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Como as células T determinam quais células já inspecionaram?

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Pelo que entendi, as células T estão constantemente viajando pelo corpo, inspecionando as células em busca de antígenos. Se forem antígenos próprios, a célula T não ataca, enquanto se não forem próprios, eles atacam. Minha pergunta é como uma célula T sabe quando acaba de inspecionar uma célula? A célula T deixa algo para trás na célula para marcá-la como marcada ou a própria célula apresenta algo em sua superfície para indicar que ela acabou de ser verificada? Se esse sistema não existe, o que impede as células T de ficarem presas em um loop e apenas inspecionar a mesma célula continuamente?


Sua pergunta abrange duas atividades das células T que estão relacionadas entre si: migração e ativação. As células T que geralmente ficam em órgãos linfóides migram para órgãos não linfóides com mecanismos diferentes para cada subtipo de célula T. Quando migram para um órgão não linfóide, as células T movem-se através do órgão em busca de células infectadas.

Migração

Como você pode ver na imagem abaixo, existem muitos mecanismos para mover as células T através da camada endotelial.

A ideia principal para todos os três mecanismos é que a ligação da célula T à camada endotelial é fraca. Por causa da interação fraca, o fluxo sanguíneo faz com que a célula T se mova através da camada endotelial enquanto ainda está ligada à camada endotelial. Isso é conhecido como rolamento. Outros estímulos (geralmente quimiocinas), como CCL21, CCL25 ou ICAM 1, são necessários para induzir as células T a migrar através da camada endotelial. Isso é importante porque essas quimiocinas são expressas onde há inflamação. Por exemplo, existe uma correlação entre o nível de CCL25 no intestino e a inflamação na área.

As células T expressam integrina α4β7 ou CCR7 que se ligam às células T à camada endotelial. As células T de memória central e as células T naive expressam CCR7 e CD62L e, portanto, residem preferencialmente nos órgãos linfoides secundários. As células T efetoras de memória ligam-se ao endotélio intestinal com integrina α4β7, CCR9 e LFA-1.

O CCL21 é expresso por ambas as células do estroma do paracórtex dos linfonodos e endotélio dos vasos linfáticos para auxiliar a migração de células dendríticas ativadas e células T ingênuas e de memória central para os linfonodos, respectivamente. As células dendríticas são células apresentadoras de antígenos profissionais (APCs) que migram para o linfonodo, onde podem interagir com as células T de maneira mais eficiente.

Ativação de células T

Um conceito importante a ser retirado da ativação de células T é que deve haver contato direto entre o complexo MHC e o receptor de células T (TCR).

As células T que se moveram para o linfonodo interagem com as células dendríticas, que possuem alta concentração de complexo MHC em sua superfície celular. Isso leva à ativação subsequente da célula T levando à liberação de citocinas, como IL-2, levando à proliferação de células T ativadas.

As células T ativadas agora são capazes de se mover livremente através da camada endotelial de órgãos não linfóides para se infiltrar e procurar locais infectados. (As células T ingênuas também entram na camada endotelial de órgãos não linfóides, mas isso é independente de quimiocina e, portanto, não é uma reação à inflamação).

Fontes:

Diferença entre células T ingênuas e células T de memória: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1782715/

Papel da célula dendrítica na resposta imune: http://lab.rockefeller.edu/steinman/dendritic_intro/immuneResponse

Migração de memória vs células T ingênuas: http://www.nature.com/icb/journal/v86/n3/full/7100132a.html

Célula dendrítica e função de CCL21: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3078419/

Infiltração ingênua de órgãos não linfóides de células T: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/eji.200535539/full

CCL25 e relação de inflamação: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0896841116300014


A célula T não inspeciona nenhuma célula até que a célula mostre um pedaço do antígeno "não próprio" nele pelo MHC.

A célula T auxiliar se conecta com o antígeno que está na superfície da célula. A célula T classifica as citocinas que ativam a célula T citotóxica para se dividir e formar uma colônia de células citotóxicas. A colônia de células citotóxicas então ataca a célula que expressa o antígeno "não próprio".


A análise de uma única célula da diferenciação de células T CD4 + revela três estados celulares principais e aceleração progressiva da proliferação

A diferenciação de linfócitos é freqüentemente acompanhada por mudanças no ciclo celular, interação que é de importância central para a imunidade, mas ainda não é completamente compreendida. Aqui, nós interrogamos e modelamos quantitativamente como a proliferação está ligada à diferenciação em células T CD4 +.

Resultados

Realizamos o sequenciamento de RNA de célula única ex vivo de células T CD4 + durante um modelo de infecção de camundongo que desencadeia uma resposta imune do tipo 2 e infere que as células produtoras de citocinas diferenciadas têm um ciclo mais rápido do que as células precursoras ativadas precocemente. Para dissecar esse fenômeno quantitativamente, determinamos perfis de expressão em gerações consecutivas de células diferenciadas e indiferenciadas durante a polarização Th2 in vitro. Prevemos três estados celulares discretos, que verificamos por PCR quantitativo de uma única célula. Com base nesses três estados, extraímos as taxas de morte, divisão e diferenciação com um modelo de Markov de estado de ramificação para descrever a dinâmica da população celular. A partir dessa modelagem em várias escalas, inferimos uma aceleração significativa na proliferação do estado de célula ativada intermediária para o estado efetor secretor de citocinas maduras. Confirmamos esta aceleração por imagem ao vivo de células Th2 únicas e em um modelo de malária Th1 ex vivo por sequenciamento de RNA de célula única.

Conclusão

A ligação entre a secreção de citocinas e a taxa de proliferação se mantém tanto nas células Th1 e Th2 in vivo e in vitro, indicando que este é provavelmente um fenômeno geral na imunidade adaptativa.


REVER artigo

  • 1 Sir William Dunn School of Pathology, University of Oxford, Oxford, Reino Unido
  • 2 Radcliffe Department of Medicine, Medical Research Council Human Immunology Unit, Weatherall Institute of Molecular Medicine, University of Oxford, Oxford, Reino Unido

O sistema imunológico atua como uma linha crucial de defesa contra infecções e câncer, ao mesmo tempo que contribui para a homeostase do tecido. A comunicação entre as células imunes é mediada por pequenos fatores solúveis chamados citocinas e também por interações celulares diretas. As interações célula-célula são particularmente importantes para a ativação de células T. As células T direcionam a resposta imune adaptativa e, portanto, precisam distinguir entre antígenos próprios e estranhos. Embora décadas tenham se passado desde a descoberta das células T, exatamente por que e como elas são capazes de reconhecer e discriminar antígenos ainda não é totalmente compreendido. A imagem precoce de células T foi muito bem-sucedida na captura dos estágios iniciais da formação de conjugado de células T com células apresentadoras de antígeno após o reconhecimento dos principais complexos de histocompatibilidade carregados com peptídeo pelo receptor de células T (TCR). Esses estudos levam à descoberta de um & # x0201Cs cluster de ativação supramolecular & # x0201D agora conhecido como a sinapse imunológica, seguido pela identificação de microclusters de TCRs formados no disparo do receptor, que eventualmente se aglutinam no centro da sinapse. Novos desenvolvimentos em microscopia de luz desde então permitiram que a atenção se voltasse para os estágios mais iniciais da ativação das células T e para as células em repouso, em alta resolução. Isso inclui microscopia de localização de molécula única, que foi aplicada à questão de saber se os TCRs são pré-agrupados em células T em repouso e microscopia de lâmina de luz de rede que permitiu a imagem de células inteiras interagindo com células apresentadoras de antígenos. A utilização da microscopia de lâmina de luz lattice rendeu informações importantes sobre estruturas chamadas microvilosidades, que são pequenas protrusões de membrana nas células T que parecem ter um grande impacto no reconhecimento e ativação das células T. Aqui, consideramos como a imagem moldou nosso pensamento sobre a ativação de células T. Resumimos as descobertas recentes obtidas pela aplicação de técnicas de microscopia mais avançadas e discutimos algumas das limitações desses métodos.


1. Introdução

A resposta imune adaptativa depende das interações das células T com as células dendríticas (DCs) no paracórtex, ou zona das células T, dos linfonodos (LNs). A taxa na qual células T na & # x000EFve amostram DCs determina a rapidez com que o sistema imunológico pode montar uma resposta à infecção (1). O desenvolvimento de métodos de imagem, como a microscopia de dois fótons (2PM) e a histocitometria, possibilitou a observação direta da localização das células nos tecidos. Muitos estudos que mostram a localização relativa das células T e DCs sugerem que ambas estão posicionadas no LN para maximizar a probabilidade de interações T: DC (2, 3). Apesar dos avanços na capacidade de obter imagens e observar células T em LNs, poucos estudos fazem comparações quantitativas diretas de quão intimamente as células T se associam a vários outros tipos de células em LNs.

As células T entram no paracórtex do LN a partir de pequenos vasos sanguíneos pós-capilares denominados vênulas endoteliais altas (HEVs). As células T, DCs e células reticulares fibroblásticas (FRCs) ocupam esta região junto com os vasos sanguíneos (BVs). As células T movem-se entre as DCs, FRCs e outras células T para interagir com as DCs que apresentam o antígeno. FRCs são células do estroma que encapsulam uma rede de condutos de fibra de colágeno que permite o transporte de fluido linfático carregando antígeno solúvel e quimiocinas (4 & # x020137). Os FRCs produzem a quimiocina CCL21, que tem um papel estabelecido no direcionamento de células T na & # x000EFve para o paracórtex dos vasos sanguíneos (8, 9). FRCs também fornecem suporte estrutural necessário para a ativação eficiente de células T (10). Bajenoff et al. mostraram que a rede FRC está intimamente associada às células T na & # x000EFve que se movem dentro do paracórtex, sugerindo que as FRCs podem fornecer uma rede na qual as células T migram (11).

