Em formação

Genes transcritos de RNA-polimerase III


Tenho uma lista de genes regulados diferencialmente de um experimento de alto rendimento do genoma humano. Gostaria de descobrir quais desses genes são transcritos por uma RNA polimerase III e quais deles (provavelmente a maioria) são transcritos por uma RNA polimerase II.

Baixei algumas faixas do Chip-Seq para a polimerase II e III e algumas categorias de GO que se aplicam à transcrição da RNA polimerase III.

Também tentei o repositório biomaRt para pesquisar essas categorias GO mencionadas, mas não consigo encontrar resultados substanciais. Por exemplo, tenho o gene RN7SL1 que segundo a literatura é transcrito por PolIII, mas não consigo encontrar nenhum repositório que também o diga.

Existe alguma (melhor) maneira de pesquisar este tipo de dados / anotações?

muito obrigado assa

PS. Não tenho certeza se encontrei as categorias GO corretas (por exemplo, GO: 0006383 - transcrição do promotor da RNA polimerase III). Então, há algum melhor?


GO é baseado em evidências experimentais; biomart é muito bom. GO: 0006383 parece ser a tag certa.

Se quiser usar os dados ChIPseq, você pode fazer o seguinte:

  • Mapeie as leituras do ChIPseq para o genoma. Se você já tem as trilhas, não precisa fazer o mapeamento. Você teria a posição das leituras no genoma.
  • Agora conte o número de leituras mapeadas para cada região gênica. Os limites do gene podem ser obtidos a partir de um arquivo GTF.
  • Opcional: normalize as leituras com o comprimento do gene.
  • Encontre a diferença entre o número de leituras de Pol-II e Pol-III para cada gene.

Ao fazer isso, você ainda não será capaz de dizer que "gene-x é transcrito por pol-III". Tudo que você pode dizer é que"pol-III se liga a essa região gênica". Se houver uma distribuição uniforme das leituras de ChIPseq ao longo do gene, você pode assumir que há uma transcrição ativa e que a polimerase não está apenas paralisada. Você também pode fazer um CLIP (Crosslink-Immunoprecipitation) de Pol-III seguido por um RNAseq. Isso permitirá que você encontre RNAs transcritos por pol-III (essa é uma maneira melhor do que ChIPseq, mas não acho que alguém tenha feito isso ainda; portanto, não há dados prontos).


Transcrição Eucariótica

Procariontes e eucariotos realizam fundamentalmente o mesmo processo de transcrição, com algumas diferenças importantes. A diferença mais importante entre a transcrição de procariotos e eucariotos é devido ao núcleo e organelas ligados à membrana do último. Com os genes ligados a um núcleo, a célula eucariótica deve ser capaz de transportar seu mRNA para o citoplasma e deve proteger seu mRNA da degradação antes de ser traduzido. Os eucariotos também empregam três polimerases diferentes, cada uma das quais transcreve um subconjunto diferente de genes. Os mRNAs eucarióticos são geralmente monogênico, o que significa que especificam uma única proteína.


Decodificando os princípios subjacentes à frequência de associação com nucléolos para RNA polimerase III & # x2013 genes transcritos em levedura de brotamento

A associação de genes transcritos de RNA polimerase III (Pol III) com nucléolos parece ser uma propriedade evolutivamente conservada da organização espacial de genomas eucarióticos. No entanto, estudos recentes da arquitetura cromossômica global em leveduras em brotamento desafiaram essa visão. Usamos imagens de células vivas para determinar as posições intranucleares de 13 genes transcritos de Pol III. A frequência de associação com nucléolo e periferia nuclear depende da distância genômica linear dos elementos de amarração - centrômeros ou telômeros. A liberação dos elementos de amarração por meio da desativação da ligação do centrômero ao corpo do pólo do fuso ou a alteração da posição dos arranjos de DNA ribossomal resultou na associação de genes transcritos de Pol III com nucléolos. Por outro lado, a inserção ectópica de um gene transcrito de Pol III na vizinhança de um centrômero impediu sua associação com o nucléolo. A transcrição dependente de Pol III era independente da posição intranuclear do gene, mas o recrutamento nucleolar de genes transcritos de Pol III exigia uma transcrição ativa. Concluímos que a associação de genes transcritos de Pol III com o nucléolo, quando permitida pela arquitetura cromossômica global, fornece pontos de ancoragem periféricos nucleolares e / ou nucleares que contribuem localmente para a organização cromossômica intranuclear.


Papel dos Fatores de Transcrição da RNA Polimerase III na Seleção de Locais de Integração pelo Dictyostelium Retrotransposão de repetição de terminal não longo TRE5-A

