagem do DNA na região de ligação dos nucleossomos adjacentes e a formação de bolhas na membrana [9]. Observou-se a ocorrência de outras características bioquímicas que definiam a apoptose, como externalização da membrana fosfotidilserina, liberação de citocromo c da mitocôndria e ativação de uma família específica de proteases conhecidas como caspases [2,9,10]. As células apoptóticas são eliminadas do corpo de maneira oportuna e ordenada, por meio de fagocitose, que resulta na ausência de uma resposta inflamatória. Embora nem todas as características que classificam a apoptose sejam observadas em todas as condições, a ideia de um processo de morte celular programado e codificado internamente permanece constante.

As células cancerosas evitam a apoptose ao se desprender das células vizinhas, espalhando-se para outras partes do corpo através dos sistemas linfático ou vascular, resultando no desenvolvimento de metástases. O termo anoikis tem sido usado para descrever a apoptose que ocorre a partir do desprendimento de células dependentes de ancoragem e desempenha um papel importante na tumorigênese, perturbando o equilíbrio entre a proliferação celular e a morte celular. Considerando as inúmeras maneiras pelas quais uma célula pode morrer, superar a resistência à apoptose ou a ativação do programa apoptótico seria o meio mais benéfico para a remoção de células malignas do corpo.

3. Outros modos de morte celular

Enquanto características distintas delineiam claramente apoptose de necrose (tabela 1), evidências crescentes sugerem que esses dois modos de morte celular representam os extremos de uma ampla gama de mortes programáveis, com numerosas variações de células mortas entre elas (figura 1). Estudos recentes sugeriram um tipo programável de necrose que está longe de ser aleatório em seu modo de ação [11–13]. Essa variação da necrose, denominada necrose programada, morte celular independente da caspase ou necroptose, ocorre por receptor de morte ou infecção viral, na ausência de ativação da caspase [14]. As células necroptóticas exibem várias características de necrose, incluindo edema celular, disfunção de organela e lise celular, mas esses eventos parecem ocorrer de uma maneira mais ordenada. Da mesma forma, um modo passivo de morte celular conhecido como oncose ou "morte celular isquêmica" é desencadeado por danos químicos, térmicos ou de radiação que vão além do ponto de reparo celular [15]. A oncose é definida pelo inchaço da mitocôndria, núcleo e citoplasma, junto com vacuolização citoplasmática, e acredita-se que envolva a falha das bombas iônicas na membrana plasmática antes da perda da integridade da membrana (figura 1). A piroptose, uma forma programada de morte celular, está associada a respostas antimicrobianas durante a inflamação e requer ativação específica da caspase [16]. Observados apenas em macrófagos e células dendríticas comprometidas com patógenos microbianos, os receptores semelhantes a NOD nessas células reconhecem padrões moleculares associados a patógenos intracitoplasmáticos para promover a montagem no piroptossoma, também conhecido como inflamassoma, um complexo multiproteico que recruta e ativa a caspase -1 (figura 1 e tabela 1). Finalmente, a autofagia é um processo catabólico conservado evolutivamente que desempenha um papel não apenas na morte de uma célula, mas também na sobrevivência celular [17,18]. Como um mecanismo de sobrevivência celular, a autofagia tenta manter a homeostase intracelular durante os períodos de inanição, reciclando os componentes celulares (figura 1 e tabela 1). No entanto, em vários estados de doença, incluindo Alzheimer e Parkinson, células autofágicas são frequentemente observadas [19,20], sugerindo que a autofagia também pode ser considerada como um programa de suicídio. Claramente, existem muitas maneiras de uma célula morrer, portanto, ativar ou reprimir a apoptose em células cancerosas seria benéfico para o tratamento do câncer devido à integridade da membrana conservada, formação de corpo apoptótico e falta de uma resposta inflamatória (tabela 1).

Tabela 1. Comparação dos processos de morte celular quanto à presença ou ausência de características definidoras.

Figura 1. Modos de morte celular. A apoptose e a necrose compreendem extremos opostos de um continuum de modos programáveis ​​e não programáveis ​​de morte celular. Autofagia, piroptose e oncose (morte celular isquêmica) representam uma variedade de morte celular que retém algumas características de apoptose ou necrose, mas definem um modo único de morte celular. (Versão online em cores.)

4. Ativação e repressão da apoptose

Em geral, duas vias celulares levam à ativação da apoptose. A primeira é uma via mediada por receptor conhecida como via extrínseca, onde os receptores de morte da superfície celular sinalizam a maquinaria apoptótica para promover a ativação de proteases específicas, conhecidas como caspases, o que leva à degradação celular e eventual formação apoptótica do corpo [21]. Os receptores de morte predominantes são da família de proteínas do TNF e incluem o receptor 1 do TNF (TNF-R1, p55, CD120a), Fas (CD95, APO-1) e receptores de ligantes indutores de apoptose relacionados ao TNF (TRAIL-R1, DR4 TRAIL-R2, DR5, APO-2). O núcleo desta via de sinalização envolve a formação do complexo de sinalização indutor de morte (DISC) que compreende um receptor de morte, a proteína adaptadora FADD e uma caspase iniciadora [22]. A ativação dessas caspases iniciadoras no nível do DISC leva à ativação adicional de caspases a jusante ou efetoras subsequentes à apoptose.

A segunda via de ativação apoptótica é conhecida como a via intrínseca que envolve a liberação de fatores apoptogênicos, como o citocromo c, fator indutor de apoptose e segundo ativador derivado da mitocôndria da caspase da mitocôndria [23]. Os sinais de morte convergem no nível da mitocôndria para liberar esses fatores durante o início da apoptose. O núcleo desta via de sinalização envolve a formação do apoptossoma compreendendo procaspase-9, a proteína adaptadora Apaf-1 e citocromo c [24,25]. No entanto, as vias extrínsecas e intrínsecas da apoptose não são mutuamente exclusivas, pois a caspase 8 ativada pela via extrínseca pode clivar a proteína pró-apoptótica BID para induzir a ativação de componentes da via apoptótica intrínseca [26,27].

Vários mecanismos celulares e proteínas foram identificados que funcionam em vários níveis do processo de morte celular para prevenir ou inibir a apoptose [28]. A atividade da caspase pode ser inibida pela expressão das proteínas virais Cp-IAP e Op-IAP que definem uma família de inibidores de proteínas de apoptose (IAPs) [29-31]. Pensa-se que os IAPs funcionam ligando diretamente as caspases durante a apoptose, onde membros da família IAP específicos interagem com caspases específicas para prevenir a apoptose. Além disso, os membros anti-apoptóticos da família de proteínas Bcl-2 (Bcl-Xeu, Bcl-w e Mcl-1) residem na membrana mitocondrial externa e inibem a apoptose, evitando a ativação de uma subfamília de proteínas pró-apoptóticas apenas de BH3, como Bax e Bak [32]. Através da interação das proteínas antiapoptóticas com Bax e Bak, fatores pró-apoptóticos são mantidos em xeque e não liberados da mitocôndria [33]. Além disso, a regulação negativa da expressão desses fatores pró-apoptóticos também pode contribuir para a resistência apoptótica. Finalmente, a manutenção de uma alta força iônica intracelular é conhecida por prevenir a apoptose, inibindo a liberação de citocromo c e a formação do apoptossomo [34,35].

5. Íons e apoptose

Independentemente da rota específica que as células podem empregar para sofrer apoptose, em geral ambas as vias extrínseca e intrínseca levam a eventos análogos, incluindo encolhimento celular, fragmentação internucleossômica de DNA e formação de corpo apoptótico. Uma marca registrada da apoptose é a perda de volume celular ou encolhimento celular [36–38], denominado diminuição do volume apoptótico (AVD) [39]. Foi demonstrado que a perda de volume celular ou AVD durante a apoptose resulta de alterações nos íons intracelulares, com a perda de potássio intracelular desempenhando um papel crítico na ativação a jusante da maquinaria apoptótica [34,35,40,41]. A diminuição no volume celular é o resultado de uma diminuição na força iônica intracelular geral que permite a ativação da caspase, formação de apoptossoma e atividade de nuclease apoptótica.

Embora uma perda de potássio intracelular tenha sido bem documentada em muitos sistemas modelo apoptóticos, o mecanismo exato pelo qual essa depleção de potássio ocorre não está totalmente resolvido. Numerosos canais de potássio, incluindo voltagem controlada, retificador retardado e canais de potássio retificador interno, foram descritos como desempenhando um papel durante a ativação da apoptose [37,38,42] e inibição direta dos canais de potássio usando tetretilamônio, tetrapentilamônio ou quinina, pode proteger as células da morte celular [43-45]. Esses dados sugerem que canais de potássio distintos estão envolvidos na apoptose, dependendo do tipo de célula ou estímulo de morte celular.

O sódio e o cloreto também participam da apoptose. Especificamente, um aumento no sódio intracelular foi relatado no início do processo de morte celular [46-49]. A inibição desse aumento de sódio intracelular evita a apoptose. Em estudos onde o sódio foi removido do ambiente extracelular, foi demonstrado que a apoptose ocorre na ausência de encolhimento celular [48,49], sugerindo que o fluxo de sódio durante a apoptose desempenha um papel importante no controle do tamanho da célula. O fluxo de cloreto também foi relatado durante a apoptose [50-52]. A modulação do fluxo de cloreto demonstrou prejudicar a via intrínseca da indução apoptótica, embora não tenha efeito na via extrínseca [51]. Recentemente, um canal de cloreto de retificação externa sensível ao volume (VSOR) também foi proposto como uma condutância aniônica primária durante a apoptose [53].

Claramente, os canais iônicos e transportadores desempenham um papel central no controle do volume celular para prevenir a morte celular. O volume celular e sua regulação também desempenham um papel crítico em uma série de funções moleculares e celulares, incluindo proliferação, migração, liberação de hormônio e expressão gênica [54,55]. Esses achados sugerem que as células desenvolveram mecanismos protetores essenciais para manter o equilíbrio dos íons intracelulares e extracelulares controlados em resposta às mudanças em seu ambiente extracelular, que são coletivamente conhecidas como respostas regulatórias de volume [54,56]. Em relação à apoptose, a ausência de regulação do volume em linfócitos humanos contribui para a ativação rápida e independente do estímulo da apoptose [57]. Além disso, a desregulação dos mecanismos reguladores do volume celular inerente pode contribuir para AVD [39], e a inibição dos canais de cátions induzidos pela hipertonia pode sensibilizar as células HeLa a sofrer apoptose [58]. Assim, a capacidade de uma célula de controlar seu volume celular e sua homeostase iônica desempenha um papel crítico na ativação e repressão da apoptose.