Existem várias hipóteses sobre o papel dos tipos de células individuais na mediação das interações T: DC. HEVs são os pontos de entrada para células T que entram no LN. Girard et al. sugere que as DCs se reúnem perto de HEVs para maximizar sua taxa de contato com as células T de entrada (12). Outros sugeriram que os DCs podem se reunir nas interseções da rede FRC, permitindo que as células T que viajam ao longo das bordas da rede encontrem os DCs em uma taxa aumentada (13 & # x0201316). As interações espaciais entre as células T e os vasos sanguíneos, FRCs e DCs são importantes se mudarem como as células T se movem através do paracórtex e o momento dos encontros com as DCs apresentadoras de antígenos, a etapa chave na ativação das células T e o início do sistema imune adaptativo resposta.

Além de pistas estruturais e celulares, mediadores químicos, incluindo quimiocinas, contribuem para o movimento das células T e contatos T: DC no LN. Por exemplo, a molécula de sinalização LPA produzida por FRCs demonstrou mediar o movimento rápido de células T em LNs (17). Além disso, o receptor de quimiocina C & # x02013C tipo 7 (CCR7), o receptor que reconhece CCL21, é importante para a motilidade de células T de alta velocidade no LN (18, 19). Enquanto o CCR7 aumenta a velocidade de movimento das células T em LNs, se o CCR7 impacta os contatos T: DC não foi investigado.

Compreender a contribuição dos componentes LN celulares e estruturais para a localização das células T requer uma métrica quantitativa que permite comparações diretas de associações espaciais de vários tipos de células. Vários outros grupos relataram relações espaciais entre células e estruturas usando métodos como a inspeção visual (12, 20) e a comparação dos ângulos de rotação dos movimentos das células T com as estruturas (11, 21). No entanto, nenhum deles compara diretamente as associações entre vários tipos de células ou estruturas com uma métrica quantitativa consistente.

Neste estudo, usamos o coeficiente de correlação de Pearson [PCC (22, 23)] e também a Informação mútua [MI (24)] para comparar a associação espacial de vários tipos e estruturas celulares. O PCC mede a covariância de intensidades de pixel homólogo e tem sido freqüentemente usado para determinar a co-localização, particularmente de proteínas fluorescentes, em vários sistemas biológicos, incluindo o estudo de células T (25, 26). O PCC e o MI podem ser calculados sem a necessidade de identificar os limites das células individuais, o que pode ser difícil para imagens 2PM.

MI é uma aplicação da entropia de Shannon (que mede a quantidade de incerteza sobre o valor de uma variável aleatória em bits) originalmente definida para entender as limitações no processamento de sinal e comunicação (27). O MI quantifica a redução da incerteza sobre uma variável quando se conhece o valor de outra variável. Ao analisar associações espaciais, medimos a redução na incerteza sobre a localização de um tipo de célula dada a localização de outro tipo de célula. MI tem sido usado com sucesso em outras aplicações de processamento de imagem biomédica, particularmente na medição de semelhança de imagem em raios-X e ressonâncias magnéticas para registro automatizado de imagens (28 & # x0201331). Além disso, MI e outras medidas teóricas da informação são cada vez mais reconhecidas como ferramentas poderosas para a análise de sistemas complexos não lineares, incluindo sistemas biológicos complexos, como o sistema imunológico (32, 33). Neste artigo, usamos MI para quantificar a associação espacial de células T com outros tipos de células (por exemplo, DCs ou FRCs). Usamos MI como uma medida de associação espacial que é independente de tipos específicos de células ou estruturas. Além disso, o MI é teoricamente insensível ao granulação grossa (34). Assim, o MI pode medir a quantidade de dependência espacial de um marcador fluorescente em outro, minimizando o viés de observação. O MI, ao contrário das medidas de distância, como a análise do vizinho mais próximo, é parcimonioso, uma vez que não requer processamento de imagem extenso para remover o ruído do fóton e determinar os limites das células. Em vez disso, o MI pode operar na imagem diretamente, sem a introdução de limites. Em um trabalho preliminar, usamos MI para quantificar a associação de células T e DCs e encontramos menos correspondência entre células T e DCs do que o esperado (35).

No entanto, o MI não é comparável em imagens com diferentes tamanhos e quantidades de fluorescência. Neste estudo, usamos o NMI para normalizar o MI para estar entre 0 e 1 (36 & # x0201339), o que permite comparações quantitativas de associações espaciais entre células fluorescentes em um canal de cor e outro tipo de célula fluorescente em um canal de cor diferente entre os experimentos. Como o PCC e o NMI são métodos baseados em pixels que não correspondem aos tamanhos das células, criamos regiões nas imagens que correspondem às escalas celulares e aplicamos o PCC e o NMI. Analisar regiões, bem como pixels, permite que esses métodos capturem associações em escalas biologicamente relevantes. Ambas as análises regionais de PCC e NMI mostram que as células T se associam muito menos com seus alvos finais, DCs, do que com FRCs. Nossos resultados também mostram que CCR7 não aumenta a associação de células T com DCs.


Biomarcador para síndrome de fadiga crônica identificado

Cientistas de Stanford desenvolveram um teste com base no sangue que identificou com precisão as pessoas com síndrome da fadiga crônica, relata um novo estudo.

Ron Davis é o autor sênior de um artigo que descreve um exame de sangue que pode identificar a síndrome da fadiga crônica.
Steve Fisch

Pessoas que sofrem de uma doença debilitante e frequentemente reduzida, conhecida como síndrome da fadiga crônica, podem em breve ter algo que procuram há décadas: uma prova científica de sua doença.

Pesquisadores da Escola de Medicina da Universidade de Stanford criaram um exame de sangue que pode sinalizar a doença, que atualmente carece de um teste diagnóstico padrão e confiável.

“Muitas vezes, esta doença é categorizada como imaginária”, disse Ron Davis, PhD, professor de bioquímica e genética. Quando os indivíduos com síndrome da fadiga crônica procuram a ajuda de um médico, eles podem passar por uma série de testes que verificam as funções hepática, renal e cardíaca, bem como a contagem de células do sangue e do sistema imunológico, disse Davis. “Todos esses testes diferentes normalmente orientariam o médico em relação a uma doença ou outra, mas para pacientes com síndrome de fadiga crônica, todos os resultados voltam ao normal”, disse ele.

O problema, disse ele, é que eles não estão olhando profundamente o suficiente. Agora, Davis Rahim Esfandyarpour, PhD, um ex-associado de pesquisa de Stanford e seus colegas desenvolveram um teste de sangue que identificou com sucesso os participantes de um estudo com a síndrome da fadiga crônica. O teste, que ainda está em fase piloto, é baseado em como as células imunológicas de uma pessoa respondem ao estresse. Com amostras de sangue de 40 pessoas - 20 com síndrome da fadiga crônica e 20 sem - o teste produziu resultados precisos, sinalizando com precisão todos os pacientes com síndrome da fadiga crônica e nenhum dos indivíduos saudáveis.

A plataforma de diagnóstico pode até ajudar a identificar possíveis medicamentos para tratar a síndrome da fadiga crônica. Ao expor as amostras de sangue dos participantes a candidatos a drogas e repetir o teste de diagnóstico, os cientistas poderiam ver se a droga melhorava a resposta das células imunológicas. A equipe já está usando a plataforma para rastrear drogas em potencial que eles esperam que possam ajudar as pessoas com síndrome de fadiga crônica no futuro.

Um artigo descrevendo os resultados da pesquisa foi publicado online em 29 de abril no Anais da Academia Nacional de Ciências. Davis é o autor sênior. Esfandyarpour, que agora faz parte do corpo docente da University of California-Irvine, é o autor principal.

Fornecendo a prova

O diagnóstico da síndrome da fadiga crônica, quando de fato é diagnosticado, é baseado em sintomas - cansaço, sensibilidade à luz e dores inexplicáveis, entre outras coisas - e só ocorre depois de eliminadas outras possibilidades de doença. É também conhecida como encefalomielite miálgica e designada pela sigla ME / CFS. Estima-se que 2 milhões de pessoas nos Estados Unidos tenham a síndrome da fadiga crônica, mas isso é um palpite, Davis disse, e provavelmente é muito maior.

Para Davis, a busca por evidências científicas da doença é pessoal. Vem do desejo de ajudar seu filho, que sofre de ME / CFS há cerca de uma década. Na verdade, foi uma pista biológica que Davis identificou pela primeira vez em seu filho que o levou a ele e a Esfandyarpour a desenvolver a nova ferramenta de diagnóstico.

A abordagem, da qual Esfandyarpour liderou o desenvolvimento, emprega um “ensaio nanoeletrônico”, que é um teste que mede mudanças em quantidades minúsculas de energia como um substituto para a saúde das células do sistema imunológico e do plasma sanguíneo. A tecnologia de diagnóstico contém milhares de eletrodos que criam uma corrente elétrica, bem como câmaras para armazenar amostras simplificadas de sangue compostas por células do sistema imunológico e plasma. Dentro das câmaras, as células imunológicas e o plasma interferem na corrente, mudando seu fluxo de uma ponta a outra. A mudança na atividade elétrica está diretamente relacionada com a saúde da amostra.