FIGO. 1 Configuração da armadilha TRE. o D. discoideum gene que codifica a sintase UMP (pyr5-6) está equipado com um íntron derivado do D. discoideum cbfA gene (2). A sequência do íntron é indicada como uma linha tracejada. A seta branca indica a orientação de transcrição do gene pol III inserido no íntron. Todos os genes pol III testados foram inseridos na armadilha como fragmentos EcoRI, esquematicamente exemplificados por D. discoideum Val UAC. Integrações de TRE5-A na armadilha foram isoladas por PCR usando pyr5-6 iniciadores específicos de exão conforme indicado. Os elementos promotores internos da caixa A e da caixa B do gene tRNA são indicados. Mutações introduzidas no consenso GTCnnnnG 53 TTC 56 RANYC 61 motivo B-box do D. discoideum O gene de tRNA Val UAC está indicado. FIGO. 2 Resultados dos ensaios de armadilha TRE. (A) Neste experimento 4 × 10 6 D. discoideum células carregando a armadilha vazia (-), um D. discoideum Gene Glu sup, ou um D. discoideum O gene Val UAC foi submetido à seleção em 5-FOA e uracila. (B) Comparação de frequências de direcionamento em um gene humano Met CAU e um D. discoideum Gene Val UAC. D. discoideum células (5 × 10 6 de cada cepa) foram usadas para a seleção de 5-FOA. Os números médios de clones de 10 placas de Petri são mostrados ± SD. FIGO. 3 5 ′ junções de integrações de novo de TRE5-A na armadilha de TRE. (A) Direcionamento do D. discoideum O gene tRNA Glu sup e o gene humano Met CAU. A sequência de destino é escrita na primeira linha em letras minúsculas. Setas verticais apontam para os locais de integração dos elementos TRE5-A, os números indicam a distância do TRE5-A ao primeiro nucleotídeo do gene tRNA direcionado. Os números entre parênteses indicam os primeiros nucleotídeos dos TRE5-As inseridos, que estão escritos em letras maiúsculas em negrito. Os nucleotídeos extras são encaixotados e as deleções do local alvo são indicadas como "Δ." (B) Integrações de TRE5-A a montante de uma caixa B isolada. A sequência de destino é mostrada em letras minúsculas. A sequência sublinhada de 26 pb representa a duplicação da sequência do íntron localizada 120 pb a jusante do sítio de integração. Observe que todas as integrações mostradas foram isoladas de placas de seleção diferentes e representam eventos de integração independentes por definição, mesmo se os elementos integrados e sites de integração forem muito semelhantes. Observe que a extremidade 5 ′ de um TRE5-A de comprimento total consiste em um módulo A de 271 pb que é composto por uma sequência de núcleo de 199 pb e 72 pb idêntica à extremidade 5 ′ do núcleo. Assim, os elementos cujas extremidades 5 ′ são designadas “(1)” têm módulos A de comprimento total (199 + 72 bp), enquanto os elementos etiquetados “(200)” contêm apenas a repetição de 72 bp. FIGO. 4 Frequências de integrações de TRE a montante de uma caixa B isolada. O ensaio de armadilha TRE foi realizado com o gene Val UAC (wt), o gene Val UAC mutante (C56G) e a armadilha vazia (-). Uma caixa B foi inserida 34 pb a jusante do gene tRNA de tipo selvagem e mutante (referido como a caixa exB) e na posição correspondente no íntron da armadilha vazia. Os números de clones de 10 placas de petri de dois clones independentes foram contados após a seleção de 5-FOA e normalizados para o gene Val UAC de tipo selvagem sem a caixa exB e apresentaram ± SDs. FIGO. 5 Ligação in vitro de TFIIIC a genes de tRNA mutantes. A figura mostra os resultados dos EMSAs com o D. discoideum Glu sup derivados de tDNA como sonda radiomarcada. As sondas radiomarcadas foram Glu sup de tipo selvagem (pistas 1 a 3), Glu sup (G53T) (pistas 4 a 6), Glu sup (C56G) (pistas 7 a 9) e Glu sup (C61A) (pistas 10 a 12 ) Um micrograma de plasmídeo carregando a armadilha vazia foi usado como competidor. Os complexos DNA-TFIIIC são indicados pela seta branca. Três quantidades crescentes (0,1 μg, 0,5 μg e 1 μg) da fração NE600 foram usadas como fonte de TFIIIC. FIGO. 6 Frequências de integração de TRE em genes de tRNA mutantes. A figura mostra os resultados do ensaio de armadilha TRE com Val UAC (barras brancas) e Glu sup (barras pretas) como genes de tRNA de isca. Genes de tRNA mutantes (conforme indicado), armadilha de TRE vazia (-) e genes de tRNA de tipo selvagem foram testados. Os números de clones de 10 placas de petri de dois clones independentes de cada cepa são normalizados para os genes de tRNA de tipo selvagem (wt) e expressos ± SDs. FIGO. 7 Exemplos de integrações TRE5-A a montante de um gene de tRNA inativado equipado com uma caixa B extra a jusante. As sequências de DNA de inserções TRE5-A representativas nas posições 10 pb (A) e 50 pb (B) a montante de um Val UAC inativo (C56G) são mostradas. A sequência do íntron é mostrada em letras minúsculas. A caixa exB é apresentada em letras maiúsculas dentro da caixa preta, a caixa B mutada do gene tRNA está dentro de uma linha tracejada. A sequência do gene tRNA é mostrada em letras maiúsculas. O local de inserção é indicado pela seta vertical. As sequências de DNA dos TRE5-As inseridos são mostradas em letras maiúsculas em negrito. Os primeiros nucleotídeos do TRE5-As com exclusão de 5 'são mostrados entre parênteses e os TSDs em caixas cinza. FIGO. 8 Resultados de um ensaio de armadilha TRE usando o D. discoideum gene 5S ribossomal como isca. A frequência de direcionamento no gene r5S é comparada com a armadilha vazia (-) e a armadilha carregada com um D. discoideum Gene Val UAC. Os números médios de clones de 10 placas de Petri são mostrados ± SDs. FIGO. 9 5 ′ junções de novas integrações TRE5-A. (A) Direcionamento do D. discoideum gene r5S. A sequência de destino é escrita na primeira linha em letras minúsculas. A extremidade 5 'do gene r5S (orientação reversa) é mostrada em letras maiúsculas. A seta vertical aponta para o local de integração de um elemento TRE5-A e os números indicam a distância do TRE5-A ao primeiro nucleotídeo do gene r5S direcionado. Os números entre parênteses indicam os primeiros nucleotídeos do TRE5-A inserido, que estão escritos em letras maiúsculas em negrito. As exclusões do site de destino são indicadas como “Δ.” (B) Integrações de TRE5-A a montante de um tandem r5S. A primeira linha indica a sequência alvo, que consiste em dois genes r5S (maiúscula) separados por um sítio de restrição EcoRI e a sequência terminadora da transcrição do primeiro gene r5S (minúscula). Os primeiros nucleotídeos do TRE5-As inserido (maiúscula em negrito) são escritos entre parênteses os nucleotídeos extras estão dentro de uma caixa. FIGO. 10 Modelo de reconhecimento do gene tRNA por proteínas TRE5-A. Um gene tRNA é indicado com uma caixa A e uma caixa B e uma caixa exB a jusante. D. discoideum TFIIIB provavelmente consiste em três subunidades: proteína de ligação a TATA, Brf1 e Bdp1 (T. Winckler, observação não publicada). A composição exata da subunidade de D. discoideum TFIIIC é desconhecido. O complexo de pré-integração TRE5-A, que consiste em proteínas ORF1 e / ou ORF2 e RNA de TRE5-A, é indicado como uma única esfera. (A) TFIIIC liga-se à caixa B interna do gene tRNA e recruta TFIIIB para a extremidade 5 'do gene tRNA. A integração de TRE5-A ocorre por meio da interação com TFIIIB, que deixa a posição -50 desprotegida. (B) Se TFIIIC desliza para a caixa exB durante a transcrição do gene tRNA, TFIIIB permanece em sua posição, ainda apoiando a integração de TRE5-A na posição -50, enquanto a posição -10 é bloqueada por TFIIIB ligado ao DNA. (C) Se TFIIIC se dissociar do gene tRNA, TFIIIB pode ficar e apoiar ainda mais a integração TRE5-A na posição -50.