6. Superando a resistência à apoptose em células cancerosas

A resistência à apoptose pode vir em várias formas, e cada tipo individual de câncer pode usar um mecanismo diferente para obter essa insensibilidade à morte celular. Assim, a capacidade de superar a resistência à apoptose em células tumorais é o objetivo da maioria das terapias contra o câncer. Uma questão importante é como superar esses bloqueios moleculares que as células resistentes usam para escapar desse processo inerente de morte celular.

A inibição de ambas as vias apoptóticas extrínsecas e intrínsecas é conhecida por ocorrer em células cancerosas de metástase tumoral [59], e superar essa resistência tem sido um foco da terapia tumoral [60]. Por exemplo, estudos demonstraram que Apo2L / TRAIL humano recombinante pode induzir apoptose em vários tipos de células cancerígenas, poupando a maioria das células normais [61,62]. Embora não seja eficaz em todos os tipos de câncer, essa estratégia contorna a mutação comum no gene supressor de tumor p53, pois a sinalização do receptor de morte funciona independentemente do p53 [63]. Além disso, a via intrínseca também tem sido um alvo na terapia anticâncer, onde os membros da família Bcl-2 foram estudados quanto à modulação biológica para superar a resistência à apoptose [64,65]. Essas modulações incluíram o uso de oligonucleotídeos antisense Bcl-2 [66], miméticos de BH3 [67], inibidores de moléculas pequenas de proteínas Bcl-2 anti-apoptóticas [68]. No entanto, a maquinaria apoptótica específica de direcionamento, como receptores de morte, membros Bcl-2 anti-apoptóticos ou mesmo caspases, seriam apenas benéficas para células cancerosas que empregam esses componentes específicos. Assim, uma abordagem para superar a resistência à apoptose em células cancerosas seria ter como alvo um evento de morte celular comum envolvido com a via extrínseca e intrínseca. Como os canais iônicos desempenham um papel importante em ambas as vias apoptóticas, direcionar os canais iônicos para superar a resistência à apoptose deve ser uma grande promessa no tratamento de células cancerosas, independentemente de uma via de morte celular específica.

7. Canais de potássio como alvos para morte celular por apoptose em células cancerosas

Claramente, os canais iônicos desempenham um papel fundamental em muitas características do câncer [69], incluindo em todos os seis fenótipos fisiopatológicos do crescimento maligno [70]. Por exemplo, os canais de potássio são conhecidos por desempenhar um papel crítico na proliferação celular [71,72]. Os primeiros estudos de infecção viral e células transformadas por H-ras resultando em alterações oncogênicas foram relatados como tendo aumentado a atividade do canal de potássio [73,74], e a migração celular depende da atividade do canal de potássio [75,76]. A análise extensiva de microarranjos de tecido de câncer de mama, a subunidade-a da voltagem de grande condutância e canal de potássio ativado por cálcio (KCNMA1) mostrou expressão aumentada que pode contribuir para uma alta taxa de proliferação e malignidade [77]. Surpreendentemente, apenas recentemente os canais iônicos foram explorados como alvos para sensibilizar células cancerosas resistentes à apoptose devido ao seu papel único na ativação do programa de morte celular [78-81].Uma dificuldade em direcionar canais iônicos individuais na terapia do câncer é determinar quais canais estão envolvidos para um tipo específico de célula e via apoptótica. Diversas revisões excelentes sobre canais iônicos e câncer, incluindo aquelas nesta monografia, enfocaram seu papel em diferentes estágios da progressão do tumor, incluindo crescimento e proliferação celular, motilidade e invasão e / ou seu papel em diferentes tipos de tumores [82-84 ] Aqui, nos concentramos nos canais iônicos na superação da resistência à apoptose no câncer.

Os canais de potássio são a maior, mais diversa e bem estudada família de canais iônicos e têm sido um foco importante para a terapia do câncer devido ao seu papel na proliferação celular, diferenciação, regulação do volume celular e manutenção do potencial de membrana. Existe um conjunto exaustivo de canais de potássio, e a expressão desses canais difere não apenas pelo tipo de célula, mas também de células normais a metastáticas do mesmo tipo de célula [85]. Vários canais de potássio dependentes de voltagem, incluindo Kv1.1, Kv1.3, Kv1.5, Kv2.1 e Kv11.1, são conhecidos por desempenhar um papel crítico durante a apoptose [86], com Kv1.3 e Kv1.5 recebendo a maior atenção devido ao seu conhecido envolvimento na progressão do ciclo celular e na sinalização do cálcio [87,88]. Além dos canais iônicos dependentes de voltagem, outros membros da família de canais de potássio têm o potencial de desempenhar um papel na apoptose. A Tabela 2 fornece uma lista de canais de potássio que são conhecidos por desempenhar um papel durante a apoptose em células cancerosas.

Tabela 2. Canais de potássio: seu papel na apoptose e câncer.

Uma compreensão abrangente dos canais de potássio no contexto de uma variedade de vias apoptóticas é de primordial importância para restaurar a sensibilidade à morte celular em células tumorais. Por exemplo, um relatório recente usando células de glioblastoma humano mostrou que a apoptose induzida por estaurosporina (via intrínseca) ocorreu através de canais de potássio ativados por cálcio de condutância intermediária (IK), enquanto a morte celular induzida por TRAIL (via extrínseca) usou cálcio de grande condutância canais de potássio ativados (BK) [104]. Portanto, o clotrimazol e o TRAM-34 (bloqueadores IK) foram eficazes na prevenção da apoptose induzida pela estaurosporina, enquanto a paxilina (bloqueador de BK) foi completamente ineficaz. O desenvolvimento de tratamentos terapêuticos adequados para prevenir o crescimento do câncer requer uma compreensão profunda da complexidade do canal iônico para um determinado tipo de célula, bem como os mecanismos de sinalização fornecidos pelo agente quimioterápico empregado.

Como indicado anteriormente, um efluxo de potássio intracelular, o cátion intracelular dominante, ocorre durante a apoptose, resultando na perda de volume celular (AVD) e ativação da maquinaria apoptótica. Por exemplo, uma célula cancerosa pode escapar da apoptose simplesmente regulando para baixo esses canais de potássio. Curiosamente, Kv1.3 e Kv1.5 são expressos em níveis reduzidos em muitos tipos de cânceres humanos [105], sugerindo que esses canais iônicos podem contribuir para a resistência apoptótica. Assim, a superexpressão direcionada de canais de potássio dependentes de voltagem pode resultar em uma resposta pró-apoptótica, fornecendo um mecanismo para diminuir a força iônica intracelular geral que é importante para superar a resistência apoptótica.

Além disso, a expressão de proteínas que modulam os canais iônicos também pode ser benéfica na restauração da sensibilidade apoptótica. Por exemplo, a proteína moduladora do canal de potássio KChAP quando superexpressa em uma linha celular de câncer de próstata, células LNCaP, resultou no aumento da expressão do canal de potássio, uma diminuição no tamanho médio da célula que aumentou AVD e promoveu a apoptose espontânea [106]. A superexpressão repetitiva de KChAP em xenoenxertos LNCaP ou DU-2145 suprimiu significativamente o crescimento do tumor devido ao aumento da apoptose. Enquanto a superexpressão de KChAP em células LNCaP também resultou em uma parada do ciclo celular G0 / G1 através da ativação de p53, as células DU-2145 expressam um p53 mutado e não funcional, descartando assim o p53 como a razão para a morte celular. Como ambas as linhagens celulares apresentaram apoptose aumentada, a ação da proteína moduladora KChAP foi determinada como resultado da interação direta com o canal de potássio.

Embora a intervenção direta no nível dos canais iônicos possa ser benéfica, as consequências indiretas da inibição do canal também podem sensibilizar as células tumorais à apoptose. A inibição indireta de canais de potássio ativados por Ca 2+ de grande condutância (canais BK) em células cancerosas HeLa e A2780 induziu apoptose de células tumorais [107]. Embora contra-intuitivo para o efluxo de potássio intracelular, o mecanismo de ativação apoptótica via inibição do canal de potássio nessas células ocorreu via aumento da expressão de p53, p21 e Bax. Assim, a intervenção no nível dos canais iônicos também pode ter efeitos benéficos indiretos que resultam na ativação da apoptose.

Os canais iônicos localizados nas membranas intracelulares também podem ter um papel funcional durante a apoptose. Kv1.3 é expresso na mitocôndria de linfócitos [108], onde sua localização na membrana mitocondrial interna permite uma interação direta com Bax, uma proteína pró-apoptótica [109]. A inibição de mtKv1.3 através da ligação de Bax resulta na hiperpolarização do potencial de membrana mitocondrial, a liberação de citocromo c e a produção de espécies reativas de oxigênio que levam à apoptose. A presença de mtKv1.3 também foi relatada nas linhas de células de câncer de próstata e de mama, PC3 e MCF-7, respectivamente [110]. Curiosamente, a inibição farmacológica de mtKv1.3 com drogas permeantes de membrana induziu apoptose em uma variedade de linhas de células cancerosas de uma maneira independente de Bax / Bak e reduziu o tamanho do tumor em 90% em um modelo de camundongo com melanoma ototópico [101], sugerindo que o direcionamento deste canal iônico específico em células tumorais seria vantajoso sob condições de proteínas pró-apoptóticas não funcionais ou inativas. Além disso, foi relatado que Kv1.1 e Kv1.5 também interagem com Bax porque os linfócitos deficientes em Kv transfectados com esses canais iônicos restauram a sensibilidade à morte celular em células CTLL-2 resistentes à apoptose [111]. Os macrófagos J774 também expressam Kv1.3 e Kv1.5 em suas mitocôndrias e a regulação negativa de siRNA ou a inibição farmacológica desses canais induz a apoptose [111]. Esses dados fornecem uma via para a depleção de macrófagos associados a tumores conhecidos por promover o crescimento do tumor.