A ideia é estressar as amostras de pacientes saudáveis ​​e doentes usando sal e, em seguida, comparar como cada amostra afeta o fluxo da corrente elétrica. Mudanças na corrente indicam mudanças na célula: quanto maior a mudança na corrente, maior a mudança no nível celular. Uma grande mudança não é uma coisa boa, é um sinal de que as células e o plasma estão se debatendo sob estresse e incapazes de processá-lo adequadamente. Todas as amostras de sangue de pacientes com EM / CFS criaram um pico claro no teste, enquanto as de controles saudáveis ​​retornaram dados relativamente uniformes.

“Não sabemos exatamente por que as células e o plasma estão agindo dessa forma, ou mesmo o que estão fazendo”, disse Davis. “Mas há evidências científicas de que esta doença não é uma invenção da mente de um paciente. Vemos claramente uma diferença na forma como as células imunológicas da síndrome da fadiga crônica e saudável processam o estresse. ” Agora, Esfandyarpour e Davis estão expandindo seu trabalho para confirmar as descobertas em uma coorte maior de participantes. O recrutamento para o projeto maior, que visa confirmar ainda mais o sucesso do teste diagnóstico, está sendo feito de forma contínua. Os interessados ​​em participar devem entrar em contato com a coordenadora de pesquisa clínica Anna Okumu.

Dobrando

Além de diagnosticar EM / CFS, os pesquisadores também estão aproveitando a plataforma para triagem de tratamentos à base de medicamentos, já que atualmente as opções são mínimas. “Usando o ensaio de nanoeletrônica, podemos adicionar doses controladas de muitas drogas potencialmente terapêuticas diferentes às amostras de sangue do paciente e executar o teste de diagnóstico novamente”, disse Esfandyarpour.

Se as amostras de sangue colhidas daqueles com EM / CFS ainda respondem mal ao estresse e geram um pico na corrente elétrica, então a droga provavelmente não funcionou. Se, no entanto, uma droga parece atenuar o salto na atividade elétrica, isso pode significar que está ajudando as células imunológicas e o plasma a processar melhor o estresse. Até agora, a equipe já encontrou um candidato a medicamento que parece restaurar a função saudável das células imunológicas e do plasma quando testado no ensaio. A droga, embora seja bem-sucedida no ensaio, não está sendo usada atualmente em pessoas com EM / CFS, mas Davis e Esfandyarpour têm esperança de poder testar sua descoberta em um ensaio clínico no futuro.

Todos os medicamentos em teste já foram aprovados pela Food and Drug Administration ou em breve estarão amplamente acessíveis ao público, o que é fundamental para o rápido acesso e disseminação caso algum desses compostos dê certo.

Outros autores de Stanford do estudo são os cientistas pesquisadores Mohsen Nemat-Gorgani e Julie Wilhelmy e o assistente de pesquisa Alex Kashi.

O estudo foi financiado pela Open Medicine Foundation. Davis é o diretor do conselho consultivo científico da fundação.

Os departamentos de Genética e Bioquímica de Stanford também apoiaram o trabalho.


Introdução

O estresse é definido como um processo no qual as demandas ambientais sobrecarregam a capacidade adaptativa de um organismo, resultando tanto em demandas psicológicas quanto em mudanças biológicas que podem colocar em risco de adoecimento (1). Coisas que nos causam estresse são chamadas de estressores. O estresse afeta a todos, jovens e velhos, ricos e pobres. A vida está cheia de estresse. O estresse é um fato da vida com o qual todos devemos lidar. Ele vem em todas as formas e tamanhos, até mesmo nossos pensamentos podem nos causar estresse e tornar o corpo humano mais suscetível a doenças. Existem três teorias ou perspectivas a respeito do estresse, estresse ambiental, estresse psicológico (emocional) e estresse biológico (1). A perspectiva do estresse ambiental enfatiza a avaliação de situações ou experiências ambientais que estão objetivamente relacionadas a demandas adaptativas substanciais. A perspectiva do estresse psicológico enfatiza as avaliações subjetivas das pessoas sobre sua capacidade de lidar com as demandas apresentadas a elas por certas situações e experiências. Finalmente, a perspectiva do estresse biológico enfatiza a função de certos sistemas fisiológicos do corpo que são regulados por condições psicológicas e fisicamente exigentes.

A relação entre estresse e doença é complexa. A suscetibilidade ao estresse varia de pessoa para pessoa. Um evento que causa doença em uma pessoa pode não causar doença em outra pessoa. Os eventos devem interagir com uma ampla variedade de fatores de fundo para se manifestarem como uma doença. Entre os fatores que influenciam na suscetibilidade ao estresse estão a vulnerabilidade genética, o estilo de enfrentamento, o tipo de personalidade e o suporte social. Quando somos confrontados com um problema, avaliamos a gravidade do problema e determinamos se temos ou não os recursos necessários para lidar com o problema. Se acreditarmos que o problema é grave e não possuirmos os recursos necessários para enfrentá-lo, nos perceberemos como estando sob estresse (2). É nossa maneira de reagir às situações que faz diferença em nossa suscetibilidade à doença e em nosso bem-estar geral.

Nem todo estresse tem efeito negativo. Quando o corpo tolera o estresse e o usa para superar a letargia ou melhorar o desempenho, o estresse é positivo, saudável e desafiador. Hans Selye (3), um dos pioneiros do estudo moderno do estresse, chamou isso eustress. O estresse é positivo quando nos força a nos adaptar e, assim, aumentar a força de nossos mecanismos de adaptação, nos avisa que não estamos lidando bem e que uma mudança no estilo de vida é necessária se quisermos manter uma saúde ótima. Este estresse intensificador de ação dá ao atleta a vantagem competitiva e ao orador o entusiasmo para projetar da melhor forma. O estresse é negativo quando excede nossa capacidade de enfrentamento, cansa os sistemas do corpo e causa problemas físicos ou comportamentais. Este estresse prejudicial é chamado sofrimento. A angústia produz reações exageradas, confusão, baixa concentração e ansiedade de desempenho e geralmente resulta em desempenho inferior. A Figura 1 ilustra esse conceito.

Eustress é o estresse intensificador de ação que dá aos atletas a vantagem competitiva

Há uma preocupação crescente com o aumento do custo e da prevalência de transtornos relacionados ao estresse, especialmente em relação ao local de trabalho. & # x0201cTrabalhou até a morte, abandone a morte, trabalhe até cair & # x0201d são destacados & # x0201morte relacionada ao trabalho & # x0201d no século 21. Países famosos por suas longas horas de trabalho sabem disso muito bem. Japão e China têm, cada um, uma palavra para morte por excesso de trabalho & # x02013 Karoshi e Guolaosi respectivamente. Tanto o Japão quanto a Coréia reconhecem o suicídio como uma condição oficial e compensável relacionada ao trabalho (4). A prevalência estimada de estresse e condições relacionadas ao estresse no Reino Unido aumentou de 829 casos por 100.000 trabalhadores em 1990 para 1.700 por 100.000 em 2001/2002. Naquele ano, 13,4 milhões de dias de trabalho perdidos foram atribuídos a estresse, ansiedade ou depressão, com uma estimativa de 265 mil novos casos de estresse. A última análise do HSE (Health and Safety Executive) da taxa de doenças autorreferidas revelou que o estresse, a depressão ou a ansiedade afetam 1,3% da força de trabalho (5). Estima-se que 80% a 90% de todos os acidentes industriais estão relacionados a problemas pessoais e incapacidade dos funcionários em lidar com o estresse (6). A Agência Europeia para a Segurança e Saúde no Trabalho relatou que cerca de 50% do absentismo laboral é causado por stress (7).

A morbimortalidade por doenças relacionadas ao estresse é alarmante. O estresse emocional é o principal fator que contribui para as seis principais causas de morte nos Estados Unidos: câncer, doença coronariana, lesões acidentais, distúrbios respiratórios, cirrose hepática e suicídio. De acordo com estatísticas da Meridian Stress Management Consultancy no Reino Unido, quase 180.000 pessoas no Reino Unido morrem a cada ano de alguma forma de doença relacionada ao estresse (7). O Centro de Controle e Prevenção de Doenças dos Estados Unidos estima que o estresse é responsável por cerca de 75% de todas as consultas médicas (7). Isso envolve uma gama extremamente ampla de queixas físicas, incluindo, mas não se limitando a dor de cabeça, dor nas costas, problemas cardíacos, dor de estômago, úlcera estomacal, problemas de sono, cansaço e acidentes. De acordo com notícias de Saúde e Segurança Ocupacional e do Conselho Nacional de Compensação de Seguros, até 90% de todas as visitas a médicos de atenção primária são para queixas relacionadas ao estresse.

Estresse e o sistema imunológico

Nosso sistema imunológico é outra área suscetível ao estresse. Muito do que sabemos sobre a relação entre o cérebro, o sistema nervoso e a resposta imunológica veio do campo da psiconeuroimunologia (PNI). PNI foi desenvolvido em 1964 pelo Dr. Robert Ader, Diretor da Divisão de Medicina Comportamental e Psicossocial da Universidade de Rochester. A psiconeuroimunologia é o estudo da intrincada interação da consciência (psico), cérebro e sistema nervoso central (neuro), e a defesa do corpo contra infecções externas e divisão celular aberrante (imunologia) (8). Mais especificamente, é dedicado a compreender as interações entre o sistema imunológico, o sistema nervoso central e o sistema endócrino. Embora seja uma disciplina médica relativamente nova, as raízes filosóficas da conexão entre a saúde física, o cérebro e as emoções podem ser atribuídas a Aristóteles.

