Em formação

Por que você precisa calcular o fator de normalização da pista ao fazer a análise de dados de Western blot?

Por que você precisa calcular o fator de normalização da pista ao fazer a análise de dados de Western blot?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Estou aprendendo sobre quantificação de dados de western blot a partir de alguns recursos online. Eu li sobre métodos para normalizar os dados.

Eu vi em vários recursos, como este manual e este vídeo ao normalizar dados de Western blot, eles usam um fator de normalização de pista. Por exemplo, se estiver usando uma coloração de proteína total para normalizar a densidade integrada de suas bandas de proteína alvo, eles primeiro obtêm a densidade integrada de todas as pistas coradas com a coloração de proteína total. Em seguida, eles encontram a pista com o maior valor de densidade integrada. Para cada faixa, seu valor de densidade integrado é dividido pelo maior valor de densidade integrada - o valor resultante sendo o fator de normalização da faixa.

Então, ao fazer a normalização, para cada pista, a densidade integrada da banda de proteína de interesse é dividida pelo fator de normalização da pista.

No entanto, não tenho certeza de qual é o raciocínio por trás do cálculo do fator de normalização da pista. Por que você não pode simplesmente dividir a densidade integrada de sua banda de proteína de interesse pela densidade integrada da região de coloração de proteína total para cada faixa?

Todos os insights são apreciados.


Melhores práticas para detecção de Western Blot de eventos de fosforilação

Nosso novo guia de bolso contém um conjunto de etapas para ajudá-lo com seu projeto experimental.

Inscreva-se em nossos e-mails

Seja o primeiro a saber quando lançarmos novos produtos e recursos para ajudá-lo a obter mais resultados no laboratório.


Como a concentração de gel afeta a mobilidade relativa

Então, o que acontece se você quiser caracterizar todas as proteínas em uma amostra? . execute mais de um gel, é claro! Um gel com baixa densidade resolverá os polipeptídeos maiores enquanto corta os mais leves, e um de maior densidade revelará os polipeptídeos menores, enquanto comprime e possivelmente distorce os maiores.

Aqui estão alguns exemplos do efeito da concentração de acrilamida na mobilidade relativa. Os padrões de peso molecular são identificados por um número. Uma amostra típica de proteína de membrana de eritrócitos também é apresentada, com a proteína da banda 3 marcada como referência.

Padrão 1 = miosina (205.000) padrão. 2 = beta-galactosidase (116.000) std. 3 = fosforilase B (92.000) std. 4 = albumina de soro bovino (66.000) std. 5 = albumina de ovo (45.000) std. 6 = anidrase carbônica (29.000).

Nos géis de 6 a 10%, há um dupleto escuro distinto no topo da linha da membrana. Observe que no gel de 12% o dupleto está preso e aparece como uma banda. Pode-se estimar MW da banda 3 a partir dos primeiros cinco géis, embora a melhor estimativa venha de 6%, que produziu a maior separação entre os padrões em ambos os lados da banda 3. O gel de 12% não resolveu bem as bandas acima do quarto padrão (albumina sérica, 66.000). A análise deve ser confinada à parte do gel abaixo de 66.000 ou ainda mais baixa se a mesma amostra foi executada em um gel de densidade mais baixa.

Freqüentemente, os alunos analisam a parte superior de um gel de acrilamida de alta densidade que se sobrepõe a parte de um gel de densidade inferior. Essa prática sugere que o aluno perdeu o ponto da análise e / ou não entendeu as limitações do método. Interprete apenas a parte do gel mais denso que não se sobrepõe ao outro. Em outras palavras, use géis de alta densidade para estudar proteínas (ou partes de proteínas) de peso molecular relativamente baixo e géis de densidade mais baixa para resolver proteínas de peso molecular mais alto.

Não se esqueça de que polipeptídeos diferentes podem ter massas moleculares semelhantes ou até idênticas. Uma banda em um gel pode, portanto, consistir em um ou mais polipeptídeos. É mais provável que isso aconteça na parte superior de um gel, especialmente em géis de densidade mais alta.


Por que você precisa calcular o fator de normalização da pista ao fazer a análise de dados de Western blot? - Biologia

Olá, estou tentando fazer uma macro funcionar em Fiji e descobri isso na postagem do fórum da ImageJ. Esta macro move várias ROIs simultaneamente.

No gif onde o usuário mostra a macro funcionando, eles usam uma ferramenta & # x27M & # x27 para mover as ROIs, não a ferramenta retângulo / polígono que é o que eu normalmente uso para mover uma ROI.

Não tenho certeza do que é a ferramenta & # x27M & # x27. Procurei no site da ImageJ, mas não há informações sobre isso. Eu queria saber se alguém sabe o que é? Todos os insights são apreciados.

Parece ser & quotMenu Tools & quot parte de & quotTool Macros & quot no ImageJ. Dê uma olhada aqui em 6.4 para uma captura de tela do botão & quotM & quot.

ImageJ developers tem uma seleção chamada & quotMenu Tools & quot em & quotTools Macros & quot. Do site.