8. Canais de sódio como alvos para morte celular por apoptose em células cancerosas

Enquanto a maioria do foco tem sido nos canais de potássio no desenvolvimento metastático, a contribuição de outros canais iônicos, incluindo canais de sódio e cloreto, não foram completamente esquecidos [81,83,84]. Acredita-se que os canais de sódio dependentes de voltagem também desempenham um papel na proliferação, migração e adesão das células tumorais e são expressos em vários carcinomas agressivos [84]. Um aumento no sódio intracelular foi observado durante o estágio inicial da apoptose que está acoplado a uma diminuição inicial no potássio intracelular [47]. Embora as células Jurkat cultivadas em meio sem sódio inchem em vez de encolher quando estimuladas a sofrer morte celular, elas ainda retêm outras características clássicas de apoptose [48]. A reintrodução de sódio resultou na morfologia apoptótica encolhida. Além disso, o bloqueador do canal de sódio controlado por voltagem saxitoxina demonstrou prevenir a apoptose induzida pelo ligante Fas em células Jurkat [48]. Mais estudos sobre o papel do sódio durante a apoptose são essenciais, mas as evidências atuais sugerem que os canais de sódio podem ser alvos promissores na terapia do câncer no que diz respeito à sensibilização de células tumorais à morte.

9. Canais de cloreto como alvos para morte celular por apoptose em células cancerosas

Canais de cloreto são conhecidos por terem um papel importante em uma ampla variedade de funções celulares, incluindo proliferação celular, potencial de membrana, secreções de fluidos e regulação do volume celular [112]. Além disso, os canais de cloreto são conhecidos por desempenhar um papel significativo durante a apoptose [50-52], no entanto, eles têm recebido consideravelmente menos atenção do que sua contraparte de potássio. A atividade do canal de cloreto foi observada em uma grande variedade de tipos de células em apoptose, seja por via extrínseca ou intrínseca [113]. Semelhante a outros canais iônicos, a inibição dos canais de cloreto para prevenir a apoptose tem sido o tipo de célula e / ou estímulo específico [51]. Os primeiros estudos relataram a importância dos canais de cloreto durante a apoptose, onde a via do receptor de morte ativou um canal de cloreto dependente da tirosina quinase, cuja inibição resultou na diminuição da morte celular [114]. Curiosamente, o efluxo de cloreto prejudicado induzido por uma variedade de estímulos de morte celular demonstrou prevenir a fragmentação do DNA internucleossomático, mas não outras características clássicas da morte celular programada [115]. Foi relatado que canais de cloreto ativados por cálcio (CaCCs) são pró-apoptóticos e suprimem a formação de tumor nas células epiteliais [116]. No entanto, outros membros da família dos CaCCs juntamente com o CaCC ativado pelo receptor 8-transmembrana recentemente caracterizado (TMEM16A) podem promover a proliferação celular e a tumorigênese [117,118]. Esses estudos sugerem um papel variável do cloreto e / ou corrente aniônica durante a apoptose e progressão do câncer.

Recentemente, os canais de cloreto VSOR, conhecidos por serem ativados após o inchaço das células, estão ativos durante a AVD [119]. A inibição desses canais foi relatada para prevenir AVD e eventos apoptóticos subsequentes [52]. Os canais de cloreto, como é o caso dos canais de potássio, também podem ser expressos nas membranas intracelulares [112]. Uma diminuição na expressão desses canais de cloreto usando construções antisense resultou em apoptose após tratamento com TNF-alfa [120]. Uma variedade de correntes aniônicas são conhecidas por estarem presentes em muitos cânceres, e a atividade do canal de cloreto ocorre durante a morte celular. No entanto, direcionar os canais de cloreto em células tumorais para restaurar a sensibilidade à apoptose é limitado devido à identidade molecular desconhecida de muitas dessas proteínas. A dificuldade em determinar a identidade dos canais de cloreto provavelmente está relacionada aos dados recentes que sugerem que muitas dessas proteínas são anti-porters e não apenas canais [112].

10. Conclusão

Em retrospecto, fica claro que as células gastam muito tempo e energia mantendo seu ambiente iônico. Todas as células têm a capacidade de morrer, no entanto, a resistência à morte celular, especificamente a apoptose, não é monogênica. O ambiente físico intracelular das células normais não conduz à apoptose. Assim, uma mudança nos íons intracelulares é necessária para a plena ativação e atividade da apoptose. Esta mudança no íon intracelular pode permitir a despolarização da membrana plasmática, alterando assim as vias de transdução de sinal. Além disso, uma mudança no ambiente iônico celular pode alterar as interações proteína-proteína. Embora os íons intracelulares possam controlar o volume da célula, não é uma mudança no tamanho da célula que regula a apoptose, mas uma mudança no ambiente iônico intracelular que detém a chave para saber se uma célula vive ou morre.

Declaração de financiamento

Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, National Institute of Environmental Health Sciences.


A Família BCL-2

A família BCL-2 é composta de reguladores críticos da via apoptótica que residem a montante do compromisso irreversível com a morte celular. Muitos membros da família BCL-2 residem principalmente nas membranas subcelulares, incluindo a membrana externa da mitocôndria, o retículo endoplasmático e a membrana nuclear. A família consiste em agonistas e antagonistas de morte que compartilham homologia de sequência dentro αsegmentos helicoidais denotados como domínios de homologia BCL-2 (BH) numerados BH1-4. Membros da família antiapoptótica (como BCL-2, BCL-Xeu, A1 e MCL-1) são altamente conservados, possuindo quatro domínios BH. Estruturalmente, os domínios BH1–3 formam uma bolsa hidrofóbica capaz de se ligar aos domínios BH3 de outros membros da família. Os membros pró-apoptóticos podem ser subdivididos de acordo com o número de domínios BH que possuem. Os membros pró-apoptóticos de vários domínios (BAX, BAK e BOK) possuem os domínios BH1–3 e também formam uma bolsa hidrofóbica. Em contraste, o subconjunto 'apenas BH3' de pró-apoptóticos (BID, BAD, BIM, BIK, BMF, NOXA e PUMA) possui apenas o domínio BH3 mínimo. As proteínas apenas BH3 são candidatas atraentes no controle da apoptose, uma vez que são reguladas dinamicamente por vários mecanismos, incluindo controle transcricional e controle pós-tradução (revisado por Willis et al. 16 ).

As moléculas pró-apoptóticas de múltiplos domínios BAX e BAK constituem uma porta de entrada necessária para a via mitocondrial da apoptose em que as células duplamente deficientes para ambas as proteínas são dramaticamente resistentes a uma ampla gama de sinais de morte. 17, 18 Após o recebimento de sinais de morte, BAX e BAK são ativados e oligomerizam na mitocôndria, resultando na permeabilização da membrana externa e liberação de citocromo c (Figura 2). 19 Moléculas apenas de BH3 requerem BAX e BAK para mediar a morte e operar a montante da mitocôndria conectando os sinais proximais de morte e sobrevivência à via intrínseca central. Os membros da família antiapoptótica funcionam sequestrando moléculas apenas de BH3 em complexos estáveis, evitando a ativação de BAX e / ou BAK ou antagonizando diretamente BAX e BAK. 20, 21, 22


Conclusão

Um dos maiores desafios da medicina moderna é a compreensão da DCP no contexto do câncer e das doenças autoimunes, cardiovasculares e neurodegenerativas. O acúmulo de evidências aponta para a conservação filogenética da maquinaria central e dos reguladores centrais da morte celular entre leveduras e mamíferos. Isso abriu a possibilidade de usar a levedura como uma ferramenta de pesquisa que pode fornecer novas pistas na elucidação das vias de morte celular em eucariotos superiores. De fato, o modelo apoptótico de levedura já demonstrou seu potencial para aplicação no sistema humano, exemplificado pelo crescente número de estudos utilizando levedura como modelo de neurotoxicidade e câncer. 47, 88 É importante ressaltar que várias contrapartes de mamíferos dos fatores de morte de células de levedura desempenham papéis importantes na patogênese da doença. Entre elas estão as caspases, envolvidas em diversos estados fisiológicos e patológicos AIF, cuja ausência pode causar neurodegeneração, atrofia do músculo esquelético e cardiomiopatia dilatada ou endonuclease-G, cuja translocação nuclear tem sido associada a isquemia cerebral e atrofia muscular. A levedura também serve como modelo para o envelhecimento das células pós-mitóticas (envelhecimento cronológico), bem como das células-tronco (envelhecimento replicativo), e lançou luz sobre a possibilidade de combater patógenos fúngicos ou protozoários unicelulares pela indução farmacológica de PCD. Digno de nota, a levedura representa um eucarioto com mitocôndrias facilmente manipuláveis, que estão emergindo como organelas centrais na regulação da apoptose.


Após a indução do dano ao DNA, uma via proeminente de inativação celular é a apoptose. Durante os últimos dez anos, foram identificadas lesões específicas de DNA que desencadeiam a apoptose. Estes incluem O 6 -metilguanina, N-alquilações de base, adutos volumosos de DNA, ligações cruzadas de DNA e quebras de fita dupla de DNA (DSBs). O reparo dessas lesões é importante na prevenção da apoptose. Uma exceção são as lesões de O 6 -metilguanina-timina, que requerem reparo de incompatibilidade para desencadear a apoptose. A apoptose induzida por muitas genotoxinas químicas é consequência do bloqueio da replicação do DNA, o que leva ao colapso das bifurcações de replicação e à formação de DSB. Acredita-se que esses DSBs sejam lesões desencadeadoras de apoptose a jusante. DSBs são detectados por proteínas ATM (ataxia telangiectasia mutada) e ATR (ataxia telangiectasia e Rad3 relacionado), que sinalizam a jusante para CHK1, CHK2 (checkpoint quinases) e p53. O p53 induz a ativação transcricional de fatores pró-apoptóticos, como FAS, PUMA e BAX. Muitos tumores abrigam mutações em p53. Existem sistemas de backup de p53 que envolvem ativação de E2F1 orientada por CHK1 e / ou CHK2 e regulação positiva de p73, que por sua vez transcreve BAX, PUMA e NOXA. Outro gatilho de apoptose após dano ao DNA é a inibição da síntese de RNA, que leva a um declínio no nível de produtos de genes críticos, como MKP1 (proteína quinase fosfatase ativada por mitogênio). Isso causa ativação sustentada de JNK (quinase Jun) e, finalmente, AP-1, que estimula a ativação do receptor de morte. A sinalização desencadeada por danos no DNA e a execução da apoptose é específica para o tipo de célula e genotoxina, dependendo do status do p53 (p63 e p73), resposta do receptor de morte, ativação da MAP-quinase e, mais importante, capacidade de reparo do DNA. Como a maioria dos medicamentos anticancerígenos clínicos tem como alvo o DNA, espera-se que o aumento do conhecimento sobre a sinalização desencadeada por danos no DNA que leva à morte celular forneça novas estratégias para intervenções terapêuticas.