As respostas imunes são reguladas por antígenos, anticorpos, citocinas e hormônios. Os linfócitos são os principais responsáveis ​​por orquestrar as funções do sistema imunológico. O sistema imunológico tem cerca de 1 trilhão de linfócitos. Os linfócitos que crescem e amadurecem no timo são chamados Células T outros linfócitos são chamados Células B. As células B secretam anticorpos, substâncias químicas que combinam com invasores específicos chamados antígenos (imunidade humoral). As células T não secretam anticorpos, mas atuam como mensageiros e assassinos, localizando e destruindo antígenos invasores (imunidade celular). Algumas células T, chamadas ajudantes, ajudam a ativar a produção de outras células T e B. Outras células T, chamadas supressores, pare a produção de antígenos, interrompendo o ataque. O número de células T e B deve ser equilibrado para que funcionem com eficácia. Quando a proporção de células T para B está desequilibrada, a resposta imunológica fica comprometida e não funciona de maneira eficaz. Outros produtos químicos importantes produzidos pelo sistema imunológico são macrófagos, monócitos e granulócitos. Esses produtos químicos envolvem, destroem e digerem microorganismos invasores e outros antígenos. Conhecido geralmente como fagócitos, eles se unem a mais de 20 tipos de proteínas que compõem o sistema imunológico e o sistema complemento # x02019s. Esse sistema é acionado por anticorpos que se fixam em antígenos, que causam reações inflamatórias.

Citocinas são moléculas mensageiras não-anticorpos de uma variedade de células do sistema imunológico. As citocinas estimulam a liberação celular de compostos específicos envolvidos na resposta inflamatória. Eles são feitos por muitas populações de células, mas os produtores predominantes são células T auxiliares (Th) e macrófagos. As citocinas Th1 e Th2 inibem uma a outra & # x02019s produção e função: as células Th1 estimulam a imunidade celular e suprimem a imunidade humoral, enquanto as citocinas Th2 têm efeito oposto. Citocinas é um nome geral, outro nome específico inclui linfocinas (citocinas produzidas por linfócitos), quimiocinas (citocinas com atividades quimiotáticas), interleucina (IL) (citocinas produzidas por um leucócito e atuando em outros leucócitos) e interferon (IFN) (liberação de citocinas por célula invadida por vírus que leva a célula circundante a produzir enzimas que interferem na replicação viral).

As citocinas são produzidas de novo em resposta a um estímulo imunológico. Eles geralmente atuam em distâncias curtas e intervalos de tempo curtos e em concentração muito baixa. Eles agem ligando-se a receptores de membrana específicos, que então sinalizam à célula por meio de um segundo mensageiro, geralmente tirosina quinases, para alterar seu comportamento (expressão gênica). As respostas às citocinas incluem aumentar ou diminuir a expressão de proteínas de membrana (incluindo receptores de citocinas), proliferação e secreção de moléculas efetoras. O maior grupo de citocinas estimula a proliferação e diferenciação de células imunes. Alguns antígenos bacterianos comuns ativam o complemento e estimulam os macrófagos a expressarem moléculas coestimulatórias. Os antígenos estimulam a resposta imune adaptativa ao ativar os linfócitos, que por sua vez produzem anticorpos para ativar o complemento e as citocinas para aumentar a eliminação do antígeno e recrutar leucócitos adicionais.

Vários estudos têm mostrado que o estresse crônico exerce um efeito imunossupressor geral que suprime ou retém a capacidade do corpo de iniciar uma reação imunológica rápida e eficiente (9,10). Isso tem sido atribuído à abundância de corticosteroides produzidos durante o estresse crônico, que produz um desequilíbrio nos níveis de corticosteroides e enfraquece a imunocompetência. Acredita-se que esse enfraquecimento da função imunológica esteja associado à tensão geral nas várias partes do corpo associadas à produção e manutenção do sistema imunológico. Por exemplo, a atrofia do timo ou o encolhimento do timo resulta em sua incapacidade de produzir células T ou os hormônios necessários para estimulá-las. Isso pode levar a um desequilíbrio e ineficiência de toda a resposta imunológica. Isso é consistente com a descoberta de que, à medida que envelhecemos, estamos propensos a sofrer de infecções, câncer, hipersensibilidade e autoimunidade.

Em uma meta-análise de 293 estudos independentes relatados em periódico científico revisado por pares entre 1960 e 2001, com cerca de 18.941 participantes, é confirmado que o estresse altera a imunidade (11). O estresse de curto prazo, na verdade, estimula o sistema imunológico enquanto ele se prepara para enfrentar e superar um desafio, como uma resposta adaptativa preparando-se para uma lesão ou infecção, mas o estresse de longo prazo ou crônico causa muito desgaste e o sistema irá quebrar especialmente se o indivíduo tem pouco controle sobre os eventos. As análises (11) revelaram que a maioria dos estressores crônicos que mudam as identidades ou papéis sociais das pessoas estão mais além de seu controle e parecem intermináveis ​​& # x02013 foram associados à expressão mais global de imunidade - quase todas as medidas da função imunológica caíram em toda a linha. A duração do estresse também desempenha um papel. Quanto mais longo o estresse, mais o sistema imunológico mudou de mudanças potencialmente adaptativas (como aquelas na resposta de lutar ou fugir) para mudanças potencialmente prejudiciais, primeiro na imunidade celular e depois na função imunológica mais ampla. Eles também descobriram que o sistema imunológico de pessoas mais velhas ou já doentes está mais sujeito a mudanças relacionadas ao estresse.

A ligação entre estresse e doença

O fator crítico associado ao estresse é seu efeito crônico ao longo do tempo. Os estressores crônicos incluem aborrecimentos diários, frustração de engarrafamentos, sobrecarga de trabalho, dificuldades financeiras, brigas conjugais ou problemas familiares. É claro que há muito mais coisas que podem causar estresse, mas esses são os estressores comumente encontrados na vida diária. A raiva reprimida que guardamos dentro de nós em relação a qualquer uma dessas situações, ou a culpa e o ressentimento que temos em relação aos outros e a nós mesmos, produzem os mesmos efeitos no hipotálamo. Em vez de descarregar esse estresse, entretanto, o mantemos internamente, onde seus efeitos se tornam cumulativos.

A pesquisa mostra que quase todos os sistemas do corpo podem ser influenciados pelo estresse crônico. Quando o estresse crônico não é liberado, ele suprime o sistema imunológico do corpo e, por fim, se manifesta como doença. Só podemos imaginar o que aconteceria com o corpo se ele permanecesse na resposta de luta ou fuga. Felizmente, em circunstâncias normais, três minutos depois que uma situação ameaçadora passa e o perigo real ou imaginário é removido, a resposta de lutar ou fugir diminui e o corpo relaxa e retorna ao seu estado normal. Durante esse período, a frequência cardíaca, a pressão arterial, a respiração, a tensão muscular, a digestão, o metabolismo e o sistema imunológico voltam ao normal. Se o estresse persistir após a reação inicial de luta ou fuga, a reação do corpo entra em um segundo estágio. Durante este estágio, a atividade se o sistema nervoso simpático declina e a secreção de adrenalina é diminuída, mas a secreção de corticosteroides continua acima dos níveis normais. Finalmente, se o estresse continuar e o corpo não for capaz de lidar com a situação, é provável que haja esgotamento dos recursos corporais.

Doenças médicas

Na asma, tanto fatores externos quanto internos estão envolvidos, é o fator interno mais afetado pelos efeitos agudos de estressores psicológicos. A terapia familiar está amplamente incorporada no manejo de crianças asmáticas. A melhora é atribuída à minimização da interação com os pais que produzia frequente situação estressante. Além disso, os asmáticos expostos a uma substância inofensiva que pensavam ser alérgica desencadeariam um ataque grave (12). Um estudo de Gauci et al. (13) demonstraram correlações positivas significativas entre algumas escalas relacionadas à angústia do Inventário Multifásico de Personalidade de Minnesota (MMPI) e a reatividade da pele em resposta a alérgenos. Coletivamente, esses dados fornecem evidências de uma associação clara entre estresse, disfunção imunológica e atividade clínica da doença atópica e asmática. Para referência futura, Liu et al. (14) forneceram evidências excelentes de que o estresse pode aumentar a resposta inflamatória alérgica.

Sabe-se que doenças gastrointestinais, como úlcera péptica (UP) e colite ulcerativa (UC), são muito influenciadas pelo estresse. PU ocorre duas vezes mais em controladores de tráfego aéreo do que em copilotos civis e ocorre com mais frequência entre controladores de tráfego aéreo em centros de alto estresse (Chicago O & # x02019Hare, La Guardia, JFK e Aeroporto Internacional de Los Angeles) do que centros de baixo estresse (aeroportos em cidades menos populosas na Virgínia, Ohio, Texas e Michigan). Embora o estresse seja um fator de risco na UP, acredita-se que mais de 20 outros fatores também estejam associados: tipo sanguíneo, sexo, tipo de antígeno HLA, cirrose alcoólica, hipertensão, doença pulmonar obstrutiva crônica, tabagismo e até mesmo consumo de café, bebida carbonatada ou leite durante a faculdade (12). Certos eventos de vida estressantes foram associados ao início ou à exacerbação dos sintomas em outros distúrbios crônicos comuns do sistema digestivo, como distúrbios gastrointestinais funcionais (FGD), doença inflamatória intestinal (DII) e doença do refluxo gastroesofágico (DRGE). O estresse precoce na forma de abuso também desempenha um papel importante na suscetibilidade de desenvolver FGD, bem como IBD mais tarde na vida (15).