Você pode usar a função newMenu para adicionar menus à barra de ferramentas. A macro Menus da barra de ferramentas demonstra como fazer isso. Você também pode personalizar o menu contextual que aparece quando você clica com o botão direito em uma imagem. A macro CustomPopupMenu demonstra como fazer isso. & Quot

Obtendo um erro de variável indefinida ao tentar executar uma macro em Fiji

Olá, sou novo nas macros Fiji / ImageJ e quero usar uma macro em Fiji. O código da macro é desta fonte.

Baixei o código e salvei-o como um arquivo de texto. Em seguida, executei a macro indo para Plug-ins & gt Macros & gt Executar. A versão do ImageJ que estou usando é 1.53j.

No entanto, quando executo a macro, recebo o seguinte erro:

Parece que não está entrando no loop while por algum motivo. Vamos tentar isso. Antes disso, adicione uma nova linha e escreva este código

E me diga o que acontecer

Obrigado pela sua resposta! Eu adicionei as linhas de código logo antes do loop while. Quando executo a macro, não recebo o erro. Mas quando eu seleciono 2 ROIs retangulares no ROI Manager e tento movê-las (clicando em uma ROI usando a ferramenta de retângulo), nada acontece.

Eu vi na documentação da macro ImageJ que a função Roi.getBounds retorna o local e o tamanho do retângulo delimitador de seleção & # x27s. Isso significa que, quando tenho duas ROIs retangulares diferentes selecionadas, a função getBounds retornará o tamanho / localização do retângulo que envolve essas duas ROIs?

eu serei honesto com você. Não tenho ideia do que ele & # x27s não está movendo lol. Eu acho que você poderia simplesmente colocar isso em um loop while para que continue indefinidamente até que você pressione esc ou faça algo e deve ficar bem.

Independentemente disso, eu fiz uma macro que faz semelhante e já está em um loop contínuo e funciona mesmo se você selecionar ou ROIs. Portanto, é basicamente o mesmo. Basta selecionar os ROIs no gerenciador, executar a macro, mover os ROIs. Você também pode selecionar ROIs diferentes sem executar a macro novamente. Pressione espaço ou ESC enquanto clica no rois para interromper a macro.

Me diga se este funciona rs

Experimentei a sua versão e funciona.

Muito obrigado, eu realmente aprecio isso. :)

Ajuda na definição de limites para Análise de Colocalização usando o plugin JACoP em ImageJ

Olá, estou analisando a co-localização entre dois canais em algumas imagens de microscopia de fluorescência. Estou usando o plug-in JACoP no ImageJ para calcular o coeficiente Pearson & # x27s.

Quando adiciono os dois canais de imagem que desejo analisar a colocalização entre eles, o plug-in JACoP calcula automaticamente o limite para cada imagem:

No entanto, não tenho certeza de qual é o melhor método para definir os limites das imagens ao calcular o coeficiente de Pearson & # x27s. Acho que definir manualmente o limite de cada imagem é subjetivo e os valores de limite usados ​​para uma imagem podem não funcionar bem para outra.

Alguém tem algum conselho sobre algum método reproduzível que pode ser usado para definir os limites das imagens ao fazer a análise de colocalização usando o coeficiente de Pearson & # x27s? Todos os insights são apreciados.

normalmente, a média + 1StDev (ou 2SD e até 3SD em alguns casos) é usada. Você pode obter essa informação para cada imagem do histograma, basta usar o mesmo SD para cada canal (também conhecido como fluorescência)

Obrigado por sua resposta. Seria possível saber por meio de quais comandos você pode obter o histograma dos valores de intensidade de pixel?

Pergunta sobre a saída para Pearson & # x27s Coefficient usando o plugin JACoP em Fiji

Olá, estou calculando a co-localização entre dois canais em algumas imagens de microscopia de fluorescência. Estou usando o plug-in JACoP para calcular o coeficiente de Pearson & # x27s.

Para definir o limite de minhas imagens, estou usando o limite automático Costes & # x27.

Tenho os seguintes parâmetros para JACoP:

No entanto, no Log, estou obtendo duas saídas para o coeficiente de Pearson & # x27s:

Não tenho certeza de qual saída para o coeficiente de Pearson e # x27s devo usar. O primeiro valor (destacado em preto) é o correto a ser usado? Todos os insights são apreciados.

De acordo com o artigo, o segundo pode ser o PC inicial.

Abordagem de Costes. Recentemente, um algoritmo de significância estatística baseado no PC foi introduzido (Costes et al., 2004). A abordagem de Costes é realizada em duas etapas subsequentes. Em primeiro lugar, a correlação em diferentes regiões do histograma bidimensional é levada em consideração para estimar um limite automático e o PC deste par de imagens limite é calculado

Então você marcou 2 análises. Pearson e costes. Portanto, há 2 resultados. Um para cada análise. É assim que eu vejo. Então eu acho que você está certo

Se eu usar o método Costes & # x27 para definir o limite para minhas 2 imagens, o coeficiente de Pearson & # x27s da análise de Costes seria o correto a ser usado.