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RESULTADOS

Expressão adenoviral de FADD-DD causa apoptose de células epiteliais da próstata normais

Nossos experimentos anteriores mostrando que FADD-DD poderia induzir a apoptose de células epiteliais da próstata foram realizados por microinjeção de plasmídeos de expressão de FADD-DD (Morgan et al., 2001). Para excluir a possibilidade remota de que a apoptose fosse dependente do método de entrega FADD-DD e para permitir o uso de ensaios bioquímicos, construímos adenovírus regulados por Dox que expressam FADD-DD marcado com YFP ou um controle YFP. A coinfecção desses vírus com um vírus repressor Tet resulta em repressão eficiente na presença de Dox e expressão quando Dox é removido. A Figura 1 mostra a expressão de YFP e YFP-FADD-DD em células epiteliais da próstata primárias normais ou na linha de células de tumor epitelial da próstata DU145. A expressão foi rigidamente regulada por Dox, conforme demonstrado pelas imagens de fluorescência e Western blot. O FADD-DD, mas não o controle YFP, causou a morte das células normais (compare os painéis aeb com e e f). FADD-DD não matou as células tumorais (compare os painéis i e j com m e n). O Western blot mostra que tanto as células normais quanto as tumorais expressaram quantidades semelhantes de YFP e YFP-FADD-DD. O adenovírus que expressa FADD-DD não matou fibroblastos de próstata primários normais ou outras linhas de células de câncer de próstata (LNCaP, PC3, CA-HPV7, dados não publicados). Esses dados estendem nossos experimentos anteriores (Morgan et al., 2001) e demonstram que a diferença na resposta entre as células epiteliais da próstata normais e as células tumorais não se deve a diferenças nos níveis de expressão de FADD-DD nos diferentes tipos de células.

Fig. 1. FADD-DD mata seletivamente as células epiteliais normais da próstata. Células epiteliais primárias normais da próstata ou células tumorais DU145 foram infectadas com adenovírus regulados por Dox que expressam YFP (a, b, c, d, i, j, k, l) ou FADD-DD marcado com YFP (e, f, g, h , m, n, o, p) e um vírus TetR. Painéis adjacentes mostram imagens de fase e fluorescência do mesmo campo. A expressão foi induzida removendo Dox. FADD-DD causou a morte de células normais (e e f), mas não afetou as células DU145 (m e n). YFP não teve efeito em nenhum tipo de célula. O painel inferior mostra a proteína total testada com anti-YFP. Quantidades iguais de proteína foram expressas em cada caso. A banda superior é uma proteína de reação cruzada que serve como um controle de carregamento.

FADD-DD inibe a apoptose induzida por Fas em células do tumor da próstata

A indução de apoptose por FADD-DD foi um achado inesperado porque esta molécula tem sido amplamente usada como um inibidor da apoptose induzida por receptor de morte. Portanto, testamos se nossa molécula FADD-DD poderia inibir a apoptose induzida por Fas em células de tumor de próstata. As células DU145 ativam a caspase 8 e sofrem apoptose quando estimuladas com anticorpos Fas agonísticos na presença de cicloheximida (Rokhlinet al., 1998). Expressamos YFP ou YFP-FADD-DD do adenovírus regulado e, em seguida, tratamos as células DU145 com anti-Fas na presença de cicloheximida. As imagens de fase e fluorescência do mesmo campo foram sobrepostas para permitir o exame da morfologia de células que expressam YFP ou YFP-FADD-DD após a ativação da sinalização Fas. A Figura 2A mostra que FADD-DD preveniu a morte celular induzida por Fas, enquanto YFP não. As células mortas mostraram características típicas de apoptose com múltiplas bolhas de membrana. O Western blot para o aparecimento da forma clivada da caspase 8 mostrou que a expressão de FADD-DD evitou a ativação da caspase 8 em resposta a Fas (Figura 2B). Esses dados indicam que nossa molécula FADD-DD inibe a sinalização de apoptose por receptores de morte ativados. Portanto, a nova capacidade pró-apoptótica de FADD-DD em células epiteliais da próstata normais ocorre em adição às funções antiapoptóticas estabelecidas desta molécula, que ocorrem em células de tumor de próstata.

Fig. 2. FADD-DD inibe a apoptose induzida por Fas em células tumorais da próstata. As células DU145 foram infectadas com os adenovírus YFP ou YFP-FADD-DD, a expressão foi induzida pela remoção de Dox e, em seguida, as células foram tratadas com um anticorpo agonístico anti-Fas. (A) Morfologia celular indicando apoptose induzida por Fas que é inibida por YFP-FADD-DD, mas não por YFP. (B) Amostras de proteína total Western blotted com anticaspase 8. Fas estimula a caspase 8 conforme indicado pelo aparecimento da banda de caspase 8 processada que é inibida por YFP-FADD-DD.

FADD-DD ativa caspases em células epiteliais normais

Usamos células infectadas com adenovírus e Western blotting para testar se as caspases são ativadas por FADD-DD. Primeiro, testamos se FADD-DD poderia causar o aparecimento de epítopos dependentes de caspase em proteínas endógenas. A citoqueratina 18 é clivada por caspases efetoras (Caulin et al., 1997) durante a apoptose de células epiteliais. Um neo-epítopo dependente de caspase revelado pela clivagem da citoqueratina 18 em Asp398 é reconhecido pelo anticorpo M30 (Bantel et al., 2000). O anticorpo reconhece dois fragmentos de ∼45 e 21 kDa, dependendo se um segundo sítio de caspase em Asp 237 também é clivado (Bantel et al., 2000). Para testar se a expressão de FADD-DD levou à clivagem da citoqueratina 18, expressamos YFP ou YFP-FADD-DD dos adenovírus regulados, coletamos as células e testamos um Western blot com o anticorpo M30. A Figura 3A mostra que FADD-DD e o controle positivo (tratamento com sorbitol para induzir apoptose induzida por estresse hiperosmolar) causaram o aparecimento do neo-epítopo de 45 kDa, enquanto a expressão de YFP não. O sorbitol também causou o aparecimento da banda de 21 kDa. Também detectamos PARP clivada pela caspase em resposta a FADD-DD e sorbitol. As proteínas clivadas não estavam presentes quando as células que expressam FADD-DD foram tratadas com o inibidor de caspase zVAD.fmk. Estes dados indicam que as caspases efetoras ativas são induzidas por FADD-DD em células normais da próstata.

Fig. 3. Ativação de caspase por FADD-DD. As células epiteliais normais da próstata foram infectadas com adenovírus YFP ou YFP-FADD-DD ou tratadas com sorbitol 300 mM como controle. As células foram colhidas e os extratos de proteína total separados em géis e Western blotted com os anticorpos indicados. O painel A mostra que FADD-DD causa o aparecimento de formas clivadas de citoqueratina 18 e PARP que são bloqueadas pelo tratamento com zVAD.fmk. O painel B mostra que as formas ativas da caspase 9, 7, 3 e 6, mas não da caspase 8, são induzidas por FADD-DD.

Em seguida, perguntamos quais caspases foram ativadas após a expressão de YFP ou YFP-FADD-DD (Figura 3B). Como controle positivo para garantir que os anticorpos funcionassem, usamos células tratadas com sorbitol. Ao contrário das outras caspases, onde a clivagem é necessária e suficiente para ativação, a caspase 9 não requer processamento para ativação (Renatus et al., 2001). No entanto, a caspase 9 ativa se digere quando é ativada por dimerização (Renatus et al., 2001). Assim, a presença de caspase 9 clivada indica atividade da caspase 9. O tratamento com sorbitol e a expressão de FADD-DD causaram o aparecimento de formas ativas de caspase 9, caspase 7 e caspase 3. A caspase 6 ativa foi detectada em células que expressam FADD-DD, mas não nas células tratadas com sorbitol. O sorbitol e o FADD-DD levaram a níveis semelhantes de clivagem da caspase 9, mas o sorbitol foi mais eficaz na ativação da caspase 3 e da caspase 7 do que o FADD-DD. Não foi possível detectar a ativação da caspase 8 por FADD-DD, no entanto, o sorbitol foi eficaz na ativação da caspase 8. A ativação da caspase 8 pelo sorbitol provavelmente contribui para o aumento da atividade das caspases 3 e 7 em comparação com FADD-DD. zVAD.fmk inibiu o aparecimento de formas clivadas das caspases em células que expressam FADD-DD, sugerindo que as caspases efetoras são ativadas como resultado da ativação de caspases iniciadoras (isto é, caspase 9) e que a caspase 9 ativada se digere. Esses dados sugerem que o FADD-DD estimula a via intrínseca nas células normais da próstata para ativar a caspase 9 e as caspases efetoras a jusante. O FADD-DD não ativa a caspase 8, que geralmente é ativada por receptores de morte. Isso não é surpreendente porque FADD-DD não possui o domínio efetor de morte que é necessário para a ativação da caspase 8.

Caspases e serina proteases contribuem para a apoptose induzida por FADD-DD

Apesar do fato de que as caspases são ativadas por FADD-DD, descobrimos anteriormente que os inibidores de caspase não poderiam prevenir a morte de células epiteliais da próstata induzida por FADD-DD (Morgan et al., 2001). Portanto, testamos se outras proteases podem estar envolvidas nesta resposta. Vários estudos indicam um papel para serina proteases na apoptose (Johnson, 2000 Leist e Jaattela, 2001a). Além disso, algumas proteínas, como o supressor de tumor Bin1 induzem apoptose que pode ser bloqueada por inibidores de serina protease como AEBSF, mas não por inibidores de caspase (Elliott et al., 2000). Para testar se um inibidor de serina protease poderia prevenir a apoptose induzida por FADD-DD, injetamos células epiteliais da próstata normal com plasmídeos de expressão de FADD-DD, em seguida, tratamos as células com zVAD.fmk ou AEBSF e monitoramos a sobrevivência celular determinando o destino de cada FADD-DD –Expressando célula.

A Figura 4 mostra que nem zVAD.fmk nem AEBSF podem prevenir a morte celular quando adicionados por conta própria. No entanto, quando tratamos células que expressam FADD-DD com ambos os inibidores simultaneamente, elas sobreviveram. Algumas das células YFP de controle sofreram divisão celular, resultando em uma sobrevivência aparente de & gt100%, enquanto as células que expressam FADD-DD não aumentaram acima de 100%, mesmo na presença de ambos os inibidores. Isto pode refletir um efeito separado dos inibidores de protease ou FADD-DD inibindo o crescimento celular. Como tanto o inibidor de caspase quanto o inibidor de serina protease são necessários para prevenir a morte celular, esses dados sugerem que sinais separados de caspase e serina protease são ativados por FADD-DD e que uma enzima não está a montante da outra. Além disso, se um sinal for bloqueado, a outra protease é suficiente para matar as células. Porque foi relatado que zVAD.fmk pode inibir a catepsina B (Schotte et al., 1999), testamos se um inibidor específico da catepsina B (CA-074-ME) poderia cooperar com AEBSF para prevenir a morte celular induzida por FADD-DD. O inibidor da catepsina B não mimetizou o efeito de zVAD.fmk (dados não publicados), indicando que as próprias caspases são importantes na resposta.