Estrutura da cromatina e expressão de um gene transcrito por RNA polimerase III são independentes da deposição de H2A.Z

FIGO. 1 Fermento SNR6 é nucleossômico in vivo. (A) Análise IEL da estrutura da cromatina na cepa UKY403 e sua cepa isogênica MHY308. As células crescidas em meio YEP-galactose para um UMA600 de 0,7 foram transferidos para meio YEP contendo glicose e colhidos após 3 h. Ovais cinza denotam as proteções de tamanho nucleossômico. O ponto denota o único corte de MNase entre as caixas A e B no DNA nu. A barra curta marca a região exposta ao redor da caixa TATÁ na cromatina. (B) Mapeamento de nucleossomos em SNR6 pelo ensaio ChIP. Cromatina com histona H2B marcada com Flag foi imunoprecipitada após digestão com MNase usando agarose FLAG-M2 e analisada por PCR em tempo real para diferentes regiões de SNR6. O painel superior mostra as posições de diferentes amplicons na região do gene. Os números referem-se ao local de início da transcrição (+1). As ocupações foram calculadas como enriquecimento relativo sobre a região TEL VIR, e as médias de três experimentos independentes, com barras de erro, são mostradas. FIGO. 2 Estrutura da cromatina de SNR6 sob repressão. A privação de nutrientes em meio 0,15 × YEP sem glicose foi usada para reprimir a transcrição de Pol III. As ocupações foram calculadas como enriquecimento relativo sobre a região TEL VIR, e as médias de três experimentos independentes, com barras de erro, são mostradas. (A) Ensaios de ChIP mostrando a ocupação do RPC160 marcado com HA sobre SNR6 em células de tipo selvagem sem (ativo) ou com repressão por 40 min (reprimido). (B) Aumento progressivo na ocupação do FLAG-H2B sobre a região da caixa TATA-A sob condição reprimida. (C) Análise IEL in vivo de cromatina antes (faixa 1) e depois de mudar as células para 0,15 × meio YEP por 1 h (faixas 2 a 4). Pista A, amostra de controle em estado ativo sem repressão. Ovais cinza denotam a posição de uma região de proteção nucleossômica. As setas com números indicam as posições dos locais de corte de MNase. FIGO. 3 Enriquecimento do nucleossomo a montante com a variante histona H2A.Z. As ocupações foram calculadas como enriquecimento relativo na região TEL VIR. Os resultados dos ensaios ChIP mostrando as médias de três experiências independentes com barras de erro são mostrados. (A) Ocupação das regiões FLAG-H2B sobre a montante, caixa TATA-A e caixa A-B sob estado ativo ou reprimido. (B) Ocupação do FLAG-H2A a montante, TATA-A box e região A-B box em meio YEP com glicose ou após 1 h de repressão. (C) Ocupação de Htz1-FLAG nas regiões a montante e A-B box de SNR6 após 1 h de repressão. FIGO. 4 A deposição de Htz1 no nucleossomo a montante não afeta SNR6 expressão. As ocupações foram calculadas como enriquecimento relativo sobre a região de controle, e as médias de três experimentos independentes com barras de erro são mostradas em cada um dos painéis. (A) Efeito da repressão e deleção de Sas2 nos níveis de acetilação de H4K16 no nucleossomo a montante em relação à região TEL VIR. (B) Ocupação de Sas2-TAP sobre SNR6 em relação à região TEL VIR diminui sob repressão. Para os painéis A e B, os valores são comparados com a ocupação na região da caixa A-B. (C) Ocupação de Swr1-TAP acima SNR6 em relação à região TEL VIR. (D) Ocupação de Htz1-TAP em tipo selvagem, swr1Δ, e sas2Células Δ em comparação com a região Cox3. (E) Análise de curso de tempo do efeito da repressão no nível de RNA U6 na ausência de Htz1. O RNA total foi isolado de tipo selvagem e htz1Células Δ e transcritas reversamente com primers marcados radioativamente específicos para U6 snRNA e U4 snRNA transcrito com Pol II. (F) Análise IEL in vivo da cromatina antes (faixa 3) e depois de mudar o htz1Células Δ para 0,15 × meio YEP por 1 h (pistas 4 e 5). O controle (pistas 1 e 2) mostra a cromatina de células do tipo selvagem sob repressão. Oval cinza denota a posição de uma região de proteção nucleossômica, enquanto a barra mostra a região exposta ao redor da caixa TATA sob o estado ativo na pista 3. Pontas de seta marcam as posições dos locais de corte de MNase. FIGO. 5 Estrutura da cromatina de SNR6 em mutantes RSC4-Δ4. (A) A cepa MW4019 difere de MW3993 por ter a subunidade RSC Sth1 como Myc marcada. A análise IEL mostra o deslocamento de um nucleossomo a montante com uma mutação RSC4. As células de levedura foram cultivadas em meio YEP contendo glicose a um UMA600 de 0,7. Ovais cinza denotam as proteções de tamanho nucleossômico, e a barra marca a região exposta nas pistas 1 e 2. O ponto denota um corte por MNase na posição bp -70, e o asterisco denota o novo local de corte abrangendo o bp -123 a - Posição 178. (B) Efeito da repressão na ocupação das subunidades RSC marcadas com Myc, RSC2 (RSC4 de tipo selvagem) e Sth1 (mutante RSC4 MW4019). FIGO. 6 Mudanças na estrutura da cromatina de SNR6 sob condições ativas ou reprimidas. Para maior clareza, a maquinaria de transcrição de Pol III, que permanece no gene mesmo sob repressão, é omitida. A barra denota a região do DNA exposta nessas condições. A posição do nucleossomo entre as caixas A e B (oval cinza escuro) não muda enquanto o nucleossomo a montante (mostrado em cinza claro) se move. Quando o gene é ativado, os complexos RSC, SWR1 e SAS são recrutados para o gene. RSC desliza um nucleossomo para uma posição a montante da caixa TATA, e H2A neste nucleossomo é trocado por H2A.Z pelo complexo SWR1. O complexo SAS acetila H4K16. Quando o gene é reprimido, RSC, SAS e H2A.Z são perdidos e esse nucleossomo volta a cobrir a caixa TATÁ e o local de início da transcrição.