As úlceras são causadas por excesso de ácido estomacal, e estudos com pacientes com fístulas gástricas mostraram que a raiva e a hostilidade aumentam a acidez estomacal, enquanto a depressão e a abstinência a diminuem. Outra teoria correlaciona os efeitos do estresse no desenvolvimento de úlceras ligadas ao revestimento mucoso que reveste o estômago. A teoria afirma que, durante o estresse crônico, a secreção de noradrenalina faz com que os capilares no revestimento do estômago se contraiam.Isso, por sua vez, resulta no desligamento da produção da mucosa, e a barreira protetora da mucosa para a parede do estômago é perdida. Sem a barreira protetora, o ácido clorídrico rompe o tecido e pode até atingir os vasos sanguíneos, resultando em úlcera hemorrágica (16). No entanto, foi descoberto recentemente que muitos casos de úlceras são causados ​​por uma bactéria chamada Helicobacter pylori (H. pylori) (17). Embora o mecanismo exato pelo qual causa úlceras seja desconhecido, acredita-se que H. pylori inflama o revestimento gastrointestinal, estimula a produção de ácido ou ambos.

A doença coronariana (DCC) há muito é considerada uma doença psicossomática clássica, pois seu início ou curso foi influenciado por uma variedade de variáveis ​​psicossociais. Os aspectos psicossociais da DAC foram estudados extensivamente e há fortes evidências de que o estresse psicológico é um fator de risco significativo para DAC e mortalidade por DCC (18,19,20,21). Tennant (19) encontrou uma relação positiva entre estresse vital e infarto cardíaco e morte súbita enquanto o estudo de Rosengren et al. (20) relataram que a mortalidade por DAC aumentou duas vezes para homens que experimentaram três ou mais eventos de vida anteriores. O estudo INTERHEART (21) revelou que pessoas com infarto do miocárdio relataram maior prevalência de quatro fatores de estresse: estresse no trabalho e em casa, estresse financeiro e eventos importantes da vida no último ano.

Embora as evidências que apóiam uma associação entre o comportamento do tipo A (agressivo, competitivo, voltado para o trabalho e urgente) e a CC sejam conflitantes (22), alguns estudos descobriram que os indivíduos do tipo A geram eventos de vida mais estressantes e são mais propensos do que outros a interpretar os encontrados. evento de vida de forma emocionalmente adversa (23, 24). Se o tipo A for um fator de risco, ele pode não operar por meio de uma disfunção fisiológica de longo prazo (levando à aterogênese), mas por meio de eventos agudos de vida que provocam uma grande tensão no coração. Um dos componentes do comportamento do Tipo A é a hostilidade, que pode estar relacionada ao risco de CHD. Alguns estudos (25, 26) observaram que os eventos clínicos de DCC são previstos pela hostilidade e isso parece ser independente de outros fatores de risco. A hostilidade também foi relacionada à aterosclerose em alguns estudos de angiografia (27,28). Outros estudos descobriram que a supressão da raiva estava associada a eventos de DC (29) e aterosclerose (27,28). Revisando esses achados, Tennant (30) concluiu que surge a possibilidade de que a hostilidade (ou sua supressão) possa ter algum papel na DCC, embora o mecanismo não seja claro.

Os três principais fatores de risco comumente considerados associados à DCC são hipercolesterolemia, hipertensão e tabagismo. Na tentativa de determinar as causas do aumento dos níveis de colesterol sérico, Friedman et al. (31) conduziram uma das primeiras investigações da relação entre estresse e colesterol sérico. Eles descobriram que o estresse é uma das causas do aumento dos níveis de colesterol sérico. Outros pesquisadores que estudaram estudantes de medicina frente ao estresse do exame (32) e piloto militar no início do período de treinamento e exames (33) verificaram os achados. Como a pressão arterial e o colesterol sérico aumentam durante o estresse, há muito se suspeita da relação entre o estresse e a hipertensão, o estresse emocional é geralmente considerado um fator importante na etiologia da hipertensão (34). Uma das primeiras evidências dessa relação veio do estudo massivo de 1.600 pacientes hospitalares por Dunbar (35). Ele descobriu que certos traços de personalidade eram característicos de pacientes hipertensos, por exemplo, eles eram facilmente perturbados por críticas ou imperfeições, possuíam raiva reprimida e falta de autoconfiança. Reconhecendo essa relação, os programas educacionais para pacientes hipertensos incluem o gerenciamento do estresse.

Parece que algumas pessoas são hereditariamente suscetíveis à artrite reumatóide (AR). Aproximadamente metade das pessoas que sofrem dessa condição têm uma proteína do sangue chamada fatores reumatóides (FR), que é rara em pessoas sem artrite. Como a AR envolve o corpo girando sobre si mesmo (uma resposta autoimune), foi hipotetizado que uma personalidade autodestrutiva pode se manifestar por meio dessa doença (16). Embora as evidências que sustentam essa hipótese não sejam conclusivas, vários pesquisadores encontraram diferenças de personalidade entre quem sofre de AR e outras pessoas. As pessoas afetadas por esta doença são perfeccionistas e abnegadas, masoquistas e autoconscientes. Pacientes do sexo feminino eram nervosas, temperamentais e deprimidas, com histórico de rejeição pelas mães e pais severos. Foi sugerido que pessoas com FR que vivenciam estresse crônico tornam-se suscetíveis à AR (16). O mau funcionamento do sistema imunológico e a predisposição genética para a AR resultam no desenvolvimento da doença.

As enxaquecas são o resultado da constrição e dilatação das artérias carótidas de um lado da cabeça. A fase de constrição, chamada pródromo, está frequentemente associada à sensibilidade à luz ou ruído, irritabilidade e rubor ou palidez da pele. Quando ocorre a dilatação das artérias, certos produtos químicos estimulam as terminações nervosas adjacentes, causando dor. A dieta pode precipitar dores de cabeça de enxaqueca em algumas pessoas. No entanto, o pensamento predominante sobre a causa da enxaqueca diz respeito ao estresse e à tensão emocionais. Sensação de ansiedade, nervosismo, raiva ou fúrias reprimidas estão associadas à enxaqueca. Um ataque pode ser abortado quando o indivíduo dá vazão à personalidade subjacente (8). Um típico sofredor de enxaqueca é perfeccionista, ambicioso, rígido, ordeiro, excessivamente competitivo e incapaz de delegar responsabilidades.

Também há evidências de que experiências emocionalmente estressantes estão associadas a distúrbios endócrinos, como diabetes mellitus (36). Os estressores físicos ou psicológicos podem alterar as necessidades de insulina. Os estressores podem frequentemente ser responsáveis ​​por episódios de perda de controle, especialmente em crianças diabéticas. O diabetes tipo II é mais frequentemente afetado pelo estresse, pois tende a ocorrer em adultos com sobrepeso e é uma forma menos grave de diabetes (12). Além disso, crianças que tiveram eventos de vida estressantes decorrentes de perdas reais ou ameaçadoras dentro da família e ocorrendo entre as idades de 5 e 9 anos tiveram um risco significativamente maior de diabetes tipo I.

O estresse agudo pode suprimir o anticorpo específico do vírus e as respostas das células T à vacina contra hepatite B (37). Pessoas que apresentam respostas insatisfatórias às vacinas apresentam taxas mais altas de doenças, incluindo infecção pelo vírus da influenza. Existem vários outros estudos que demonstraram uma relação entre o estresse psicológico e a suscetibilidade a vários vírus do resfriado (38,39). Isso não é surpreendente, já que o estresse suprime os vírus latentes do sistema imunológico, então têm mais facilidade para ressurgir, uma vez que o corpo não pode mais se defender. As tentativas de encontrar uma associação entre o estresse e a progressão da doença em pacientes com a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) encontraram resultados conflitantes (40). A análise do estudo multicêntrico de coorte de AIDS não conseguiu observar uma associação entre a depressão e o declínio dos linfócitos T CD4 +, progressão da doença ou morte (41), mas outros encontraram associação significativa entre parâmetros imunológicos que refletem a progressão do HIV e fatores psicossociais, particularmente negação e angústia (42) e ocultação da identidade homossexual (43).

Doença psiquiátrica

Um grande número de pesquisas nas últimas quatro décadas forneceu evidências de que eventos de vida recentes contribuem para o aparecimento de doenças psiquiátricas (44). A associação entre eventos de vida estressantes e doenças psiquiátricas é mais forte do que a associação com doenças físicas ou médicas. Vincent e Roscenstock (45) descobriram que antes da hospitalização, os pacientes com transtornos psiquiátricos haviam sofrido eventos mais estressantes do que aqueles com transtornos físicos. Enquanto isso, Andrew e Tennant (46) não conseguiram encontrar a associação entre estresse e doença física. Embora a relação exata entre estresse e doença psiquiátrica não seja clara, o caminho final é bioquímico. Tal como acontece com a doença médica, o modelo apropriado é o de causas multifatoriais. A maioria das pesquisas de eventos de vida indica um limite de 6 meses para considerar um estresse com efeito significativo sobre a doença. Depois disso, o efeito do estresse diminui com o tempo.