Fig. 4. Caspases e serina proteases contribuem para a apoptose induzida por FADD-DD. As células normais da próstata foram injetadas com o controle YFP de plasmídeos de expressão YFP-FADD-DD como indicado, em seguida, tratadas com o inibidor de caspase (zVAD.fmk, 0,1 mM) ou inibidor de serina protease (AEBSF, 0,3 mM) como indicado. A porcentagem de células injetadas que sobrevivem foi determinada após 24 horas de incubação, indicando que nem zVAD.fmk ou AEBSF isoladamente poderia prevenir a morte celular induzida por FADD-DD, mas a combinação de ambos os inibidores preveniu a morte. Os dados apresentados são médias ± SEM de cinco experiências separadas.

Caspases e serina proteases têm efeitos diferentes na morfologia das células mortas

Existem exemplos na literatura onde outras proteases e caspases induzem fenótipos apoptóticos semelhantes, presumivelmente pela clivagem dos mesmos substratos (Foghsgaard et al., 2001). Existem também exemplos em que os fenótipos de células que morrem em resposta a estímulos que podem ativar tanto as caspases quanto outros sinais de morte são bastante diferentes (McCarthy et al., 1997). Para determinar se as células epiteliais da próstata normais que morrem em resposta a FADD-DD utilizam sinais dependentes de caspase e serina protease para matar as células de maneiras diferentes, usamos a microscopia de lapso de tempo. A Figura 5 mostra quadros de séries de lapso de tempo de células normais da próstata injetadas com FADD-DD na ausência ou presença de zVAD.fmk e AEBSF. As imagens de fluorescência são sobrepostas na imagem de fase. A figura mostra as mesmas células no ponto de tempo inicial e no ponto de tempo final (6–7 h para o controle, células tratadas com zVAD.fmk e AEBSF e 15 h para as células tratadas com zVAD.fmk + AEBSF). As células verdes expressam FADD-DD. Filmes Quicktime deste experimento estão incluídos no material suplementar. Sem inibidores, as células que expressam FADD-DD se contraem e exibem várias bolhas de membrana (setas) que retêm a proteína fluorescente, como é típico da apoptose dependente de caspase. Na presença de zVAD.fmk, as células moribundas se contraem, se arredondam e se destacam do prato, mas não exibem bolhas de membrana. Por outro lado, as células injetadas com FADD-DD morrendo na presença de AEBSF sem zVAD.fmk exibem características típicas da atividade da caspase, como bolhas de membrana. De acordo com os dados de sobrevivência celular mostrados na Figura 4, a maioria das células que expressam FADD-DD na presença de zVAD.fmk e AEBSF permanecem planas e presas ao prato. Assim, as caspases que são ativadas por FADD-DD em células epiteliais normais causam a formação de bolhas na membrana distinta, característica das células que estão morrendo.

Fig. 5. Caspases e serina proteases regulam diferentes aspectos da apoptose induzida por FADD-DD. As células normais da próstata foram injetadas com o plasmídeo de expressão YFP-FADD-DD e depois incubadas com zVAD.fmk ou AEBSF como indicado. A microscopia de fluorescência de lapso de tempo foi realizada para monitorar a resposta de cada célula injetada. As imagens mostram fluorescência sobreposta e imagens de fase das mesmas células no início e no final do experimento, indicando que FADD-DD causa bolhas na membrana e fragmentação celular que é bloqueada por zVAD.fmk, mas não por AEBSF. Filmes Quicktime desses experimentos estão contidos no material suplementar.

Bcl-xL inibe fenótipos dependentes de caspase em apoptose induzida por FADD-DD

Bcl-xL bloqueia a liberação de citocromo ce outras proteínas mitocondriais. Examinamos a morfologia das células que coexpressam FADD-DD e Bcl-xL. O Bcl-xL evitou a formação de bolhas na membrana, mas não evitou o arredondamento das células (Figura 6A). Isso sugere que Bcl-xL inibiu a ativação da caspase, mas não a serina protease que é inibida por AEBSF. Inibição semelhante de bolhas foi observada quando coexpressamos FADD-DD com uma versão dominante negativa da caspase 9 (dn9), que tem uma mutação cisteína-serina no sítio ativo. Esses dados sugerem que o FADD-DD ativa a caspase 9 através da via mitocondrial e o Bcl-xL deve inibir as caspases induzidas por FADD-DD. Testamos essa hipótese medindo diretamente a atividade da caspase em células que foram injetadas com FADD-DD usando um método baseado em FRET (Morgan e Thorburn, 2001). O método permite a medição contínua da atividade da caspase em células individuais. Monitoramos as mudanças na atividade da caspase por 120 min antes do início da contração celular e arredondamento nas células que expressam FADD-DD na presença ou ausência de Bcl-xL. Isso é conseguido monitorando as alterações na proporção de fluorescência amarela (FRET) / fluorescência ciana emitida a partir de uma fusão CFP-YFP que pode ser clivada pela caspase 3 e outras caspases efetoras. A Figura 6B mostra a atividade da caspase em sete células que expressam FADD-DD– e sete FADD-DD + Bcl-xL. O FADD-DD causa a ativação de uma caspase que pode clivar a sonda FRET. Isto é mostrado por um aumento na atividade da caspase medida por uma perda de FRET e aumento na fluorescência do ciano, resultando em uma mudança na razão amarelo / ciano.

Fig. 6. Bcl-xL inibe a ativação de caspases por FADD-DD. As células que expressam FADD-DD foram co-injetadas com plasmídeos de expressão de controle, Bcl-xL e caspase 9 (dn9) dominante negativa. O painel A mostra a morfologia das células injetadas. Bcl-xL e dn9 inibem a bolha da membrana que é tipicamente observada com FADD-DD sozinho. As imagens são sobrepostas de fluorescência e imagens de fase, as células verdes expressam a molécula FADD-DD marcada com YFP. O painel B mostra a ativação da caspase em sete células injetadas com FADD-DD (linhas vermelhas) e sete células injetadas com FADD-DD mais Bcl-xL (linhas azuis) junto com o plasmídeo de expressão que codifica a sonda FRET amarelo ciano. Imagens de fluorescência foram capturadas para fluorescência amarela e ciana, e a razão de fluorescência amarela / ciana por unidade de área foi calculada para cada ponto de tempo. A mudança inversa na razão FRET indicativa da ativação da caspase foi traçada após a normalização para cada célula. A quantificação foi de 120 minutos antes da contração celular e do arredondamento começar (tempo designado 0). FADD-DD causa um aumento abrupto na atividade da caspase que é prevenida por Bcl-xL. O painel C mostra a sobrevivência celular de células injetadas com FADD-DD, células injetadas com FADD-DD mais Bcl-xL ou células injetadas com FADD-DD mais caspase 9 dominante negativa (dn9) na presença ou ausência de AEBSF (AE) ou zVAD .fmk (zVAD) onde indicado. FADD-DD induz a morte celular que não pode ser bloqueada por AEBSF, zVAD, Bcl-xL ou dn9 sozinho. Bcl-xL e zVAD.fmk não cooperam para prevenir a morte induzida por FADD-DD. Tanto o Bcl-xL quanto a caspase 9 dominante negativa cooperam com AEBSF para inibir a morte celular induzida por FADD-DD, resultando em sobrevivência celular semelhante ao controle YFP. Os dados são médias ± SEM entre 4 e 12 experimentos para cada amostra.

O aumento na atividade da caspase começa abruptamente 30-60 min antes de cada célula começar a se contrair, o que foi designado como tempo 0. Bcl-xL inibiu esta ativação da caspase e não houve aumento detectável na atividade da caspase em qualquer um dos Bcl-xL-expressando células. Observe, no entanto, que, como as células FADD-DD sozinhas, cada uma das células que expressam Bcl-xL sofreu contração celular e arredondamento, começando no ponto de tempo designado como 0 min. As caspases presumivelmente tornam-se ativas logo após a liberação do citocromo c, que Green e colegas demonstraram ser rápido e coordenado dentro de cada célula (Goldstein et al., 2000). Juntos, esses dados sugerem que a ativação da caspase ocorre por meio da via mitocondrial e que a serina protease que é inibida pela AEBSF é ativada por um mecanismo diferente. Se isso estiver correto, Bcl-xL ou caspase 9 dominante negativa devem falhar em inibir a morte celular induzida por FADD-DD por conta própria, mas, em vez disso, devem cooperar com AEBSF para prevenir a morte celular. Por outro lado, Bcl-xL não deve cooperar com zVAD.fmk para inibir a morte induzida por FADD-DD. A Figura 6C mostra que esse é realmente o caso. A morte celular foi bloqueada de forma eficiente apenas pela combinação de AEBSF com Bcl-xL ou caspase 9 dominante negativa.

FADD de comprimento total induz apoptose por meio de um mecanismo independente de caspase 8 em células da próstata normais, mas não cancerosas

Os experimentos anteriores foram realizados usando a molécula FADD-DD truncada. A expressão de FADD de tipo selvagem de comprimento total induz apoptose em todas as células em virtude de sua capacidade de ativar a caspase 8. Para testar se a mesma via poderia ser ativada por FADD de comprimento total em vez de apenas a molécula truncada, primeiro identificamos o ponto FADD mutantes que são incapazes de se ligar à caspase 8 usando uma triagem reversa de dois híbridos (Thomas et al., 2002). As telas reversas de dois híbridos identificam os mutantes que perderam a capacidade de interagir com uma proteína específica. Nosso método modificado requer que esses mutantes retenham a capacidade de interagir com uma proteína diferente e, assim, seleciona os mutantes que perdem as interações de ligação específicas sem afetar a estrutura ou estabilidade geral da proteína. Rastreamos & gt500.000 mutantes FADD aleatórios e identificamos mutantes que retinham a capacidade de interagir com Fas, mas não podiam interagir com a caspase 8. Todas as mutações estavam no domínio efetor de morte da proteína. Três mutantes (L8P, S12L e L15P) foram escolhidos para análise posterior. Todos os três mutantes se ligaram a Fas, mas não a caspase 8. Os mutantes L8P e L15P também exibiram ligação de tipo selvagem a TRADD (Figura 7A). Os mutantes foram feitos como fusões GFP e injetados em células normais da próstata ou células tumorais DU145. Se a apoptose dependente de FADD em células normais for distinta do mecanismo de ação estabelecido de FADD por meio da caspase 8, esses mutantes devem se comportar como FADD-DD e matar células normais da próstata, mas não células tumorais da próstata. A Figura 7B mostra que foi esse o caso.