Conteúdo

Iniciação: a construção do complexo de polimerase no promotor. Pol III é incomum (em comparação com Pol II) não exigindo sequências de controle a montante do gene, em vez disso, normalmente depende de sequências de controle interno - sequências dentro da seção transcrita do gene (embora sequências a montante sejam ocasionalmente vistas, por exemplo, o gene U6 snRNA tem um caixa TATA a montante, conforme visto nos Promotores Pol II).

Classe II

Estágios típicos na iniciação de um gene tRNA (também denominado classe II):

  1. TFIIIC (Transcrição Fator para polimerase IIIC) se liga a duas sequências de controle intragênicas (localizadas dentro da sequência de DNA transcrita), os Blocos A e B (também denominados caixa A e caixa B). [1].
  2. TFIIIC atua como um fator de montagem que posiciona TFIIIB para se ligar ao DNA em um local centrado aproximadamente 26 pares de bases a montante do local de início da transcrição.
  3. TFIIIB (Transcrição Fator para polimerase IIIB), consiste em três subunidades: TBP (TATA Bencontrar Proteína), a proteína relacionada ao TFIIB do fator de transcrição Pol II, Brf1 (ou Brf2 para a transcrição de um subconjunto de genes transcritos de Pol III em vertebrados) e Bdp1. [2].
  4. TFIIIB é o fator de transcrição que monta Pol III no local de início da transcrição. Uma vez que o TFIIIB está ligado ao DNA, o TFIIIC não é mais necessário. TFIIIB também desempenha um papel essencial na abertura do promotor.

TFIIIB permanece ligado ao DNA após o início da transcrição por Pol III (ao contrário dos fatores σ bacterianos e da maioria dos fatores de transcrição básicos para a transcrição de Pol II). Isso leva a uma alta taxa de reinicialização da transcrição de genes transcritos de Pol III.

Classe I

Estágios típicos na iniciação do gene 5S rRNA (também denominado classe I):

  1. TFIIIA (Transcrição Fator para polimerase IIIUMA) se liga à sequência de controle 5S rRNA intragênica (situada dentro da sequência de DNA transcrita), o Bloco C (também denominado caixa C).
  2. TFIIIA Serve como uma plataforma que substitui os Blocos A e B para o posicionamento do TFIIIC em uma orientação em relação ao local de início da transcrição equivalente ao observado para genes de tRNA.
  3. Uma vez que TFIIIC está ligado ao complexo TFIIIA-DNA, a montagem de TFIIIB prossegue conforme descrito para a transcrição de tRNA.

Classe III

Estágios típicos na iniciação do gene U6 snRNA (também denominado classe III) (documentado apenas em vertebrados):

  1. SNAPc (SNRNA UMAcativante Protina complex) (também denominado PBP e PTF) se liga ao PSE (Proximal Sequência Ecimento) centrado aproximadamente 55 pares de bases a montante do local de início da transcrição. Esta montagem é muito estimulada pelos fatores de transcrição de Pol II Oct1 e STAF que se ligam a um DSE semelhante a potenciador (Distal Sequência Ecimento) pelo menos 200 pares de bases a montante do local de início da transcrição. Esses fatores e elementos promotores são compartilhados entre a transcrição de Pol II e Pol III de genes de snRNA.
  2. SNAPc atua para montar TFIIIB em uma caixa TATA centrada em 26 pares de bases a montante do local de início da transcrição. É a presença de uma caixa TATA que especifica que o gene snRNA é transcrito por Pol III em vez de Pol II.
  3. O TFIIIB para a transcrição de U6 snRNA contém um parálogo Brf1 menor, Brf2.
  4. TFIIIB é o fator de transcrição que monta Pol III no local de início da transcrição. A conservação de sequência prevê que TFIIIB contendo Brf2 também desempenha um papel na abertura do promotor.

Iniciação da transcrição em eucariotos

Ao contrário da polimerase procariótica, que pode se ligar a um molde de DNA por conta própria, os eucariotos requerem várias outras proteínas, chamadas fatores de transcrição, para primeiro se ligarem à região promotora e, em seguida, ajudarem a recrutar a polimerase apropriada.

As três polimerases de RNA eucarióticas

As características da síntese de mRNA eucariótica são marcadamente mais complexas daquelas dos procariotos. Em vez de uma única polimerase compreendendo cinco subunidades, os eucariotos têm três polimerases, cada uma composta por 10 subunidades ou mais. Cada polimerase eucariótica também requer um conjunto distinto de fatores de transcrição para trazê-la para o modelo de DNA.

A RNA polimerase I está localizada no nucléolo, uma subestrutura nuclear especializada na qual o RNA ribossômico (rRNA) é transcrito, processado e montado em ribossomos (Tabela 1). As moléculas de rRNA são consideradas RNAs estruturais porque têm uma função celular, mas não são traduzidas em proteínas. Os rRNAs são componentes do ribossomo e são essenciais para o processo de tradução. A RNA polimerase I sintetiza todos os rRNAs, exceto a molécula de rRNA 5S. A designação “S” se aplica a unidades “Svedberg”, um valor não aditivo que caracteriza a velocidade na qual uma partícula sedimenta durante a centrifugação.

Tabela 1. Localizações, produtos e sensibilidades das três polimerases de RNA eucarióticas
RNA polimerase Compartimento Celular Produto da Transcrição Sensibilidade de α-Amanitina
eu Nucléolo Todos os rRNAs, exceto 5S rRNA Insensível
II Núcleo Todos os pré-mRNAs nucleares que codificam proteínas Extremamente sensível
III Núcleo 5S rRNA, tRNAs e pequenos RNAs nucleares Moderadamente sensível

A RNA polimerase II está localizada no núcleo e sintetiza todos os pré-mRNAs nucleares codificadores de proteínas. Os pré-mRNAs eucarióticos são submetidos a um extenso processamento após a transcrição, mas antes da tradução. Para maior clareza, a discussão deste módulo sobre transcrição e tradução em eucariotos usará o termo "mRNAs" para descrever apenas as moléculas maduras processadas que estão prontas para serem traduzidas. A RNA polimerase II é responsável pela transcrição da grande maioria dos genes eucarióticos.