No entanto, quando abro o JACoP e seleciono as 2 imagens que desejo calcular o coeficiente de Pearson & # x27s (sem usar o limite de Costes) na seção Parâmetros, já existem valores de limite calculados automaticamente pelo plugin.

Por exemplo. na seção de parâmetros na imagem acima, o limite para a imagem A é 607 e para a imagem B é 1845. No registro, os limites Costes & # x27 foram 77 para a imagem A e 3 para a imagem B.

Seria possível saber qual método / algoritmo o plug-in JACoP usa para calcular o primeiro conjunto de limites (607 e 1845) que suponho que sejam usados ​​na análise de coeficiente de Pearson & # x27s? Todos os insights são apreciados.

Ou para Coste, leia o artigo da Coste que eles citam.

Também pode haver 2 valores diferentes. Um é o valor limite da imagem real usado para definir o que é um objeto ponto ot e, a seguir, outro para a fórmula.

Pergunta sobre a subtração de fundo em um Western blot quando o anticorpo primário detecta ambas as isoformas de uma proteína de interesse.

Olá, estou fazendo uma análise de imagem do Western blot. A região que estou considerando como plano de fundo é uma região retangular (com a mesma área do retângulo que envolve a banda da proteína) logo acima da banda da proteína de interesse.

Eu sei que ao subtrair o fundo, o método que você usa deve ser consistente em todas as manchas analisadas.

No entanto, para uma proteína de interesse, o anticorpo primário detecta ambas as isoformas da proteína.

O peso molecular de uma isoforma é 47kDa enquanto a outra é 51kDa, então as bandas de proteínas são muito próximas umas das outras.

Para a isoforma 47kDa, não posso usar a região logo acima das bandas como pano de fundo, pois as bandas de proteína para a isoforma 51kDa estão lá.

Nesse cenário, estaria tudo bem usar a região logo abaixo das bandas de 47 kDa como plano de fundo (e aplicar isso de forma consistente em todos os blots onde eu testei essa proteína)? Todos os insights são apreciados.

Por que você não pode obter uma quantificação precisa de imagens de Western blot com fundo alto?

Olá, estou analisando imagens de Western blot e algumas delas têm um fundo irregular / manchado na membrana. Ouvi dizer que você não pode obter uma quantificação precisa de seus níveis de proteína alvo a partir de imagens de Western blot em que o fundo é irregular.

Estou subtraindo o fundo desenhando um retângulo (que é a mesma área do retângulo delineando minha banda de proteína de interesse) no topo de cada faixa e subtraio a densidade integrada desse retângulo de fundo da densidade integrada de minha banda de proteína.

Eu estava me perguntando por que mesmo depois de subtrair o fundo a quantificação não será precisa?

Uma vez que não subtrair o fundo de cada banda de proteína corrige quaisquer diferenças nas intensidades de banda entre as pistas devido ao fundo irregular? Todos os insights são apreciados.

Não sou um especialista, mas se você tiver um fundo que não é consistente (ou seja, manchado / irregular), remover o fundo seria mais difícil porque haveria confusão sobre o que seria considerado fundo.

IDK é apenas uma ideia. Algumas pessoas mais espertas devem chegar a qualquer minuto. haha

Espero que meu comentário ajude sua postagem a ganhar um pouco de força, bc eu & # x27d gostaria de saber a resposta.

Ao medir a área dos clusters no ImageJ usando a função Analyze Particles, como você pode confirmar se a área dos clusters está em mícrons ao quadrado?

Olá, sou relativamente novo no ImageJ e estou analisando imagens de células CHO. Estou contando o número de aglomerados de proteínas nas células usando a função & # x27Analyze Particles & # x27. Quero obter a área dos meus clusters em mícrons ao quadrado (μm ^ 2). Eu sei que a função & # x27Analyze Particles & # x27 exibe a área de cada cluster nos resultados. No entanto, não tenho certeza de como confirmar se a área de meus clusters está em mícrons ao quadrado.

Não tenho certeza de como saber se as dimensões da minha imagem estão em mícrons ou pixels. Tenho as seguintes informações exibidas no topo da minha imagem.

E estas são minhas configurações de & # x27Set Scale & # x27:

Eu queria saber, dadas as informações acima, seria correto da minha parte assumir que as unidades de área medidas pelo ImageJ estão em mícrons ao quadrado? Todos os insights são apreciados.

vá para Image & gtproperties e veja o que está definido. se houver uma unidade de largura de pixel em mícrons, ela estará em mícrons.

Quanto à análise, tenho quase certeza de que está em qualquer unidade que esteja nas propriedades. para testá-lo, basta fazer isso, encontrar a área e ver se faz sentido aproximadamente. por exemplo, encontre um pequeno cluster e veja quantos pixels existem em comparação com a área. Ou limite-o para que haja um pequeno ponto e veja o que é. se houver 10 pixels e a área indicar 1, então é em mícrons, caso contrário, seus pixels.

deixe-me saber se isso ajuda!

Obrigado por sua resposta! :) Verifiquei a unidade de largura de pixel nas propriedades e está em mícrons.