Fig. 7. O FADD de comprimento total mata as células normais da próstata por meio de um mecanismo independente da caspase 8. (A) Ensaios de filtro β-galactosidase de levedura de interações dirigidas de dois híbridos de mutantes FADD de comprimento total que foram selecionados por triagem reversa de dois híbridos para falha em interagir com a caspase 8, mantendo a capacidade de interagir com Fas. Os mutantes FADD L8P e L15P ligaram-se a TRADD e Fas, mas não à caspase 8. O mutante S12L não se ligou à caspase 8 ou TRADD. Os controles mostram ensaios β-Gal de levedura expressando o vetor vazio e FADD de tipo selvagem que se liga à caspase 8. (B) Ensaios de sobrevivência celular após microinjeção de YFP, FADD-DD ou os mutantes FADD de comprimento total L8P, S12L e L15P em células normais da próstata e células de câncer de próstata DU145. FADD-DD e os três mutantes FADD de comprimento total mataram células normais, mas não células DU145. (C) Sobrevivência celular após microinjeção de YFP ou FADD de tipo selvagem em células normais da próstata ou células DU145. O FADD de tipo selvagem matou células normais e células cancerosas. A co-expressão da caspase 8 dominante negativa (dn8) ou o pré-tratamento com um inibidor da caspase 8 (zIETD) inibiu a morte induzida por FADD em células DU145, mas não em células normais da próstata. Esses dados indicam que o FADD pode matar as células normais da próstata em um mecanismo independente da caspase 8 que não está ativo nas células DU145.

Embora os mutantes pontuais FADD e o domínio de morte FADD isolado sejam apenas capazes de matar células epiteliais normais, a proteína de tipo selvagem pode induzir a apoptose em células normais e cancerosas. Em seguida, testamos se essa morte foi inibida por inibidores da caspase 8.A coexpressão de GFP-FADD de tipo selvagem de comprimento total com caspase 8 dominante negativa ou tratamento com um inibidor seletivo da caspase 8 (zIETD.fmk) inibiu a apoptose de células cancerosas da próstata, mas não inibiu a apoptose de células normais da próstata (Figura 7C) . Esses dados indicam que o FADD pode ativar duas vias de apoptose nas células epiteliais da próstata. A primeira via envolve o recrutamento da caspase 8 através do domínio efetor da morte e funções nas células cancerosas da próstata e nas células normais da próstata. A segunda via funciona através do domínio de morte FADD, não envolve a caspase 8 e funciona apenas em células normais.

A apoptose induzida por TRAIL de células normais da próstata ocorre por meio de vias dependentes de caspase e serina protease

Os experimentos anteriores foram realizados usando moléculas FADD expressas exogenamente. No entanto, não há razão para pensar que a sinalização de FADD em resposta a sinais fisiológicos seja mediada pela regulação dos níveis de expressão de FADD. Em vez disso, o FADD é ativado por receptores de morte, como Fas, TNFR1 ou os receptores TRAIL, e o FADD superexpresso imita os efeitos que ocorrem em resposta à sinalização do receptor, por exemplo, pela ativação da caspase 8. Na maioria dos casos, apoptose após a ativação desses receptores é inibido por inibidores da caspase, como zVAD.fmk. Existem, no entanto, exemplos onde esses receptores induzem apoptose independente de caspase (Foghsgaard et al., 2001) e necrose (Vercammen et al., 1998a, 1998b Denecker et al., 2001).

Se os receptores de morte ativam a via de apoptose dependente de FADD-DD, devemos descobrir que a apoptose de células prostáticas normais induzida pelo ligante relevante não seria completamente inibida por zVAD.fmk sozinho, mas mostraria inibição aumentada por zVAD.fmk mais AEBSF. Por outro lado, as células do tumor da próstata devem ser incapazes de ativar a via independente da caspase 8 e, portanto, devem ser protegidas ao máximo pelo zVAD.fmk sozinho. O TNF-α não matou com eficiência as células normais da próstata (dados não publicados), mas tanto o ligante Fas quanto a apoptose induzida por TRAIL de células normais da próstata. Foi relatado que TRAIL é incapaz de matar células humanas normais, incluindo células epiteliais normais da próstata (Ashkenazi et al., 1999 Walczak et al., 1999). No entanto, outros pesquisadores descobriram que TRAIL pode induzir a apoptose de células epiteliais normais da próstata (Nesterov et al., 2002), corroborando assim nossas observações.

A morte induzida por TRAIL de células normais da próstata foi apenas parcialmente inibida por zVAD.fmk como mostrado pela presença de muitas células arredondadas e destacadas, mas foi bloqueada por zVAD.fmk mais AEBSF (Figura 8). AEBSF por si só não evitou a morte celular induzida por TRAIL. O inibidor de caspase preveniu a formação de bolhas na membrana porque o tratamento com TRAIL na presença de zVAD.fmk resultou em muitas células arredondadas sem bolhas perceptíveis. TRAIL sozinho e TRAIL mais tratamentos AEBSF resultaram em muitas células com bolhas de membrana visíveis. O envolvimento de uma atividade que é inibida por AEBSF foi específico para as células normais porque a morte induzida por TRAIL de células DU145 foi inibida completamente por zVAD.fmk. A adição de AEBSF não conferiu proteção adicional às células DU145. Esses dados sugerem que o TRAIL pode ativar a via de apoptose dependente da caspase 8 convencional e a via que envolve os sinais sensíveis à caspase e AEBSF em células normais da próstata, mas só pode ativar a via da caspase 8 em células cancerosas.

Fig. 8. TRAIL induz apoptose de células da próstata normais, mas não cancerosas, através de uma atividade sensível a AEBSF. Células epiteliais da próstata normais e células de câncer de próstata DU145 foram tratadas com cicloheximida sozinha (controle) ou cicloheximida mais TRAIL recombinante na presença de zVAD.fmk ou AEBSF como indicado. A sobrevivência celular foi determinada por microscopia após 24 h. TRAIL matou células normais e cancerosas da próstata. O inibidor de caspase zVAD.fmk evitou com eficiência a morte celular nas células DU145, mas não preveniu a morte nas células normais da próstata. A adição de AEBSF e zVAD.fmk preveniu a morte de células normais. Estes dados indicam que TRAIL ativa as vias de morte celular em células normais da próstata que têm os mesmos requisitos para os sinais dependentes de caspase e serina protease que o FADD-DD.


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A transição epitelial-mesenquimal foi reconhecida pela primeira vez como uma característica da embriogênese por Betty Hay na década de 1980. [1] [2] EMT, e seu processo reverso, MET (transição mesenquimal-epitelial) são críticos para o desenvolvimento de muitos tecidos e órgãos no embrião em desenvolvimento e vários eventos embrionários, como gastrulação, formação de crista neural, formação de válvula cardíaca, desenvolvimento secundário do palato e miogênese. [3] As células epiteliais e mesenquimais diferem tanto no fenótipo quanto na função, embora ambas compartilhem plasticidade inerente. [2] As células epiteliais estão intimamente conectadas umas às outras por tight junctions, gap junctions e aderentes junctions, têm uma polaridade ápico-basal, polarização do citoesqueleto de actina e são ligadas por uma lâmina basal em sua superfície basal. Já as células mesenquimais não têm essa polarização, têm morfologia fusiforme e interagem entre si apenas por meio de pontos focais. [4] As células epiteliais expressam altos níveis de E-caderina, enquanto as células mesenquimais expressam os de N-caderina, fibronectina e vimentina. Assim, a EMT acarreta mudanças morfológicas e fenotípicas profundas em uma célula. [5]

Com base no contexto biológico, a EMT foi categorizada em 3 tipos: de desenvolvimento (Tipo I), fibrose [6] e cicatrização de feridas (Tipo II) e câncer (Tipo III). [7] [8] [9]

A perda da caderina-E é considerada um evento fundamental na EMT. Muitos fatores de transcrição (TFs) que podem reprimir a E-caderina direta ou indiretamente podem ser considerados como EMT-TF (TFs indutores de EMT). SNAI1 / Snail 1, SNAI2 / Snail 2 (também conhecido como Slug), ZEB1, ZEB2, TCF3 e KLF8 (fator 8 semelhante a Kruppel) podem se ligar ao promotor da caderina-E e reprimir sua transcrição, enquanto fatores como Twist, Goosecoid , TCF4 (também conhecido como E2.2), proteína homeobox SIX1 e FOXC2 (proteína C2 de caixa de cabeça de garfo) reprimem a caderina-E indiretamente. [10] [11] Os fatores SNAIL e ZEB se ligam às sequências de consenso da caixa E na região do promotor, enquanto o KLF8 se liga ao promotor por meio das caixas GT. Esses EMT-TFs não apenas reprimem diretamente a E-caderina, mas também reprimem transcricionalmente outras proteínas juncionais, incluindo claudinas e desmossomos, facilitando assim a EMT. Por outro lado, fatores de transcrição, como homólogo de proteína 2 semelhante a grainyhead (GRHL2), e fatores de transcrição relacionados a ETS ELF3 e ELF5 são regulados para baixo durante a EMT e são encontrados para conduzir ativamente MET quando superexpresso em células mesenquimais. [12] [13] Como a EMT na progressão do câncer recaptura a EMT em programas de desenvolvimento, muitos dos EMT-TFs estão envolvidos na promoção de eventos metastáticos. [14] [15]