A RNA polimerase III também está localizada no núcleo. Esta polimerase transcreve uma variedade de RNAs estruturais que incluem o pré-rRNA 5S, pré-RNAs de transferência (pré-tRNAs) e pequenos pré-RNAs nucleares. Os tRNAs têm um papel crítico na tradução, pois servem como moléculas adaptadoras entre o molde de mRNA e a cadeia polipeptídica em crescimento. RNAs nucleares pequenos têm uma variedade de funções, incluindo “splicing” de pré-mRNAs e regulação de fatores de transcrição.

Um cientista que caracteriza um novo gene pode determinar qual polimerase o transcreve testando se o gene é expresso na presença de um determinado veneno de cogumelo, α-amanitina (Tabela 1). Curiosamente, α-amanitina produzida por Amanita phalloides, o cogumelo Death Cap, afeta as três polimerases de forma muito diferente. A RNA polimerase I é completamente insensível à α-amanitina, o que significa que a polimerase pode transcrever o DNA in vitro na presença desse veneno. Em contraste, a RNA polimerase II é extremamente sensível à α-amanitina e a RNA polimerase III é moderadamente sensível. Saber a transcrição da polimerase pode indicar ao pesquisador a função geral do gene que está sendo estudado. Como a RNA polimerase II transcreve a grande maioria dos genes, vamos nos concentrar nessa polimerase em nossas discussões subsequentes sobre fatores e promotores de transcrição eucarióticos.

Estrutura de um promotor de RNA polimerase II

Os promotores eucarióticos são muito maiores e mais complexos do que os promotores procarióticos, mas ambos têm uma caixa TATÁ. Por exemplo, no gene da timidina quinase de camundongo, a caixa TATÁ está localizada a aproximadamente -30 em relação ao local de iniciação (+1) (Figura 1). Para este gene, a seqüência exata da caixa TATA é TATAAAA, conforme lida na direção 5 ′ a 3 ′ na fita não-modelo. Esta sequência não é idêntica ao E. coli TATA box, mas conserva o elemento A – T rico. A termoestabilidade das ligações A – T é baixa e isso ajuda o molde de DNA a se desenrolar localmente na preparação para a transcrição.

Figura 1. Um promotor generalizado de um gene transcrito pela RNA polimerase II é mostrado. Fatores de transcrição reconhecem o promotor. A RNA polimerase II então se liga e forma o complexo de iniciação da transcrição.

Art Connection

Figura 2. O mRNA eucariótico contém íntrons que devem ser separados. Uma tampa de 5 ′ e uma cauda de poli-A 3 ′ também são adicionadas.

Um cientista une um promotor eucariótico na frente de um gene bacteriano e insere o gene em um cromossomo bacteriano. Você esperaria que a bactéria transcrevesse o gene?

O genoma do camundongo inclui um gene e dois pseudogenes para a timidina quinase citoplasmática. Pseudogenes são genes que perderam sua capacidade de codificação de proteínas ou não são mais expressos pela célula. Esses pseudogenes são copiados do mRNA e incorporados ao cromossomo. Por exemplo, o promotor da timidina quinase de camundongo também tem uma caixa CAAT conservada (GGCCAATCT) em aproximadamente -80. Esta sequência é essencial e está envolvida em fatores de transcrição de ligação. Mais a montante da caixa TATÁ, os promotores eucarióticos também podem conter uma ou mais caixas ricas em GC (GGCG) ou caixas de octâmero (ATTTGCAT). Esses elementos ligam fatores celulares que aumentam a eficiência da iniciação da transcrição e são frequentemente identificados em genes mais “ativos” que estão constantemente sendo expressos pela célula.

Fatores de transcrição para RNA polimerase II

A complexidade da transcrição eucariótica não termina com as polimerases e promotores. Um exército de fatores de transcrição basais, intensificadores e silenciadores também ajudam a regular a frequência com que o pré-mRNA é sintetizado a partir de um gene. Intensificadores e silenciadores afetam a eficiência da transcrição, mas não são necessários para que a transcrição prossiga. Fatores de transcrição básicos são cruciais na formação de um complexo de pré-iniciação no molde de DNA que subsequentemente recruta a RNA polimerase II para o início da transcrição.

Os nomes dos fatores de transcrição basais começam com “TFII” (este é o fator de transcrição para a RNA polimerase II) e são especificados com as letras A – J. Os fatores de transcrição se encaixam sistematicamente no molde de DNA, com cada um estabilizando ainda mais o complexo de pré-iniciação e contribuindo para o recrutamento de RNA polimerase II.

Os processos de trazer as RNA polimerases I e III para o molde de DNA envolvem coleções ligeiramente menos complexas de fatores de transcrição, mas o tema geral é o mesmo. A transcrição eucariótica é um processo rigidamente regulado que requer uma variedade de proteínas para interagir entre si e com a fita de DNA. Embora o processo de transcrição em eucariotos envolva um maior investimento metabólico do que em procariotos, ele garante que a célula transcreva precisamente os pré-mRNAs de que necessita para a síntese de proteínas.

Evolution Connection

A Evolução dos Promotores

A evolução dos genes pode ser um conceito familiar. As mutações podem ocorrer nos genes durante a replicação do DNA, e o resultado pode ou não ser benéfico para a célula. Ao alterar uma enzima, proteína estrutural ou algum outro fator, o processo de mutação pode transformar funções ou características físicas. No entanto, os promotores eucarióticos e outras sequências reguladoras de genes também podem evoluir. Por exemplo, considere um gene que, ao longo de muitas gerações, se torna mais valioso para a célula. Talvez o gene codifique uma proteína estrutural de que a célula precisa para sintetizar em abundância para uma determinada função. Se este for o caso, seria benéfico para a célula para o promotor desse gene recrutar fatores de transcrição de forma mais eficiente e aumentar a expressão do gene.

Os cientistas que examinam a evolução das sequências do promotor relataram resultados variados. Em parte, isso ocorre porque é difícil inferir exatamente onde um promotor eucariótico começa e termina. Alguns promotores ocorrem dentro de genes, outros estão localizados muito a montante, ou mesmo a jusante, dos genes que estão regulando. No entanto, quando os pesquisadores limitaram seu exame às sequências do promotor central humano que foram definidas experimentalmente como sequências que se ligam ao complexo de pré-iniciação, eles descobriram que os promotores evoluem ainda mais rápido do que os genes codificadores de proteínas.