Aumentei a imagem muito perto e fiz uma seleção quadrada onde há apenas um pixel dentro. Eu medi a área e ela & # x27s 0,011. Se as unidades estiverem em pixels, estou assumindo que a área da seleção seria 1 (pixel ao quadrado).

Você acha que seria correto da minha parte dizer que o ImageJ está medindo a área em mícrons ao quadrado dada a área que obtive?

Sim, isso deve ser mícrons ao quadrado. Mas tente fazer um retângulo usando um comando macro. Esta é a forma geral:

Aqui & # x27s um na origem, 1000 x 1000 pixels:

Em seguida, meça a área a ser verificada.

Obrigado :) Executei o comando macro, obtive uma área 10622.694, portanto, & # x27s não em pixels (já que se a área fosse em pixels seria 1000.000).

Ao subtrair o fundo de uma imagem Western blot, é melhor usar uma única região ou várias regiões?

Olá, estou trabalhando na análise de imagens de Western blot e tentando refinar meu método de subtrair o fundo de minhas bandas de proteína alvo em meu blot. A maneira que estou subtraindo o fundo é desenhar um retângulo (que é a mesma área do retângulo delineando minha banda de proteína de interesse) no topo de cada pista e subtrair a densidade integrada deste retângulo de fundo da densidade integrada da minha banda de proteína.

No entanto, li online que algumas pessoas selecionam uma pista vazia onde nenhuma proteína foi carregada e delineiam uma região retangular nessa pista. Esta região retangular é considerada como plano de fundo e é usada para todas as bandas de proteínas.

Estou me perguntando se esse método é melhor do que criar um retângulo de fundo para cada pista. A razão pela qual estou fazendo um retângulo de fundo para cada pista é porque alguns dos meus borrões têm fundo manchado / irregular, devido a ligações não específicas e bolhas de ar. Mas muitas das minhas manchas têm um fundo uniforme.


O recipiente de resíduos não deve ser forrado com plástico, pois um forro pode causar uma batida devido ao acúmulo de pontas mais alto do que o esperado. O recipiente de resíduos pode ser limpo com uma solução de etanol a 70%.

Devido às observações normais de trânsito, as placas preparatórias armazenadas em uma orientação incorreta por alguns dias não terão um impacto significativo. No entanto, quanto mais tempo as placas permanecerem em uma orientação incorreta aumentará o risco de falha do teste. É altamente recomendável que as placas de preparação sejam armazenadas em sua orientação adequada o mais rápido possível. Sempre verifique se há vazamentos antes de usar.


Visualizando

Se placas fluorescentes são usadas, vários compostos podem ser vistos iluminando a placa com UV de ondas curtas. A têmpera causa manchas escuras na superfície da placa. Essas manchas escuras devem ser circuladas com um lápis. Para compostos que não são UV ativos, podem ser usados ​​vários corantes químicos. Estes podem ser muito gerais ou podem ser específicos para uma determinada molécula ou grupo funcional.

O iodo está entre as manchas mais comuns. As placas são colocadas em uma jarra contendo cristais de iodo, ou cobertas em sílica gel com iodo disperso, por aproximadamente um minuto. A maioria dos compostos orgânicos ficará temporariamente manchada de marrom. Alguns corantes de uso geral populares são permanganato, molibdato de amônio cérico (CAM) e p-anisaldeído. Estes podem ser mantidos em frascos nos quais as placas são mergulhadas ou em frascos de spray.

Para desenvolver uma placa com permanganato, borrife ou mergulhe a placa e aqueça-a com uma pistola de ar quente. Segure a placa com a face voltada para cima 10 a 20 cm acima da pistola de calor até que toda a água evapore. Em seguida, mova a placa 5 a 10 cm acima da pistola de calor e aqueça até que apareçam manchas brancas / amarelas / marrons. O superaquecimento deixará toda a placa marrom, obscurecendo as manchas. Se as placas de vidro forem usadas, geralmente é mais fácil ver as manchas através do revestimento porque é mais difícil superaquecer. As placas coradas com CAM e p-anisaldeído são desenvolvidas de forma semelhante. Superaquecer placas manchadas com CAM torna tudo azul.


Aglutinação de bactérias e vírus

O uso de testes de aglutinação para identificar bactérias estreptocócicas foi desenvolvido na década de 1920 por Rebecca Lancefield trabalhando com seus colegas A.R. Dochez e Oswald Avery. [1] Ela usou anticorpos para identificar Proteína M, um fator de virulência nos estreptococos que é necessário para a capacidade da bactéria de causar infecção na garganta. A produção de anticorpos contra a proteína M é crucial na montagem de uma resposta protetora contra a bactéria.

Lancefield usou anti-soros para mostrar que diferentes cepas da mesma espécie de estreptococos expressam diferentes versões da proteína M, o que explica por que as crianças podem contrair faringite estreptocócica repetidamente. Lancefield classificou os estreptococos beta-hemolíticos em muitos grupos com base nas diferenças antigênicas em polissacarídeos específicos de grupo localizados na parede celular bacteriana. As cepas são chamadas serovares porque eles são diferenciados usando anti-soros. Identificar os sorovares presentes em um surto de doença é importante porque alguns sorovares podem causar doenças mais graves do que outros.