Várias vias de sinalização (TGF-β, FGF, EGF, HGF, Wnt / beta-catenina e Notch) e hipóxia podem induzir EMT. [7] [16] [17] Em particular, Ras-MAPK foi mostrado para ativar Snail e Slug. [18] [19] [20] Slug desencadeia as etapas de ruptura desmossômica, disseminação celular e separação parcial nas bordas célula-célula, que constituem a primeira e necessária fase do processo de EMT. Por outro lado, Slug não pode desencadear a segunda fase, [21] que inclui a indução da motilidade celular, repressão da expressão de citoqueratina e ativação da expressão de vimentina. [22] Snail e Slug são conhecidos por regular a expressão de isoformas de p63, outro fator de transcrição necessário para o desenvolvimento adequado de estruturas epiteliais. [23] A expressão alterada das isoformas de p63 reduziu a adesão célula-célula e aumentou as propriedades migratórias das células cancerosas. O fator p63 está envolvido na inibição de EMT e a redução de certas isoformas de p63 pode ser importante no desenvolvimento de cânceres epiteliais. [24] Alguns deles são conhecidos por regular a expressão de citoqueratinas. [25] O fosfatidilinositol 3 'quinase (PI3K) / eixo AKT, a via de sinalização de Hedgehog, o fator nuclear kappaB e o Fator de Transcrição de Ativação 2 também foram implicados como envolvidos na EMT. [26] [27] [28] [29]

A via de sinalização Wnt regula a EMT na gastrulação, formação de válvula cardíaca e câncer. [30] A ativação da via Wnt em células de câncer de mama induz o regulador EMT SNAIL e regula positivamente o marcador mesenquimal, a vimentina. Além disso, a via Wnt / beta-catenina ativa se correlaciona com o mau prognóstico em pacientes com câncer de mama na clínica. Da mesma forma, o TGF-β ativa a expressão de SNAIL e ZEB para regular a EMT no desenvolvimento do coração, palatogênese e câncer. A metástase óssea do câncer de mama possui sinalização TGF-β ativada, o que contribui para a formação dessas lesões. [31] No entanto, por outro lado, o p53, um supressor de tumor bem conhecido, reprime a EMT ativando a expressão de vários microRNAs - miR-200 e miR-34 que inibem a produção da proteína ZEB e SNAIL, e assim mantém o fenótipo epitelial. [32]

Após o estágio inicial da embriogênese, a implantação do embrião e o início da formação da placenta estão associados à EMT. As células da trofoectoderme são submetidas a EMT para facilitar a invasão do endométrio e a colocação adequada da placenta, permitindo assim a troca de nutrientes e gases para o embrião. Mais tarde na embriogênese, durante a gastrulação, a EMT permite que as células ingressem em uma área específica do embrião - a linha primitiva nos amniotas e o sulco ventral na Drosophila. As células neste tecido expressam a caderina-E e a polaridade apical-basal. [33] Como a gastrulação é um processo muito rápido, a caderina-E é reprimida transcricionalmente por Twist e SNAI1 (comumente chamado de Caracol), e ao nível da proteína pela proteína que interage com P38. A linha primitiva, por meio da invaginação, gera ainda mais o mesoendoderma, que se separa para formar um mesoderma e um endoderma, novamente por meio da EMT. As células mesenquimais da linha primitiva também participam da formação de muitos órgãos epiteliais mesodérmicos, como notocórdio e somitos, por meio do reverso da EMT, ou seja, transição mesenquimal-epitelial. O anfioxo forma um tubo neural epitelial e notocórdio dorsal, mas não possui o potencial EMT da linha primitiva. Em cordados superiores, o mesênquima origina-se da linha primitiva migra anteriormente para formar os somitos e participar com o mesênquima da crista neural na formação do mesoderma do coração.

Em vertebrados, o epitélio e o mesênquima são os fenótipos básicos do tecido. Durante o desenvolvimento embrionário, as células migratórias da crista neural são geradas por EMT envolvendo as células epiteliais do neuroectoderma. Como resultado, essas células se dissociam das dobras neurais, ganham mobilidade e se disseminam para várias partes do embrião, onde se diferenciam em muitos outros tipos de células. Além disso, o mesênquima da crista craniofacial, que forma o tecido conjuntivo que forma a cabeça e a face, é formado pelo epitélio do tubo neural por EMT. [34] A EMT ocorre durante a construção da coluna vertebral fora da matriz extracelular, que deve ser sintetizada por fibroblastos e osteoblastos que circundam o tubo neural. A principal fonte dessas células são o esclerótomo e o mesênquima de somito, bem como a linhagem primitiva. A morfologia mesenquimal permite que as células viajem para alvos específicos no embrião, onde se diferenciam e / ou induzem a diferenciação de outras células. [34] [35]

Durante a cicatrização da ferida, os queratinócitos na borda da ferida são submetidos à EMT e à reepitelização ou MET quando a ferida é fechada. A expressão de Snail2 na frente migratória influencia esse estado, pois sua superexpressão acelera a cicatrização de feridas. Da mesma forma, em cada ciclo menstrual, o epitélio da superfície ovariana sofre EMT durante a cicatrização de feridas pós-ovulatórias. [36]

O início da metástase requer invasão, que é habilitada pela EMT. [37] [38] As células de carcinoma em um tumor primário perdem a adesão célula-célula mediada pela repressão da caderina-E e rompem a membrana basal com propriedades invasivas aumentadas e entram na corrente sanguínea por meio de intravasamento. Mais tarde, quando essas células tumorais circulantes (CTCs) saem da corrente sanguínea para formar micro-metástases, elas são submetidas a MET para crescimento clonal nesses locais metastáticos. Assim, EMT e MET formam o início e a conclusão da cascata de invasão-metástase. [39] Nesse novo local metastático, o tumor pode passar por outros processos para otimizar o crescimento. Por exemplo, a EMT foi associada à expressão de PD-L1, particularmente no câncer de pulmão. Níveis aumentados de PD-L1 suprimem o sistema imunológico, o que permite que o câncer se espalhe mais facilmente. [40]

A EMT confere resistência à senescência prematura induzida por oncogene. Twist1 e Twist2, bem como ZEB1, protegem células humanas e fibroblastos embrionários de camundongo da senescência. Da mesma forma, o TGF-β pode promover a invasão do tumor e a evasão da vigilância imunológica em estágios avançados. Quando o TGF-β atua nas células epiteliais mamárias que expressam Ras ativadas, a EMT é favorecida e a apoptose é inibida. [41] Esse efeito pode ser revertido por indutores de diferenciação epitelial, como o GATA-3. [42]

Foi demonstrado que a EMT é induzida pela terapia de privação de androgênio no câncer de próstata metastático. [14] A ativação de programas EMT por meio da inibição do eixo androgênico fornece um mecanismo pelo qual as células tumorais podem se adaptar para promover a recorrência e progressão da doença. Brachyury, Axl, MEK e Aurora quinase A são impulsionadores moleculares desses programas, e os inibidores estão atualmente em ensaios clínicos para determinar as aplicações terapêuticas. [14] PKC-iota oncogênico pode promover a invasão de células de melanoma ao ativar a Vimentina durante a EMT. A inibição ou knockdown de PKC-iota resultou em um aumento dos níveis de E-caderina e RhoA enquanto diminuía a Vimentina total, a Vimentina fosforilada (S39) e a Par6 em células de melanoma metastático. Estes resultados sugeriram que PKC-ι está envolvido nas vias de sinalização que regulam positivamente a EMT no melanoma. [43] [44]

A EMT foi indicada como envolvida na aquisição de resistência aos medicamentos. Descobriu-se que o ganho de marcadores EMT estava associado à resistência das linhas de células epiteliais de carcinoma do ovário ao paclitaxel. Da mesma forma, SNAIL também confere resistência ao paclitaxel, adriamicina e radioterapia ao inibir a apoptose mediada por p53. [45] Além disso, foi recentemente demonstrado que a inflamação, que tem sido associada à progressão do câncer e da fibrose, está relacionada ao câncer por meio da EMT induzida por inflamação. [46] Consequentemente, a EMT permite que as células ganhem um fenótipo migratório, bem como induzam imunossupressão múltipla, resistência a medicamentos e mecanismos de evasão de apoptose.

Algumas evidências sugerem que as células submetidas a EMT ganham propriedades semelhantes às das células-tronco, dando origem às Células-Tronco do Câncer (CSCs). Após a transfecção por Ras ativado, uma subpopulação de células exibindo os marcadores de células-tronco putativos CD44high / CD24low aumenta com a indução concomitante de EMT. [47] Além disso, ZEB1 é capaz de conferir propriedades semelhantes a células-tronco, fortalecendo assim a relação entre EMT e stemness. Assim, a EMT pode representar perigo aumentado para pacientes com câncer, uma vez que a EMT não apenas permite que as células do carcinoma entrem na corrente sanguínea, mas também as confere com propriedades de stemness que aumentam o potencial tumorigênico e proliferativo. [48]

No entanto, estudos recentes mudaram ainda mais os efeitos primários da EMT da invasão e metástase, em direção à resistência aos agentes quimioterápicos. Pesquisas sobre câncer de mama e câncer de pâncreas não demonstraram nenhuma diferença no potencial metastático das células após a aquisição de EMT. [49] [50] Eles estão de acordo com outro estudo que mostra que o fator de transcrição EMT TWIST realmente requer junções aderentes intactas para mediar a invasão local no câncer de mama. [51] Os efeitos da EMT e sua relação com a invasão e metástase podem, portanto, ser altamente específicos ao contexto.

Em linhas celulares de carcinoma urotelial, a superexpressão de HDAC5 inibe a proliferação de longo prazo, mas pode promover a transição epitelial-mesenquimal (EMT). [52]

As plaquetas no sangue têm a capacidade de iniciar a indução de EMT nas células cancerosas. Quando as plaquetas são recrutadas para um local no vaso sanguíneo, elas podem liberar uma variedade de fatores de crescimento (PDGF, [53] VEGF, [54] Angiopoietina-1 [55]) e citocinas, incluindo o indutor EMT TGF-β. [56] A liberação de TGF-β pelas plaquetas em vasos sanguíneos próximos a tumores primários aumenta a capacidade de invasão e promove a metástase de células cancerosas no tumor. [57] Estudos observando plaquetas defeituosas e contagens de plaquetas reduzidas em modelos de camundongos mostraram que o comprometimento da função plaquetária está associado à diminuição da formação de metástases. [58] [59] Em humanos, as contagens de plaquetas e trombocitose dentro do limite superior da faixa normal foram associadas a câncer em estágio avançado, geralmente metastático, no câncer cervical, [60] câncer de ovário, [61] câncer gástrico, [62] ] e câncer de esôfago. [63] Embora muitas pesquisas tenham sido aplicadas para estudar as interações entre as células tumorais e as plaquetas, uma terapia contra o câncer visando essa interação ainda não foi estabelecida. [64] Isso pode ser em parte devido à redundância das vias protrombóticas que exigiriam o uso de múltiplas abordagens terapêuticas para prevenir eventos pró-metastáticos por meio da indução de EMT em células cancerosas por plaquetas ativadas.