Ainda não está claro como a evolução do promotor pode corresponder à evolução dos humanos ou de outros organismos superiores. No entanto, a evolução de um promotor para efetivamente produzir mais ou menos um determinado produto gênico é uma alternativa intrigante para a evolução dos próprios genes.

Estruturas promotoras para RNA polimerases I e III

Em eucariotos, os elementos promotores conservados diferem quanto aos genes transcritos pelas RNA polimerases I, II e III. A RNA polimerase I transcreve genes que possuem duas sequências promotoras ricas em GC na região -45 a +20. Estas sequências por si só são suficientes para que ocorra a iniciação da transcrição, mas os promotores com sequências adicionais na região de -180 a -105 a montante do local de iniciação irão aumentar ainda mais a iniciação. Os genes que são transcritos pela RNA polimerase III têm promotores a montante ou promotores que ocorrem dentro dos próprios genes.


Transcrição de RNA polimerase III como um fator de doença

A RNA polimerase (Pol) III é responsável pela transcrição de diferentes genes não codificadores em células eucarióticas, cujos produtos de RNA têm funções bem definidas na tradução e outros processos biológicos para alguns, e funções que ainda não foram definidas para outros. Para todos eles, no entanto, novas funções estão sendo descritas. Por exemplo, foi relatado que os produtos Pol III regulam certas proteínas, como a proteína quinase R (PKR) por associação direta, para constituir a fonte de RNAs muito curtos com funções regulatórias na expressão gênica ou para controlar os níveis de microRNA por sequestro. Consistente com essas muitas funções, a desregulação dos genes transcritos de Pol III está associada a uma grande variedade de doenças humanas. Aqui, revisamos diferentes doenças humanas que foram associadas a defeitos no aparelho de transcrição de Pol III ou ao desequilíbrio de produtos de Pol III e discutimos os possíveis mecanismos subjacentes.

Palavras-chave


Papel da RNA polimerase na transcrição do gene | Genética

Neste artigo iremos discutir sobre o papel da RNA polimerase na transcrição.

As enzimas da polimerase de RNA são enzimas complexas que em E. coli são compostas por 5 subunidades ou cadeias polipeptídicas designadas β, β & # 8217, α, σ e ω com respectivos pesos moleculares de 160.000, 150.000, 90.000, 40.000 e 10.000. A cadeia α está presente duas vezes, outras apenas uma. A forma ativa da enzima é chamada de holoenzima e tem um peso molecular total de 500.000.

As cadeias polipeptídicas são mantidas juntas por ligações não covalentes secundárias. As cadeias β, β & # 8217, α e ω formam a enzima central σ (fator sigma) está fracamente ligada às outras cadeias e pode facilmente se desprender. A enzima central catalisa a ligação dos nucleotídeos da ribose por ligações fosfodiéster.

O fator sigma reconhece as sequências iniciais na região promotora do DNA onde a transcrição começa. Na presença do fator sigma, a holoenzima liga-se àqueles nucleotídeos na região do promotor que iniciam a transcrição. Logo depois disso, a dupla hélice se desenrola e uma fita serve como modelo para a transcrição.

As RNA polimerases eucarióticas I, II e III consistem em 8 a 14 subunidades diferentes em cada uma. Eles reconhecem diferentes promotores e reconhecem diferentes classes de genes.

As duas maiores subunidades de todas as três RNA polimerases eucarióticas estão relacionadas às subunidades β e β & # 8217 da polimerase de E. coli. Cinco subunidades das RNA polimerases eucarióticas são comuns a todas as três enzimas. Essas semelhanças estruturais permitem que as polimerases eucarióticas compartilhem várias propriedades funcionais comuns.

Site de transcrição, reconhecimento do promotor:

A sequência de DNA à qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição de um gene é chamada de promotor. O promotor é um local específico no início dos genes onde a transcrição é iniciada.

O processo de iniciação é importante porque esta é a etapa principal na qual a transcrição é regulada. Os promotores típicos têm de 20 a 200 bases de comprimento. A sequência de bases entre diferentes promotores mostra variação, e isso se relaciona com a força de ligação com a RNA polimerase.

A transcrição levantou a questão de saber se uma ou ambas as fitas do duplex de DNA são transcritas. No vírus φ X 174, que tem apenas DNA de fita simples (ao contrário da maioria dos outros vírus de DNA), apenas uma fita de DNA é transcrita em uma sequência de RNA complementar. Em outros vírus com DNA duplex, quando consideramos o genoma inteiro, ambas as fitas do duplex de DNA são transcritas, uma fita servindo como molde para alguns genes, a outra fita para os genes restantes.

Transcrição em procariontes:

Os promotores nas bactérias estão localizados na região de uma fita de DNA imediatamente anterior ao local de iniciação da transcrição do RNA. O nucleotídeo no qual a transcrição é iniciada é denotado como + 1 e o nucleotídeo anterior como -1. As porções do DNA que precedem o local de iniciação, em direção à extremidade 3 & # 8242 do modelo, são consideradas a montante desse local.

Essas porções do DNA que o sucedem, em direção à extremidade 5 & # 8242 do modelo, são consideradas a jusante desse local. As comparações de sequências promotoras de uma série de genes diferentes isolados de E. coli revelaram que a região a montante do local de iniciação da transcrição contém dois conjuntos de sequências que são semelhantes em uma variedade de genes.

Essas duas sequências comuns, conhecidas como sequências de consenso, contêm 6 nucleotídeos cada. Cada base na sequência de consenso é a base mais frequentemente observada naquela posição entre qualquer número de sequências observadas.

As sequências de consenso estão localizadas a aproximadamente 10 e 35 pares de bases a montante do local de início da transcrição. Eles são chamados de elementos -10 e -35, denotando sua posição em relação ao local de início da transcrição, que está na posição + 1. (Fig. 15.6).

A sequência de consenso na posição 35 em E. coli tem TTGACA e a da posição 10 tem TATAAT. As sequências nas posições & # 8211 10 e & # 8211 35 não são idênticas em promotores diferentes, mas semelhantes o suficiente para estabelecer sequências de consenso. A sequência & # 8211 10 que é chamada de TATA box ou Pribnow box (após o nome de seu descobridor) é semelhante às sequências encontradas em posições correspondentes em muitos promotores eucarióticos.

As posições das sequências promotoras determinam onde e em qual fita a RNA polimerase inicia a síntese. Evidências experimentais apóiam a importância funcional dos elementos promotores & # 8211 10 e & # 8211 35.