Figura 2. Anticorpos contra seis sorovares diferentes de estreptococos do Grupo A foram anexados a esferas de látex. Cada uma das seis preparações de anticorpos foi misturada com bactérias isoladas de um paciente. Os pequenos grumos vistos no poço 4 são indicativos de aglutinação, que está ausente em todos os outros poços. Isso indica que o sorovar associado ao poço 4 está presente na amostra do paciente. (crédito: modificação do trabalho pela American Society for Microbiology)

O método desenvolvido por Lancefield é um ensaio de aglutinação direta, uma vez que as próprias células bacterianas se aglutinam. Uma estratégia semelhante é mais comumente usada hoje ao identificar serovares de bactérias e vírus, no entanto, para melhorar a visualização da aglutinação, os anticorpos podem ser anexados a contas de látex. Esta técnica é chamada de ensaio de aglutinação indireta (ou ensaio de fixação de látex), porque a aglutinação dos grânulos é um marcador para a ligação do anticorpo a algum outro antígeno (Figura 2). Os ensaios indiretos podem ser usados ​​para detectar a presença de anticorpos ou antígenos específicos.

Para identificar anticorpos no soro de um paciente, o antígeno de interesse é anexado a grânulos de látex. Quando misturados com o soro do paciente, os anticorpos se ligam ao antígeno, reticulando os grânulos de látex e fazendo com que os grânulos aglutinem indiretamente, o que indica a presença do anticorpo (Figura 3). Esta técnica é mais frequentemente usada ao procurar IgM anticorpos, porque sua estrutura fornece reticulação máxima. Um exemplo amplamente utilizado deste ensaio é um teste para fator reumatóide (RF) para confirmar o diagnóstico de artrite reumatóide. RF é, na verdade, a presença de anticorpos IgM que se ligam ao do próprio paciente IgG. RF aglutinará esferas de látex revestidas com IgG.

No teste reverso, antígenos solúveis podem ser detectados no soro de um paciente anexando anticorpos específicos (comumente mAbs) aos grânulos de látex e misturando este complexo com o soro (Figura 3).

Figura 3. (a) Grânulos de látex revestidos com um antígeno irão aglutinar quando misturados com o soro do paciente se o soro contiver anticorpos IgM contra o antígeno. (b) Grânulos de látex revestidos com anticorpos irão aglutinar quando misturados com o soro do paciente se o soro contiver antígenos específicos para os anticorpos.

Os testes de aglutinação são amplamente utilizados em países subdesenvolvidos, que podem carecer de instalações adequadas para o cultivo de bactérias. Por exemplo, o Teste Widal, usado para o diagnóstico de febre tifóide, procura aglutinação de Salmonella enterica subespécies tifo em soros de pacientes. O teste de Widal é rápido, barato e útil para monitorar a extensão de um surto, no entanto, não é tão preciso quanto os testes que envolvem a cultura da bactéria. O teste de Widal freqüentemente produz falsos positivos em pacientes com infecções anteriores com outras subespécies de Salmonella, bem como falsos negativos em pacientes com hiperproteinemia ou deficiências imunológicas.

Além disso, os testes de aglutinação são limitados pelo fato de que os pacientes geralmente não produzem níveis detectáveis ​​de anticorpos durante a primeira semana (ou mais) de uma infecção. Diz-se que um paciente sofreu seroconversão quando os níveis de anticorpos atingem o limite de detecção. Normalmente, a soroconversão coincide com o início dos sinais e sintomas da doença. No entanto, em uma infecção por HIV, por exemplo, geralmente leva 3 semanas para que a soroconversão ocorra e, em alguns casos, pode demorar muito mais.

Semelhante às técnicas para o teste do anel de precipitina e ensaios de placa, é rotina preparar diluições seriadas de duas vezes do soro do paciente e determinar o título de anticorpo aglutinante presente. Uma vez que os níveis de anticorpos mudam ao longo do tempo nas respostas imunes primária e secundária, ao verificar as amostras ao longo do tempo, as alterações no título de anticorpos podem ser detectadas. Por exemplo, uma comparação do título durante o fase aguda de uma infecção versus o título do fase de convalescença irá distinguir se uma infecção é atual ou ocorreu no passado. Também é possível monitorar o quão bem o sistema imunológico do paciente está respondendo ao patógeno.

Assista a este vídeo que demonstra reações de aglutinação com grânulos de látex.

Pense nisso

  • Como a aglutinação é usada para distinguir os serovares uns dos outros?
  • Em um ensaio de esferas de látex para testar os anticorpos em um paciente e soro # 8217s, com o que as esferas são revestidas?
  • O que aconteceu quando um paciente foi submetido a soroconversão?

Hemaglutinação

Aglutinação de glóbulos vermelhos é chamada hemaglutinação. Um ensaio comum que usa hemaglutinação é o teste direto de Coombs, também chamado de teste de globulina anti-humana direta (DAT), que geralmente procura anticorpos não aglutinantes. O teste também pode detectar complemento ligado aos glóbulos vermelhos.