Os eventos recentes da vida têm um papel etiológico importante nas neuroses, um papel formativo no início da depressão neurótica (doença depressiva mista) e um papel precipitante em episódios esquizofrênicos (47). Em outras palavras, a associação de estresse com doença psiquiátrica é a mais forte nas neuroses, seguida pela depressão e a esquizofrenia é a menos. A correlação entre neuroses e esquizofrenia com estresse é mais clara. A fraca associação entre eventos estressantes da vida e o aparecimento de doenças psicóticas, particularmente esquizofrenia, foi demonstrada em alguns estudos (48,49,50), em contraste com a forte associação entre estresse e neuroses (51,52, 53,54). No entanto, o grau de relação entre a doença depressiva e as neuroses em relação ao estresse é bastante controverso. Nem Paykel (55) nem Brown et al. (56) descobriram que a relação entre o estresse causado por eventos vitais e a doença é maior para a depressão neurótica do que para a depressão unipolar (endógena).

Bebbington et al. (57) constataram que há um excesso de eventos de vida precedendo o aparecimento de todos os tipos de psicoses, principalmente nos primeiros 3 meses. No estudo do início recente de esquizofrenia, transtorno esquizofreniforme e hipomania, Chung et al. (49) descobriram que eventos de vida ameaçadores estavam significativamente relacionados ao início da psicose esquizofreniforme, mas não à esquizofrenia. Eles também descobriram que eventos ameaçadores podem precipitar episódios hipomaníacos. Outro estudo (50) descobriu que indivíduos com esquizofrenia não experimentam eventos de vida mais estressantes do que controles normais, mas relataram maior estresse subjetivo. Um estudo que investigou a relação entre eventos de vida recentes e episódios de doença na esquizofrenia descobriu que, episódios iniciais ou precoces de esquizofrenia têm maior probabilidade de estar associados a eventos de vida recentes do que episódios posteriores (48).

Por outro lado, os transtornos bipolares receberam menos estudos do que os unipolares. No transtorno bipolar, o efeito dos eventos de vida é geralmente mais fraco do que o unipolar, no entanto, eventos de vida importantes podem ser importantes no início (58). Os fatores causais nos transtornos bipolares são multifatoriais e complexos, e o fator genético parece influenciar a exposição aos eventos de vida. Aqueles com maior carga genética, ocorreram menos eventos de vida estressantes antes do primeiro episódio e tiveram o início mais precoce da doença. Vários estudos têm mostrado que o início da depressão é frequentemente precedido por eventos de vida estressantes (59,60). Eventos estressantes na vida, juntamente com dificuldades menores recentes, também foram identificados como preditores de um episódio de depressão em um estudo com gêmeas monozigóticas. Kessler (61), que chegou à mesma conclusão, acrescentou que há evidências de que o estresse crônico concomitante aumenta o efeito de eventos importantes da vida sobre a depressão.

Cooper e Sylph (51) documentaram o papel dos eventos da vida na causa da doença neurótica. Eles descobriram que o grupo neurótico relatou 50% mais eventos estressantes do que o grupo controle. McKeon et al. (52) descobriram que pacientes com neuroses obsessivo-compulsivas que têm traços de personalidade anormais (obsessivo, ansioso e autoconsciente) experimentaram significativamente menos eventos de vida do que aqueles sem esses traços. Zheng e Young (53), comparando o estresse de eventos ao vivo entre pacientes neuróticos e o controle normal, descobriram que os pacientes neuróticos tinham um nível significativamente mais alto de estresse e experimentaram mais mudanças de eventos de vida do que o grupo de controle. Rajendran et al. (54) que compararam os executivos neuróticos com executivos saudáveis ​​como um grupo de controle, encontraram diferenças significativas entre os grupos normais e neuróticos em termos de frequência dos eventos de vida, bem como o estresse que experimentaram devido a esses eventos de vida.

Estresse e câncer

A relação entre câncer de mama e estresse tem recebido atenção especial. Alguns estudos indicaram um aumento na incidência de morte precoce, incluindo morte por câncer entre pessoas que sofreram a perda recente de um cônjuge ou ente querido. Alguns estudos com mulheres com câncer de mama mostraram uma taxa significativamente alta de doença entre as mulheres que tiveram eventos traumáticos na vida e perderam a doença vários anos antes de seu diagnóstico. No entanto, a maioria dos cânceres se desenvolve há muitos anos e são diagnosticados somente depois de terem crescido no corpo por um longo tempo. Assim, esse fato contrapõe-se a uma associação entre a morte de um ente querido e o desencadeamento do câncer. Não há evidências científicas de uma relação direta de causa e efeito entre essas alterações no sistema imunológico e o desenvolvimento do câncer. Não foi demonstrado que as mudanças induzidas pelo estresse no sistema imunológico causam diretamente o câncer. No entanto, mais pesquisas são necessárias para descobrir se existe uma relação entre o estresse psicológico e a transformação de células normais em células cancerosas. Uma área que está sendo estudada atualmente é se as intervenções psicológicas podem reduzir o estresse em pacientes com câncer, melhorar a função imunológica e possivelmente até prolongar a sobrevida.

Estudos em animais, principalmente ratos, revelaram a ligação entre o estresse e a progressão de tumores cancerígenos. O estresse crônico e agudo, incluindo cirurgia e perturbações sociais, parece promover o crescimento do tumor. É fácil fazer essa pesquisa em animais, mas é mais difícil com humanos. Além disso, as interações de muitos sistemas que afetam o câncer, do sistema imunológico ao sistema endócrino, juntamente com fatores ambientais que são impossíveis de controlar, tornam extremamente difícil definir o papel do estresse. Além disso, os pesquisadores não podem expor as pessoas a células tumorais como fazem com os animais. Um estudo recente (62) descobriu que havia uma ligação entre estresse, desenvolvimento de tumor e um tipo de glóbulos brancos chamados células assassinas naturais (NK). De todas as células do sistema imunológico, as células NK mostraram as ligações mais fortes para combater certas formas da doença, especificamente prevenindo metástases e destruindo pequenas metástases. Embora o resultado deste estudo não seja definitivo, ele indica que o estresse atua suprimindo a atividade das células NK. Outro estudo preliminar mostrou a evidência de um sistema imunológico enfraquecido em pacientes com câncer de mama que sentem alto nível de estresse em comparação com aqueles que experimentam menos estresse.

Um novo estudo mostra que o estresse e o suporte social são influências importantes no risco de um homem desenvolver câncer de próstata. Pesquisadores (63) da Universidade Estadual de Nova York em Stony Brook & # x02019s faculdade de medicina descobriram que homens com alto nível de estresse e falta de relacionamentos satisfatórios com amigos e familiares tinham níveis mais elevados de Antígeno Prostático Específico (PSA) no sangue, a marcador para um risco aumentado de desenvolver câncer de próstata. Com base nos resultados, o risco de ter um PSA anormal foi três vezes maior para homens com altos níveis de estresse. Da mesma forma, os homens que sentiam que tinham baixos níveis de apoio de amigos e familiares tinham duas vezes mais chances de ter um PSA anormal. As descobertas levantam a possibilidade de que o estado psicológico de um homem pode ter um impacto direto nas doenças da próstata.


Melhor junto

Em 2001, logo após chegar a Nova York, Formenti assistiu a uma palestra de Sandra Demaria, patologista também da Weill Cornell. Demaria estava estudando lascas de tumores de mama removidos de pacientes que receberam quimioterapia e descobriu que, em algumas pacientes, a quimioterapia fazia com que as células do sistema imunológico inundassem os tumores. Isso fez Formenti se perguntar se a mesma coisa poderia acontecer após a radioterapia.

Além de lutar contra os patógenos causadores de doenças, parte do trabalho do sistema imunológico é manter o controle sobre as células que podem se tornar cancerosas. Por exemplo, as células T citotóxicas matam todas as células que apresentam sinais de mutações relacionadas ao câncer. As células cancerosas se tornam problemáticas quando encontram maneiras de esconder esses sinais ou liberar proteínas que embotam os sentidos das células T. “O câncer é realmente uma falha do sistema imunológico em rejeitar células [formadoras de câncer]”, diz Formenti.

Formenti e Demaria, um colega italiano nativo, rapidamente juntaram forças para determinar se o sistema imunológico estava conduzindo a resposta abscopal. Para testar sua ideia, sua equipe injetou células de câncer de mama em camundongos em dois locais separados, fazendo com que tumores individuais crescessem em ambos os lados do corpo dos animais. Em seguida, eles irradiaram apenas um dos tumores em cada camundongo. A radiação por si só impediu o crescimento do tumor primário, mas não fez muito mais. No entanto, quando os pesquisadores também injetaram uma proteína chamada GM-CSF nos ratos, o tamanho do segundo tumor também foi controlado.

O GM-CSF expande o número de células dendríticas, que atuam como oficiais comandantes das células T, fornecendo instruções sobre onde atacar. Mas o ataque não poderia acontecer a menos que um dos tumores fosse irradiado. “De alguma forma, a radiação inflama o tumor e o torna interessante para o sistema imunológico”, diz Formenti.