Em primeiro lugar, os genes com elementos promotores que diferem das sequências de consenso são transcritos de forma menos eficiente do que os genes cujos promotores correspondem mais de perto à sequência de consenso.

Em segundo lugar, as mutações induzidas nas sequências de consenso & # 8211 35 ou & # 8211 10 têm fortes efeitos na função do promotor.

Terceiro, os locais nos quais a RNA polimerase se liga aos promotores foram identificados diretamente por experimentos de footprint, amplamente usados ​​para determinar os locais nos quais as proteínas se ligam ao DNA (Fig. 15.7).

Nestes experimentos, um fragmento de DNA é radiomarcado em uma extremidade. O DNA marcado é incubado com a proteína, por exemplo, RNA polimerase, e então sujeito a digestão parcial com DNase. O método é baseado no princípio de que as regiões do DNA às quais a proteína se liga são protegidas da digestão da DNase. Uma amostra paralela de DNA que não foi incubada com proteína é digerida com DNase.

As regiões do DNA com proteína ligada podem ser identificadas por comparação dos produtos de digestão do DNA ligado à proteína e DNA sem proteína. Tal análise de footprint mostrou que a RNA polimerase geralmente se liga a promotores ao longo de aproximadamente uma região de 60 pares de bases, estendendo-se de & # 8211 40 a + 20, isto é, de 40 nucleotídeos a montante a 20 nucleotídeos a jusante do local de início da transcrição. A subunidade sigma (fator σ) da RNA polimerase liga-se especificamente a sequências em ambas as regiões do promotor & # 8211 35 e & # 8211 10, indicando a importância dessas regiões na função do promotor.

Iniciação da Transcrição:

Na ausência da subunidade sigma, a RNA polimerase pode se ligar não especificamente ao DNA com baixa afinidade. Sigma desempenha um papel crucial no direcionamento da polimerase para promotores, ligando-se especificamente a ambas as sequências & # 8211 35 e & # 8211 10, levando à iniciação da transcrição no início de um gene. A ligação inicial entre a polimerase e o promotor é referida como complexo de promotor fechado porque o DNA não é desenrolado.

A polimerase então desenrola cerca de 15 bases de DNA em torno do local de iniciação para formar um complexo de promotor aberto e DNA de fita simples é disponibilizado para transcrição. O primeiro trifosfato de nucleosídeo é colocado no local. O próximo nucleotídeo em linha é unido ao carbono 3 & # 8242 da ribose e assim por diante. A transcrição é iniciada pela união de dois NTPs gratuitos no site + 1.

Alongamento da corrente:

Após a adição de cerca dos primeiros dez nucleotídeos, o sigma é liberado da polimerase mostrada na Fig. 15.6. The polymerase then moves along the DNA template strand, adding nucleotides to the 3′ end of the growing RNA chain. Thus RNA chains grow in the 5′ to 3′ direction similar to what is observed in DNA synthesis.

As it moves, the polymerase unwinds the template DNA over about 17 base pairs (less than two turns of the double helix) in the region of transcription. After RNA polymerase has passed, the DNA strands reform the duplex.

Chain Termination:

The RNA chain continues to grow until the RNA polymerase encounters a termination signal. Then transcription stops, the RNA chain is released from the polymerase, and the enzyme dissociates from its DNA template. The most common type of termination signal in E. coli consists of a symmetrical inverted repeat of a GC-rich sequence followed by 4 or more A residues.

Transcription of the GC-rich inverted repeat produces a segment in the growing RNA chain that can form a stem loop structure by complementary base pairing (Fig. 15.8).

The formation of a self-complementary structure dissociates the chain from the DNA template and terminates transcription. There are other types of transcription termination signals in prokaryotes as well as eukaryotes that involve binding of proteins to specific DNA sequences for chain termination, instead of formation of the stem-loop structure in RNA.

Transcription in Eucariótica:

There are two major differences between prokaryotic and eukaryotic transcription systems.

First, a single RNA polymerase is able to transcribe all genes in bacteria, whereas eukaryotic cells have multiple different RNA polymerases that transcribe distinct classes of genes.

Second, eukaryotic RNA polymerases do not bind directly to promoter sequences, but interact with a number of proteins to specifically initiate transcription. The complexity of the transcription process in eukaryotes is presumed to be related with the regulation of gene expression required to control activities of many different cell types in multicellular forms.

Three distinct nuclear RNA polymerases transcribe different classes of genes in eukaryotic cells (Table).

RNA polymerase II transcribes protein coding genes in nucleus to yield mRNAs RNA polymerases I and III transcribe ribosomal RNAs (rRNAs) and transfer RNAs (tRNAs). The three largest species of tRNAs are transcribed by RNA polymerase I.

The genes for transfer RNA and the smallest species of ribosomal RNA (5S rRNA), as well as some small nuclear (snRNAs) and cytoplasmic RNAs (scRNAs) involved in splicing and protein transport are transcribed by RNA polymerase III. In addition, mitochondria and chloroplasts contain separate RNA polymerases similar to bacterial RNA polymerases that specifically transcribe DNA in these organelles.

Transcription by RNA Polymerase II:

The different mode of action of transcription in eukaryotic cells was noted in 1979 when it was found that RNA polymerase II is able to initiate transcription only if additional proteins are added to the reaction. In contrast with the bacterial sigma factors, transcription in eukaryotic cells requires distinct initiation factors that were not associated with the polymerase.

Specific proteins acting as transcription factors have now been identified that are required by RNA polymerase II to initiate transcription. Two types of transcription factors have been defined: general transcription factors involved in transcription from all polymerase II promoters additional transcription factors involved in control of expression of individual genes.

Experiments using in vitro systems have indicated that five general transcription factors are required for initiation of transcription by RNA polymerase II. The promoters of many genes transcribed by polymerase II contain a sequence similar to TATAA 25 to 30 nucleotides upstream of the transcription start site.

This sequence referred to as the TATA box is similar to the -10 sequence of bacterial promoters and is involved in initiation of transcription as follows: first, a general transcription factor called TFIID (TF indicates transcription factor, II denotes polymerase II) binds to the TATA box. TFIID has multiple subunits including the TATA-binding protein (TBP).