O teste de Coombs é frequentemente empregado quando um recém-nascido tem icterícia, amarelecimento da pele causado por altas concentrações de bilirrubina no sangue, um produto da degradação da hemoglobina no sangue. O teste de Coombs é usado para determinar se os glóbulos vermelhos da criança foram ligados pelos anticorpos da mãe. Esses anticorpos ativariam o complemento, levando à lise dos glóbulos vermelhos e à icterícia subsequente. Outras condições que podem causar testes de Coombs diretos positivos incluem reações hemolíticas de transfusão, anemia hemolítica autoimune, mononucleose infecciosa (causada por Vírus de Epstein Barr), sífilis, e Mycoplasma pneumonia. Um teste de Coombs direto positivo também pode ser visto em alguns tipos de câncer e como uma reação alérgica a alguns medicamentos (por exemplo, penicilina).

Os anticorpos ligados aos glóbulos vermelhos nessas condições são mais frequentemente IgGe devido à orientação dos locais de ligação ao antígeno em IgG e ao tamanho comparativamente grande de um glóbulo vermelho, é improvável que ocorra qualquer aglutinação visível. No entanto, a presença de IgG ligada aos glóbulos vermelhos pode ser detectada adicionando Reagente de Coombs, um anti-soro contendo anticorpos IgG anti-humanos (que podem ser combinados com anti-complemento) (Figura 4). O reagente de Coombs liga o IgG anexado aos glóbulos vermelhos vizinhos e, assim, promove a aglutinação.

Há também um teste indireto de Coombs Conhecido como teste de antiglobulina indireto (IAT). Isso rastreia um indivíduo em busca de anticorpos contra antígenos de glóbulos vermelhos (exceto os antígenos A e B) que não estão ligados no soro de um paciente (Figura 4). O IAT pode ser usado para rastrear mulheres grávidas quanto a anticorpos que podem causar doença hemolítica do recém-nascido. Também pode ser usado antes de administrar transfusões de sangue. Mais detalhes sobre como o IAT é realizado são discutidos abaixo.

Figura 4. Clique para ampliar a imagem. As etapas nos testes de Coombs diretos e indiretos são mostradas na ilustração.

Os anticorpos que se ligam aos glóbulos vermelhos não são a única causa da hemaglutinação. Alguns vírus também se ligam aos glóbulos vermelhos, e essa ligação pode causar aglutinação quando os vírus reticulam os glóbulos vermelhos. Por exemplo, vírus influenza têm dois tipos diferentes de picos virais chamados neuraminidase (N) e hemaglutinina (H), este último nomeado por sua capacidade de aglutinar os glóbulos vermelhos (veja Vírus). Assim, podemos usar glóbulos vermelhos para detectar a presença do vírus da gripe por ensaios de hemaglutinação direta (HA), em que o vírus causa aglutinação visível dos glóbulos vermelhos. o caxumba e rubéola vírus também podem ser detectados usando HA.

Mais frequentemente, um diluição em série ensaio de aglutinação viral é usado para medir o título ou estimar a quantidade de vírus produzida em cultura de células ou para a produção de vacinas. Um título viral pode ser determinado usando um HA direto, fazendo uma diluição em série da amostra contendo o vírus, começando com uma alta concentração de amostra que é então diluída em uma série de poços. A maior diluição que produz aglutinação visível é o título. O ensaio é realizado em uma placa de microtitulação com cavidades de fundo redondo ou em V. Na presença de vírus aglutinantes, os glóbulos vermelhos e o vírus se aglomeram e produzem uma camada difusa no fundo do poço. Na ausência de vírus, os glóbulos vermelhos rolam ou sedimentam para o fundo do poço e formam um grânulo denso, razão pela qual poços de fundo plano não podem ser usados ​​(Figura 5).

Figura 5. Uma suspensão viral é misturada com uma quantidade padronizada de glóbulos vermelhos. Nenhuma aglutinação de glóbulos vermelhos é visível quando o vírus está ausente e as células formam um pellet compacto no fundo do poço. Na presença de vírus, um precipitado rosa difuso se forma no poço. (crédito inferior: modificação do trabalho pela American Society for Microbiology)

Uma modificação do ensaio HA pode ser usada para determinar o título de anticorpos antivirais. A presença desses anticorpos no soro de um paciente ou em um anti-soro produzido em laboratório neutralizará o vírus e impedirá que ele aglutine as hemácias, tornando isso um ensaio de inibição de hemaglutinação viral (HIA). Neste ensaio, o soro do paciente é misturado com uma quantidade padronizada de vírus. Após uma curta incubação, uma quantidade padronizada de glóbulos vermelhos é adicionada e a hemaglutinação é observada. O título do soro do paciente é a maior diluição que bloqueia a aglutinação (Figura 6).