Formenti e Demaria sabiam que se suas descobertas se sustentassem em estudos em humanos, então seria possível aproveitar o efeito abscopal para tratar o câncer que se espalhou por todo o corpo.

“A resposta abscopal não é comum, mas nós a vemos, e é muito notável quando acontece.”

Embora a radioterapia seja ótima para reduzir os tumores primários, uma vez que o câncer se espalhou, o tratamento é normalmente reservado para os tumores que estão causando dor aos pacientes. “A radiação é considerada terapia local”, diz Michael Lim, neurocirurgião da Universidade Johns Hopkins, em Baltimore, que está estudando maneiras de combinar radioterapia com imunoterapia para tratar tumores cerebrais. Mas, ele acrescenta, “se você pudesse usar radiação para acender uma resposta sistêmica, ela se tornaria um paradigma totalmente diferente”.

Quando Demaria e Formenti publicaram seus resultados pela primeira vez em 2004, o conceito de usar radiação para ativar a imunidade era difícil de vender. Na época, a pesquisa sobre como a radiação afetava o sistema imunológico se concentrava no uso de altas doses de irradiação de corpo inteiro para derrubar o sistema imunológico de modelos animais. Era contra-intuitivo pensar que o mesmo tratamento usado localmente poderia ativar a imunidade em todo o corpo.

Essa perspectiva, no entanto, mudaria em breve. Em 2003 e 2004, James Hodge, imunologista do National Cancer Institute e seus colegas publicaram dois estudos com camundongos mostrando que, após a radiação, as células tumorais exibiam níveis mais elevados de proteínas que atraem e ativam as células T que matam o câncer. Ficou claro que a radiação não apenas mata as células cancerosas, mas também pode tornar aquelas que não morrem mais atraentes ao ataque imunológico, diz Hodge.

Essa ideia recebeu outro impulso em 2007, quando uma equipe de pesquisa do Instituto de Oncologia Gustave Roussy, perto de Paris, relatou que os danos da radiação fizeram com que células cancerosas de camundongos e humanas liberassem uma proteína que ativa células dendríticas chamadas HMGB1. Eles também descobriram que mulheres com câncer de mama que também carregavam uma mutação que impedia suas células dendríticas de detectar o HMGB1 eram mais propensas a ter metástases nos dois anos após a radioterapia. Além de tornar os tumores mais atraentes para o sistema imunológico, Hodge diz, o dano causado pela radiação também libera pedaços de células cancerosas chamadas antígenos, que então preparam as células imunológicas contra o câncer, como uma vacina.

De certa forma, diz Barker, os oncologistas sempre perceberam que a radiação trabalha de mãos dadas com o sistema imunológico. Por exemplo, quando seus pacientes perguntam para onde vão seus tumores depois de serem irradiados, ele diz que as células imunológicas enxugam os restos de células mortas. “O sistema imunológico atua como o lixeiro”, diz ele.

Agora, os imunologistas tinham evidências de que os lixeiros fazem mais do que limpar o entulho: eles também fazem parte da equipe de demolição e, se pudessem se coordenar em locais de trabalho diferentes, poderiam gerar respostas abscopais. Com a radiação sozinha, isso acontecia muito raramente. “A radiação faz parte desse truque”, diz Formenti. “Mas você realmente precisa ajudar um pouco a radiação.”

Formenti e Demaria já haviam demonstrado em camundongos que essa assistência poderia vir na forma de imunoterapia com GM-CSF e, em 2003, começaram a testar sua teoria em pacientes. Eles trataram 26 pacientes com câncer metastático que estavam sendo submetidos a tratamento de radiação com GM-CSF. Os pesquisadores então usaram tomografias computadorizadas para rastrear os tamanhos dos tumores não irradiados ao longo do tempo. Em junho passado, eles relataram que o tratamento gerou respostas abscopais em 20% dos pacientes. Pacientes com respostas abscopais tendiam a sobreviver mais, embora nenhum dos pacientes estivesse completamente curado.

Enquanto a equipe de Weill Cornell conduzia seu estudo de GM-CSF, uma nova geração de drogas imunoterapêuticas entrou em cena. Alguns, como o imiquimod, ativam as células dendríticas de uma forma mais direcionada do que o GM-CSF. Outro grupo, os inibidores de checkpoint, liberam os freios do sistema imunológico e das células T em particular, liberando as células T para atacar os tumores.

Em 2005, Formenti e sua equipe descobriram que um determinado inibidor de checkpoint funcionava melhor com radioterapia do que sozinho e mais tarde relataram que a mesma combinação produz respostas abscopais em um modelo de câncer de mama em camundongos.

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Um método baseado em imagem para detectar e quantificar a citotoxicidade mediada por células T de modelos de células alvo 2D e 3D

Autores: Brad Larson, Agilent Technologies, Inc. Wini Luty, Courtney Noah, BioreclamationIVT Olivier Donz & eacute, AdipoGen Life Sciences Glauco R. Souza, University of Texas Health Science Center em Houston e Nano3D Biosciences, Inc.

Resumo

A citotoxicidade mediada por células T desempenha um papel importante em um conjunto de novos métodos que estão sendo desenvolvidos com o objetivo de estimular o sistema imunológico do paciente a combater o câncer. A fim de avaliar e otimizar imunoterapias de células T adotivas, em vitro métodos devem ser incluídos no processo de teste. No procedimento descrito aqui, avaliações fenotípicas e quantitativas de indução necrótica de células alvo 2D e 3D foram feitas usando imagens automatizadas de células vivas. Verificou-se que a ativação direta de células T produziu um efeito citotóxico significativamente maior do que a ativação geral, sugerindo que as células T podem ser "ensinadas" para direcionar e destruir células-alvo específicas.

Introdução

Os linfócitos T citotóxicos CD3 + CD8 + (CTL) são as células efetoras responsáveis ​​pela citotoxicidade mediada por células T que podem atuar por contato célula a célula liberando granzimas e perforina ou por toxicidade mediada por ligante Fas. 1 Como parte do sistema imunológico adaptativo, essas células montam ataques direcionados para livrar o corpo de uma variedade de células comprometidas, como as células cancerosas, sem prejudicar as células saudáveis. O que se opõe a essa defesa natural é o fato amplamente conhecido de que os tumores desenvolvem vários métodos para evitar a detecção imunológica e criar um nível de tolerância contra as células imunológicas destinadas a procurar e destruir células contendo antígenos estranhos. 2 Por muitos anos, o desenvolvimento de tratamentos evitou o uso do sistema imunológico de um paciente para matar células cancerosas, pois os tratamentos baseados em imunoterapia apresentavam várias falhas clínicas. O desenvolvimento de métodos oferece esperança renovada para pacientes com câncer. Técnicas de imunoterapia adotiva ativam células T do paciente e rsquos ex vivo contra antígenos tumorais antes de infundir as células T ativadas de volta no paciente para direcionar e destruir as células tumorais seletivamente. 3

O mais popular em vitro O método para monitorar o efeito de CTL nas células alvo é o ensaio de citotoxicidade mediada por células (CMC), em que as células T e as células alvo são adicionadas a uma microplaca, bem como a uma cocultura. Tradicionalmente, a toxicidade era medida usando a liberação de cromo (51 Cr) de células-alvo pré-carregadas. Devido a problemas com o descarte de radioatividade e baixa sensibilidade devido à liberação espontânea do isótopo das células alvo 4, novos métodos foram desenvolvidos usando métodos ópticos baseados em microplacas gerando luminescência ou fluorescência. Essas técnicas foram otimizadas para detectar o sinal das células alvo plaqueadas em uma monocamada bidimensional (2D) uniforme em poços de microplaca. Com a crescente adaptação de células agregadas em uma configuração tridimensional (3D) para criar uma na VivoComo no modelo, as células não estão mais distribuídas uniformemente no fundo de um poço. Através da incorporação de imagens microscópicas e análise celular, a detecção sensível de citotoxicidade induzida de células alvo em 2D e 3D, bem como a visualização da interação entre CTL e células alvo, pode ser alcançada.

Aqui, demonstramos um método de pesquisa automatizado para monitorar e medir a citotoxicidade mediada por células CTL cineticamente usando microscopia digital de campo amplo. Câncer de mama MDA-MB-231 alvo co-cultivado e células de fibroblastos foram semeadas em formato 2D e 3D e dosadas com um reagente de apoptose / necrose de células vivas. As células T, ativadas usando métodos gerais ou direcionados e coradas com um corante de rastreamento vermelho distante, foram então adicionadas em proporções de 20, 10, 5 ou 0: 1 às células alvo. As placas foram então adicionadas a uma incubadora automatizada e transportadas para o microscópio digital de campo amplo, usando um braço robótico, a cada quatro horas, onde as imagens de campo claro e fluorescente foram capturadas por um total de sete dias. A observação visual das imagens cinéticas permitiu o monitoramento das interações CTL: células-alvo para células em cultura 2D e 3D, enquanto a análise da imagem celular permitiu o cálculo da citotoxicidade induzida por CTL durante todo o período de incubação.