The TBP binds specifically to the TATAA consensus sequence and 10-12 other polypeptides called TBP-associated factors (TAFs). Second, TBP binds to a second general transcription factor (TFIIB) forming a TBP-TFIIB complex at the promoter. Following recruitment of RNA polymerase II to the promoter, two additional factors (TFIIE and TFIIH) are required for initiation of transcription.

Two subunits of TFIIH are helicase that unwind DNA around initiation site, while another subunit is a protein kinase that phosphorylates repeated sequences in the largest subunit of RNA polymerase II. In spite of the development of in vitro systems, much remains to be elucidated about polymerase II transcription in eukaryotic cells.

Transcription by RNA Polymerases I and III:

Like RNA polymerase II, the other two polymerases I and III also require additional transcription factors to associate with appropriate promoter sequences. Although the three eukaryotic polymerases recognise distinct types of promoters, a common transcription factor, the TATA- binding protein (TBP) seems to be required for initiation of transcription by all 3 polymerases.

RNA polymerase I transcribes ribosomal RNA genes which are present in tandem repeats, to yield a large 45S pre-rRNA, which is then processed to derive the 28S, 18S and 5.8S rRNAs (Fig. 15.9).

The promoter of rRNA genes consists of 150 base pairs just upstream of the transcription initiation site. These promoter sequences are recognised by two transcription factors, UBF (upstream binding factor) and SL1 (selectivity factor 1) which bind to the promoter and then recruit polymerase I to form an initiation complex.

One of the four protein subunits of the SL1 transcription factor is TBP. Thus, TBP is a common transcription factor required by all 3 types of eukaryotic RNA polymerases. The promoter of ribosomal RNA genes does not contain TATA box, therefore, TBP does not bind to specific promoter sequences. Thus TBP associates with ribosomal RNA genes through the binding of other proteins in the SL1 complex to the promoter.

The genes for tRNAs, 5S rRNA and some of the small RNAs involved in splicing and protein transport are transcribed by Polymerase III. These genes are characterised by promoters that lie within, and not upstream of the transcribed sequence.

The process of termination of transcription was found out from experiments in prokaryotes in which nucleus is not bound by a membrane. Therefore, synthesis of proteins on ribosomes occurs simultaneously with synthesis of mRNA on DNA.

Visualisation of Transcription:

The idea of visualizing gene transcription originally arose from light microscopic studies of lampbrush chromosomes in amphibian oocytes performed by Callan and Lloyd, and Gall in the 1960’s similar studies were done on the puffed polytene chromosomes of insects by Beermann and his colleagues. Oocyte-chromosomes are highly extended in the lampbrush state and contain thousands of chromosomal loci active in RNA synthesis.

Another favourable attribute of oocytes is that there is amplification (manifold increase) of rRNA genes during early oogenesis giving rise to hundreds of extra nucleoli in a nucleolus. In this system, transcription of ribosomal cistrons has been visualised.

During transcription on oocyte lampbrush chromosomes, the DNA in the condensed, bead­like chromomere unravels and is spun out into a loop and transcribed. The loop axis becomes covered by the transcribed RNA fibrils embedded in a protein matrix (Fig. 15.12). At the base of each RNP (ribonucleoprotein) fibril, an RNA polymerase molecule is attached. In male meiosis and somatic cells transcription produces fine hair-like outgrowths from the chromosomes (Fig. 15.13).

Puffing in the giant polytene chromosomes in the salivary glands of insects represents a direct way of correlating chromosome structure with gene transcription. Puff formation indicates genes that are actively transcribing RNA which would be translated into salivary proteins. Further work of Grossbach (1969) and others made it possible to relate the syn thesis of a specific protein with a specific puff.

In 1969 Miller and Beatty developed a spreading technique for chromatin by which nascent RNP transcripts could be visualised in the electron microscope. The technique has since been applied to various materials. It allows us to visualize the spatial relationships between DNA, RNA polymerase and the RNA transcripts in situ.

EM studies have confirmed that most of the DNP (de-oxy-ribonucleoprotein) fibrils are entangled in the chromomeric mass and only a small proportion is extended into lateral loops. The initiation and termination sites for transcription are located at the two ends of the loop i.e., the thick and thin insertion sites of the loop.

The lateral RNP fibrils which contain the nascent RNA transcripts are of increasing length. One loop is said to represent one transcriptional unit. Many times an active loop shows tandemly arranged transcription units separated by spacer regions (Fig. 15.14). The spacers represent non-transcribed regions. Up to 5 transcriptional units may be present on a loop the loop is therefore a multi-gene structure.

These authors also found initiation sites of two transcriptional units overlapping each other. The drug actinomycin-D which inhibits transcription removes RNP fibrils from the template and causes loops to collapse.

The initial products of transcription observed in EM are longer than the average hnRNA molecules isolated by biochemical techniques. Similar studies on transcription have also been conducted on interphase nuclei of somatic cells in some organisms.

Inhibitors of Transcription:

Several compounds can inhibit transcription of DNA by RNA polymerase. One group of compounds acts by binding non-covalently to the DNA template and modifying its structure the other group binds to the RNA polymerase and inhibits its catalytic function. The most important inhibitor is actinomycin-D (AMD), an antibiotic produced by streptomyces.

Its phenoxazene ring intercalates between two GC pairs, while its two peptide side chains form H-bonds with guanine bases and project into minor groove of the double helix.

AMD does not interfere with the binding of RNA polymerase to DNA but inhibits chain elongation by preventing movement of core enzyme along the template. AMD does not interfere with replication of DNA. Aflatoxin, ethidium bromide and 2- acetyl-amino-fluorine also inhibit transcription by binding to DNA.

A group of bacterial antibiotics called rifamycins act by inhibiting bacterial RNA polymerases. One such compound known as rifampicin binds non-covalently to the β subunit of RNA polymerase so that chain initiation is inhibited, but does not affect chain elongation, α- amanitin blocks one of the RNA polymerase enzymes present in eukaryotic cells but bacterial mitochondrial or chloroplast RNA polymerases are not affected by it.


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Ciência

Vol 348, Issue 6234
01 May 2015

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By Antoine Bridier-Nahmias , Aurélie Tchalikian-Cosson , Joshua A. Baller , Rachid Menouni , Hélène Fayol , Amando Flores , Ali Saïb , Michel Werner , Daniel F. Voytas , Pascale Lesage

Ciência 01 May 2015 : 585-588

A mobile genetic element is targeted away from gene-coding regions by a component of a host transcription complex.


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