Figura 6. Nesta HIA, o soro contendo anticorpos para o influenzavírus foi submetido a diluições seriadas de duas vezes em uma placa de microtitulação. Os glóbulos vermelhos foram então adicionados aos poços. A aglutinação ocorreu apenas nos poços onde os anticorpos estavam muito diluídos para neutralizar o vírus. A concentração mais alta na qual ocorre aglutinação é o título dos anticorpos no soro do paciente. No caso deste teste, a Amostra A mostra um título de 128 e a Amostra C mostra um título de 64. (crédito: modificação do trabalho de Evan Burkala)

Pense nisso

  • Qual é o mecanismo pelo qual os vírus são detectados em um ensaio de hemaglutinação?
  • Qual resultado de hemaglutinação nos diz o título do vírus em uma amostra?

Animais no Laboratório

Muito do que sabemos hoje sobre o sistema imunológico humano foi aprendido por meio de pesquisas conduzidas usando animais - principalmente mamíferos - como modelos. Além da pesquisa, os mamíferos também são usados ​​para a produção da maioria dos anticorpos e outros componentes do sistema imunológico necessários para o imunodiagnóstico. Vacinas, diagnósticos, terapias e medicina translacional em geral foram desenvolvidos por meio de pesquisas com modelos animais.

Considere alguns dos usos comuns de animais de laboratório para a produção de componentes do sistema imunológico. As cobaias são usadas como fonte de complemento, e os camundongos são a principal fonte de células para a produção de mAbs. Esses mAbs podem ser usados ​​em pesquisas e para fins terapêuticos. Os anti-soros são criados em uma variedade de espécies, incluindo cavalos, ovelhas, cabras e coelhos. Ao produzir um anti-soro, o animal geralmente será injetado pelo menos duas vezes, e adjuvantes podem ser usados ​​para aumentar a resposta do anticorpo. Os animais maiores usados ​​para fazer anti-soros terão o sangue coletado repetidamente por longos períodos de tempo, com poucos danos aos animais, mas esse não é geralmente o caso dos coelhos. Embora possamos obter alguns mililitros de sangue das veias das orelhas de coelhos, geralmente precisamos de volumes maiores, o que resulta na morte dos animais.

Também usamos animais para o estudo de doenças. A única maneira de crescer Treponema pallidum pois o estudo da sífilis é em animais vivos. Muitos vírus podem ser cultivados em cultura de células, mas o crescimento em cultura de células nos diz muito pouco sobre como o sistema imunológico responderá ao vírus. Ao trabalhar em uma doença recém-descoberta, ainda empregamos os postulados de Koch, que exigem causar doenças em animais de laboratório usando patógenos de cultura pura como uma etapa crucial para provar que um determinado microrganismo é a causa de uma doença. Estudar a proliferação de bactérias e vírus em hospedeiros animais e como o sistema imunológico do hospedeiro responde, tem sido fundamental para a pesquisa microbiológica por mais de 100 anos.

Embora a prática de usar animais de laboratório seja essencial para pesquisas científicas e diagnósticos médicos, muitas pessoas se opõem fortemente à exploração de animais para benefício humano. Esse argumento ético não é novo - na verdade, uma das filhas de Charles Darwin era uma antivivisseccionista ativa (vivissecção é a prática de cortar ou dissecar um animal vivo para estudá-lo). A maioria dos cientistas reconhece que deve haver limites para a extensão em que os animais podem ser explorados para fins de pesquisa. Considerações éticas levaram o National Institutes of Health (NIH) a desenvolver regulamentos rígidos sobre os tipos de pesquisa que podem ser realizados. Esses regulamentos também incluem diretrizes para o tratamento humano de animais de laboratório, estabelecendo padrões para seu alojamento, cuidado e eutanásia. The NIH document “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” makes it clear that the use of animals in research is a privilege granted by society to researchers.

The NIH guidelines are based on the principle of the three R’s: replace, refine, and reduce. Researchers should strive to substituir animal models with nonliving models, substituir vertebrates with invertebrates whenever possible, or use computer-models when applicable. Eles deviam refine husbandry and experimental procedures to reduce pain and suffering, and use experimental designs and procedures that reduzir the number of animals needed to obtain the desired information. To obtain funding, researchers must satisfy NIH reviewers that the research justifies the use of animals and that their use is in accordance with the guidelines.

At the local level, any facility that uses animals and receives federal funding must have an Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) that ensures that the NIH guidelines are being followed. The IACUC must include researchers, administrators, a veterinarian, and at least one person with no ties to the institution, that is, a concerned citizen. This committee also performs inspections of laboratories and protocols. For research involving human subjects, an Institutional Review Board (IRB) ensures that proper guidelines are followed.


Detection of Alkaline Phosphatase by Time-Resolved Fluorescence

2 DNA Dot Blot Hybridization Assay Protocol

A dot blot DNA hybridization assay can be performed on nylon membranes in a manner similar to that described for Southern blotting above, omitting the Southern transfer procedure. All solution volumes should be scaled as described previously, except for sample DNA. Typical results of a dot blot analysis are presented in Fig. 5 .

Fig. 5. Dot blot Traseiro Ill-digested pBR322 DNA. Samples contain (from left) 250, 125, 63, 31, 16, 8, 4, 2, 1,0 pg pBR322. REALL-M substrate was incubated for 2 hr.