Para melhorar as chances de desenvolvimento de uma metástase de câncer, uma célula cancerosa deve evitar a detecção e o direcionamento pelo sistema imunológico, uma vez que entra na corrente sanguínea. As plaquetas ativadas têm a capacidade de se ligar a glicoproteínas e glicolipídeos (ligantes da selectina P, como PSGL-1) na superfície das células cancerosas para formar uma barreira física que protege a célula cancerosa da lise mediada por células assassinas naturais na corrente sanguínea. [65] Além disso, as plaquetas ativadas promovem a adesão das células cancerosas às células endoteliais ativadas que revestem os vasos sanguíneos usando moléculas de adesão presentes nas plaquetas. [66] [64] Ligantes da selectina P na superfície das células cancerosas ainda precisam ser elucidados e podem servir como biomarcadores potenciais para a progressão da doença no câncer. [64]

Muitos estudos propuseram que a indução de EMT é o mecanismo primário pelo qual as células cancerosas epiteliais adquirem fenótipos malignos que promovem metástases. [67] O desenvolvimento de drogas visando a ativação de EMT em células cancerosas tornou-se, portanto, um objetivo das empresas farmacêuticas. [68]

Inibidores de moléculas pequenas Editar

Pequenas moléculas que são capazes de inibir a EMT induzida por TGF-β estão em desenvolvimento. [68] O silmitasertibe (CX-4945) é um inibidor de pequena molécula da proteína quinase CK2, que foi apoiado para ser ligado a EMT induzida por TGF-β e está atualmente em ensaios clínicos para colangiocarcinoma (câncer do ducto biliar), bem como no desenvolvimento pré-clínico para malignidades hematológicas e linfóides. [69] [70] Em janeiro de 2017, o silmitasertibe recebeu o status de medicamento órfão pela Food and Drug Administration dos EUA para colangiocarcinoma e está atualmente em estudo de fase II. Silmitasertib está sendo desenvolvido pela Senhwa Biosciences.[71] Outro inibidor de molécula pequena Galunisertib (LY2157299) é um potente inibidor da quinase do receptor TGF-β tipo I que demonstrou reduzir o tamanho, a taxa de crescimento de tumores e o potencial de formação de tumor em linhagens de células de câncer de mama triplo negativo usando camundongos xenoenxertos. [72] O galunisertibe está sendo desenvolvido atualmente pela Lilly Oncology e está em ensaios clínicos de fase I / II para carcinoma hepatocelular, câncer pancreático irressecável e glioma maligno. [73] Inibidores de pequenas moléculas de EMT são sugeridos para não atuarem como um substituto para os agentes quimioterápicos tradicionais, mas provavelmente apresentam maior eficácia no tratamento de cânceres quando usados ​​em conjunto com eles.

Antagomirs e mimetizadores de microRNA ganharam interesse como uma fonte potencial de terapêutica para direcionar metástases induzidas por EMT no câncer, bem como tratar muitas outras doenças. [74] Os antagomirs foram desenvolvidos primeiro para atingir o miR-122, um microRNA que era abundante e específico para o fígado, e essa descoberta levou ao desenvolvimento de outros antagomirs que podem emparelhar com microRNAs específicos presentes no microambiente tumoral ou no câncer células. [75] [73] Foi descoberto que um microRNA que imita miR-655 suprime a EMT por meio do direcionamento do fator de transcrição indutor de EMT ZEB1 e do receptor 2 de TGF-β em uma linha de células de câncer pancreático. A superexpressão do miR-655 mimetizador na linha de células cancerosas Panc1 regulou positivamente a expressão de E-caderina e suprimiu a migração e invasão de células cancerosas semelhantes ao mesenquimal. [76] O uso de mimetizadores de microRNA para suprimir a EMT se expandiu para outras linhagens de células cancerosas e tem potencial para o desenvolvimento de drogas clínicas. [74] No entanto, imitadores de microRNA e antagomirs sofrem de uma falta de estabilidade na Vivo e falta um sistema de entrega preciso para direcionar essas moléculas para as células tumorais ou tecido para tratamento. [77] Melhorias no antagomir e no microRNA mimetizam a estabilidade por meio de modificações químicas, como oligonucleotídeos de ácido nucleico bloqueado (LNA) ou ácidos nucleicos peptídicos (PNA) podem prevenir a eliminação rápida dessas pequenas moléculas por RNases. [77] [74] A entrega de antagomirs e mimetizadores de microRNA nas células ao encerrar essas moléculas em nanopartículas de lipossoma gerou interesse, no entanto, as estruturas dos lipossomas sofrem de suas próprias desvantagens que precisarão ser superadas para seu uso eficaz como mecanismo de entrega de drogas. [77] Essas desvantagens das nanopartículas de lipossoma incluem a absorção inespecífica pelas células e a indução de respostas imunes. [78] O papel que os microRNAs desempenham no desenvolvimento e metástase do câncer está sob muita investigação científica e ainda não foi demonstrado se mimetizadores de microRNAs ou antagomirs podem servir como tratamentos clínicos padrão para suprimir EMT ou microRNAs oncogênicos em cânceres. [74]

Semelhante à geração de células-tronco cancerosas, a EMT demonstrou gerar células progenitoras endócrinas a partir de ilhotas pancreáticas humanas. [79] Inicialmente, as células progenitoras derivadas de ilhotas humanas (hIPCs) foram propostas para serem melhores precursoras, uma vez que a progênie de células β nessas hIPCs herdam marcas epigenéticas que definem uma região promotora de insulina ativa. [80] No entanto, mais tarde, outro conjunto de experimentos sugeriu que células β marcadas se desdiferenciam em um fenótipo semelhante ao mesenquimal em vitro, mas falhou em proliferar, iniciando assim um debate em 2007. [81] [82] [83]

Uma vez que esses estudos em ilhotas humanas careciam de análise de rastreamento de linhagem, essas descobertas de células beta marcadas de forma irreversível em camundongos foram extrapoladas para ilhotas humanas. Assim, usando um sistema de rastreamento de linhagem genética e lentiviral duplo para marcar células β, foi demonstrado de forma convincente que células β de ilhotas humanas adultas sofrem EMT e proliferam em vitro. [84] [85] Além disso, esses achados foram confirmados em células produtoras de insulina pancreática fetal humana, e as células mesenquimais derivadas de ilhotas pancreáticas podem sofrer o reverso de EMT - MET - para gerar agregados de células semelhantes a ilhotas. [86] Assim, o conceito de geração de progenitores a partir de células produtoras de insulina por EMT ou geração de células-tronco cancerígenas durante a EMT no câncer pode ter potencial para terapia de reposição no diabetes e exigir drogas que visem a inibição da EMT no câncer. [86]


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A citólise ocorre quando uma célula se rompe devido a um desequilíbrio osmótico que fez com que o excesso de água se movesse para dentro da célula.

A citólise pode ser prevenida por vários mecanismos diferentes, incluindo o vacúolo contrátil que existe em alguns paramécios, que bombeiam água rapidamente para fora da célula. A citólise não ocorre em condições normais nas células vegetais porque as células vegetais têm uma parede celular forte que contém a pressão osmótica, ou pressão de turgor, que de outra forma causaria a ocorrência da citólise.

Oncólise é a destruição de células neoplásicas ou de um tumor.

O termo também é usado para se referir à redução de qualquer inchaço. [4]

A plasmólise é a contração das células dentro das plantas devido à perda de água por osmose. Em um ambiente hipertônico, a membrana celular se desprende da parede celular e o vacúolo entra em colapso. Essas células eventualmente murcham e morrem, a menos que o fluxo de água causado pela osmose possa interromper a contração da membrana celular. [5]

A hemoglobina dos eritrócitos libera radicais livres em resposta aos patógenos quando lisados ​​por eles. Isso pode causar danos aos patógenos. [6] [7]

A lise celular é usada em laboratórios para quebrar células abertas e purificar ou estudar melhor seu conteúdo. A lise no laboratório pode ser afetada por enzimas ou detergentes ou outros agentes caotrópicos. A ruptura mecânica das membranas celulares, como por congelamento e descongelamento repetidos, sonicação, pressão ou filtração, também pode ser referida como lise. Muitos experimentos de laboratório são sensíveis à escolha do mecanismo de lise, muitas vezes é desejável evitar forças mecânicas de cisalhamento que desnaturariam ou degradariam macromoléculas sensíveis, como proteínas e DNA, e diferentes tipos de detergentes podem produzir resultados diferentes. A solução não processada imediatamente após a lise, mas antes de quaisquer outras etapas de extração, é muitas vezes referida como um lisado bruto. [8] [9]

Por exemplo, a lise é usada em western e Southern blotting para analisar a composição de proteínas, lipídios e ácidos nucleicos específicos, individualmente ou como complexos. Dependendo do detergente usado, todas ou algumas membranas são lisadas. Por exemplo, se apenas a membrana celular for lisada, a centrifugação de gradiente pode ser usada para coletar certas organelas. A lise também é usada para purificação de proteínas, extração de DNA e extração de RNA. [8] [9]

Edição de lise química

Este método usa ruptura química. É a abordagem mais popular e simples. A lise química deteriora / solubiliza quimicamente as proteínas e lipídios presentes na membrana das células-alvo. [10]

Edição de lise acústica

Este método usa ondas ultrassônicas para gerar áreas de alta e baixa pressão que causam cavitação e, por sua vez, lise celular. Embora esse método geralmente saia limpo, ele deixa de ser econômico e consistente. [11]

Edição de lise mecânica

Este método usa penetração física para perfurar ou cortar uma membrana celular. [12]


Agradecimentos

Os autores agradecem aos drs. Sandra Healy e Sanjeev Gupta por suas sugestões e comentários sobre este manuscrito. O grupo de Fulda é apoiado por doações do Deutsche Forschungsgemeinschaft, Bundesministerium f & # x000fcr Bildung und Forschung, Deutsche Krebshilfe, UE (ApopTrain, APO-SYS), Wilhelm Sander Stiftung, Else-Kr & # x000f6ift-Fresenius-Fresenius Novartis Stiftung f & # x000fcr therapeutische Forschung e IAP6 / 18. A pesquisa em grupos Samali e Gorman é apoiada financeiramente pela Science Foundation Ireland sob o Grant nos. 09 / RFP / BMT2153, 09 / RFP / BIC2371 e 05 / IN3 / B851, bem como doações do Health Research Board of Ireland (HRA / 2009/59) e da campanha de câncer de mama.