Prepare dilutions of sample DNA in DNA dilution buffer. Denature the sample at 100 °C for 10 min and place on ice. Spot samples in 2–5 µl volumes on Nytran nylon membrane (0.45 μm) and allow to dry. Irradiate the membrane with 254 nm UV light for 3 min or alternately place in a vacuum oven at 80 °C for 1 to 2 hr. 2–5.

These are performed exactly as described for Southern blot protocol.


Purpose and function of blocking steps

The membrane supports used in western blotting have a high affinity for proteins. Therefore, after the transfer of the proteins from the gel, it is important to block the remaining surface of the membrane to prevent nonspecific binding of the detection antibodies during subsequent steps. A variety of blocking buffers ranging from milk or normal serum to highly purified proteins have been used to block free sites on a membrane. The blocking buffer should improve the sensitivity of the assay by reducing background interference and improving the signal-to-noise ratio. The ideal blocking buffer will bind to all potential sites of nonspecific interaction, eliminating background altogether without altering or obscuring the epitope for antibody binding.

The proper choice of blocker for a given blot depends on the antigen itself and on the type of detection label used. For example, in applications where AP conjugates are used, a blocking buffer in TBS should be selected because PBS interferes with alkaline phosphatase. For true optimization of the blocking step for a particular immunoassay, empirical testing is essential. Many factors, including various protein-protein interactions unique to a given set of immunoassay reagents, can influence nonspecific binding. The most important parameter when selecting a blocker is the signal-to-noise ratio, measured as the signal obtained with a sample containing the target analyte, as compared to that obtained with a sample without the target analyte. Using inadequate amounts of blocker will result in excessive background staining and a reduced signal-to-noise ratio. Using excessive concentrations of blocker may mask antibody-antigen interactions or inhibit the marker enzyme, again causing a reduction of the signal-to-noise ratio. When developing any new immunoassay, it is important to test several different blockers for the highest signal-to-noise ratio in the assay. No single blocking agent is ideal for every occasion since each antibody-antigen pair has unique characteristics.

Protein Detection Technical Handbook

This 84-page handbook provides a deep dive into the last step in the western blot workflow—protein detection. With a variety of detection techniques to choose from (chemiluminescence, fluorescence or chromogenic), you can select a technology to match your experimental requirements and the instruments you have available. Whether for quick visualization or precise quantitation, single-probe detection or multiplexing—Thermo Fisher Scientific offers a range of reagents and kits for western blot detection and subsequent analysis.


xCT, also called SLC7A11, is the light chain component of the cysteine/glutamate amino acid exchange transporter system Xc (1,2). System Xc is composed of two subunits, the light chain (xCT) and the heavy chain (CD98hc, SLC3A2) and functions by cellular uptake of cysteine in exchange for glutamate in a 1:1 ratio (1,2). The human xCT gene is located on chromosome 4q28.3 and is synthesized as a 12-pass transmembrane protein with both the N- and C-terminals located intracellularly (2, 3). xCT is a 501 amino acids (aa) protein with a theoretical molecular weight of 55.4 kDa (3, 4). xCT expression serves many functional purposes in cells including redox balance, ferroptosis, and chemotherapy or cancer drug resistance (1-3, 5-7). Import of cysteine by xCT plays a role in promoting oxidative stress response as cysteine is a precursor for glutathione synthesis (2, 3, 5-7). Glutathione is a cofactor for ROS-detoxifying enzymes, including glutathione peroxidase (GPX), which help defend from cellular ROS-induced damage (2, 3, 5-7). In addition to its antioxidant role, xCT also utilizes glutathione and GPX to inhibit ferroptosis, which is iron-dependent, non-apoptotic cell-death that occurs with overproduction of lipid hydroperoxides (1-3, 5-7). As cancer cells often experience high oxidative stress, it is understandable that xCT is overexpressed in a variety of cancer types, such as acute myeloid leukemia and breast cancer, and affects cancer growth, invasion, metastasis, and prognosis (1-3, 5-7). xCT expression has also been shown to play a role in glutathione-mediated drug resistance during cancer treatment (1,5,7). However, studies have shown that xCT knockdown results in increased tumor cell death, highlighting its suitability as a druggable target (1,5,7). Specifically, the xCT inhibitors Sulfasalazine, an approved anti-inflammatory drug, and Erastin, a small molecule inhibitor, are potential therapeutic modalities for treating a variety of cancers when used in combination with radiotherapy or immunotherapy (1-3, 5-7).

1. Liu, J., Xia, X., & Huang, P. (2020). xCT: A Critical Molecule That Links Cancer Metabolism to Redox Signaling. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2020.08.021

2. Koppula, P., Zhang, Y., Zhuang, L., & Gan, B. (2018). Amino acid transporter SLC7A11/xCT at the crossroads of regulating redox homeostasis and nutrient dependency of cancer. Cancer communications. https://doi.org/10.1186/s40880-018-0288-x

3. Lin, W., Wang, C., Liu, G., Bi, C., Wang, X., Zhou, Q., & Jin, H. (2020). SLC7A11/xCT in cancer: biological functions and therapeutic implications. American journal of cancer research.


Assista o vídeo: Como Fazer Gráficos de Barra com Desvio Padrão??? (Fevereiro 2023).