Materiais e métodos

Células e mídia
As células de adenocarcinoma epitelial da mama MDA-MB-231 (número da peça HTB-26) foram obtidas da ATCC (Manassas, VA). Células de fibroblasto dérmico neonatal humano que expressam RFP de forma estável (número de peça cAP-0008RFP) foram adquiridas em Angio-Proteomie (Boston, MA). Células T CD3 + humanas purificadas, isoladas por meio de seleção negativa de células mononucleares de sangue periférico (número da peça HM-PBMC-TCELLCD3-M) foram doadas por BioreclamationIVT (Westbury, NY). DMEM avançado (número de peça 12491-015), meio RPMI 1640 (número de peça 11875-093), soro bovino fetal (número de peça 10437-036) e penicilina-estreptomicilutamina (100X) (número de peça 10378-016) foram adquiridos de ThermoFisher Scientific (Waltham, MA).

Ensaio e componentes experimentais
IL-2 Superkine (Fc) (número da peça AG-40B-0111-C010), anti-CD3 (humano), mAb (UCHT1) (número da peça ANC-144-020) e anti-CD28 (humano), mAb (ANC28 .1 / 5D10) (número de peça ANC-177-020) foram doados por AdipoGen Life Sciences (San Diego, CA). SCREENSTAR 190 e microplacas de filme de ciclo-olefina de 384 poços (GBO part number 789836), CELLSTAR & microClear microplacas de superfície repelente de células de 384 poços (GBO part number 781976) e o 384-Well BiO Assay Kit (GBO part number 781846, consistindo em 2 frascos NanoShuttle-PL, acionamento magnético de levitação de 6 poços, unidades magnéticas de retenção e esferóide de 384 poços (2), placa de mistura de poços profundos de 96 poços, microplacas de superfície repelente de células claras de 6 poços e 384 poços), protótipo de anel de 384 poços Drive e Cell Repellent Surface 6-Well (número de peça GBO 657860) foram doados por Nano3D Biosciences, Inc. e Greiner Bio-One, Inc., (Monroe, NC). O Kinetic Apoptosis Kit (Microscopy) (part number ab129817) foi doado pela Abcam (Cambridge, MA). CellTracker Deep Red Dye (número de peça C34565) foi adquirido na ThermoFisher Scientific (Waltham, MA).

Cytation 5 é um leitor de microplacas multimodo modular combinado com um microscópio digital automatizado. Leitura de microplaca baseada em filtro e monocromador está disponível, e o módulo de microscopia oferece ampliação de até 60x em fluorescência, campo claro, campo claro colorido e contraste de fase. O instrumento pode realizar imagens de fluorescência em até quatro canais em uma única etapa. Com ênfase especial em ensaios de células vivas, Cytation 5 apresenta agitação, controle de temperatura a 65 e degC, CO2/ O2 controle de gás e injetores duplos para ensaios cinéticos, e é controlado pelo software de leitor e imageador de microplacas Agilent BioTek Gen5 integrado, que também automatiza a captura, processamento e análise de imagens. O instrumento foi usado para monitorar cineticamente CTL: as interações das células-alvo, bem como a indução de citotoxicidade nas células-alvo plaqueadas em 2D e 3D.

Incubadora automatizada Agilent BioTek BioSpa 8
A incubadora automatizada BioSpa 8 conecta leitores ou imagers Agilent BioTek com lavadoras e dispensadores Agilent BioTek para automação completa do fluxo de trabalho de até oito microplacas. Temperatura, CO2/ O2 e os níveis de umidade são controlados e monitorados por meio do software Agilent BioTek BioSpa para manter um ambiente ideal para culturas de células durante todos os estágios experimentais. As placas de teste foram incubadas no BioSpa para manter as condições atmosféricas adequadas por um período de sete dias e transferidas automaticamente para o Cytation 5 a cada quatro horas para campo claro e imagem fluorescente.

Este trabalho usa três fluxos de trabalho que são representados pictoricamente na Figura 1.

Figura 1. Ativação de células T e fluxo de trabalho do ensaio de citotoxicidade mediada por células.

O primeiro fluxo de trabalho no lado esquerdo da Figura 1 envolve a ativação de células T, onde células T CD3 + são expostas às células alvo MDA-MB-231 que foram bioprintadas em esferóides usando campos magnéticos (ver "preparação de células alvo 3D" para mais detalhes). as células T ativadas são então coradas com o corante CellTracker Deep Red e usadas em um ensaio de citototoxicidade com base em esferóide 3D bioprinted ou em outro usando células plaqueadas. O corante CellTracker permite a visualização das células T atacando as células-alvo, enquanto o corante iodeto de propídio permite a quantificação da morte da célula-alvo associada à ruptura da membrana plasmática.

Preparação de células alvo 3D

Frascos T-75 de MDA-MB-231 ou culturas de células de fibroblastos foram cultivados até 80% de confluência, então como ilustrado na Figura 2, tratados com 600 µL NanoShuttle-PL durante a noite a 37 & degC / 5% CO2. Após a incubação, as células foram tripsinizadas por 3 a 5 minutos a 37 & degC / 5% CO2.

Figura 2. Procedimento de bioprinting usado para criar esferóides 3D para ativação de células T.


As células foram removidas dos frascos e adicionadas à placa repelente de células de 6 poços a uma concentração de 1,2 e vezes 106 células / poço. Uma unidade magnética de 6 poços foi colocada no topo da placa de poços para levitar as células, onde a agregação e a formação da matriz extracelular (ECM) ocorreram durante uma incubação de oito horas a 37 & degC / 5% CO2. Após a incubação, as células e ECM foram quebradas, ressuspensas e combinadas em concentrações iguais em meio DMEM avançado completo.

Para a ativação de células T, os esferóides 3D foram bioimpressos em uma microplaca repelente de células de 24 poços usando uma unidade magnética esferóide de 384 poços (consulte "Ativação geral e direcionada de células T").

Um procedimento modificado associado à Figura 2 foi usado para preparar esferóides 3D para o ensaio de citotoxicidade. O procedimento era o mesmo até a bioprinting de esferóide. Em vez de bioimpressão em uma placa de 24 poços como para a ativação de células T, o ensaio usou placas de 384 poços de modo que um único esferóide foi biimpresso em cada poço. A cada poço da microplaca repelente de células de 384 poços foi adicionado um total de 2.000 células (1.000 MDA-MB-231 e 1.000 fibroblastos). A microplaca foi incubada a 37 & degC / 5% CO2 por 48 horas para permitir que as células se agregem em tumoróides co-cultivados dentro de cada poço.


Preparação de célula alvo 2D

Frascos T-75 de MDA-MB-231 ou culturas de células de fibroblastos foram cultivadas até 80% de confluência. As células foram então tripsinizadas por 3-5 minutos a 37 & ordmC / 5% CO2 e retirado dos frascos. Após a centrifugação, as células foram ressuspensas e combinadas em concentrações iguais em meio DMEM avançado completo. Um total de 2.000 células (1.000 MDA-MB-231 e 1.000 fibroblastos) foram adicionados aos poços de uma microplaca tratada com TC de 384 poços destinada à cultura de células 2D (Figura 2). A microplaca foi incubada a 37 & degC / 5% CO2 durante a noite para permitir que as células se fixem aos poços.

Ativação direta e geral de células T

Um total de 10.000 células alvo e meios foram adicionados a poços de placas repelentes de células de 24 poços para cada condição experimental como segue (Figura 2). Ativação dirigida: (A) 100% MDA-MB-231 (B) 75% MDA-MB-231 e 25% fibroblastos (C) 50% MDA-MB-231 e 50% fibroblastos ativação geral: (D) sem células. O volume total foi de 1 mL para os poços em cada condição de teste. A placa de 24 poços foi então colocada no topo de uma unidade de ímã esferóide de 384 poços e incubada a 37 & ordmC / 5% CO2 por quatro dias, onde as células se agregaram em vários esferóides 3D dentro de cada poço (Figura 3). Observe que o acionamento magnético é projetado para densidades de 384 poços, de modo que o tamanho expandido de um poço de placa de 24 poços fornece nove (9) esferóides / poço separados.

Figura 3. Placa de 24 poços mostrando cocultura de células T e esferoides alvo 3D magnetizados bioimpressos antes do início da ativação dirigida. Células T adicionadas em uma proporção de 10: 1 para células-alvo previamente agregadas em esferóides 3D (

Após a agregação esferóide, as células T foram preparadas a uma concentração de 100.000 células / mL em meio RPMI contendo 100 ng / mL IL-2 Superkine (Fc) (superquina) juntamente com 250 ng / mL de cada um dos anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 . A mídia gasta foi então aspirada enquanto a placa permaneceu na unidade magnética para proteger os esferóides e substituída por mídia fresca contendo as células T, anticorpos e superquina como descrito anteriormente. A placa foi então colocada de volta no BioSpa para incubar por seis dias. O BioSpa foi pré-programado para capturar uma montagem de imagem 12x10 de cada poço de teste a cada seis horas. A troca manual de meio, IL-2 Superkine e anticorpos foi realizada após 72 horas. O procedimento de ativação direcionada ao longo de seis dias serve não apenas para ativar as células T, mas também as ensina a reconhecer os antígenos das células-alvo, permitindo a citotoxicidade direcionada. A ativação geral segue o mesmo procedimento, mas não usa células-alvo, portanto, não deve haver citotoxicidade-alvo. 5

Coloração e adição de células T

Após a conclusão do processo de ativação, a placa de 24 poços contendo as células T e células alvo magnetizadas foi colocada de volta no acionamento magnético de 384 poços. As células T foram então removidas de cada poço e transferidas para um tubo cônico de 15 mL separado para coloração com o corante CellTracker Deep Red permitindo a diferenciação das células alvo durante o experimento de citotoxicidade. Corante, a uma concentração de 1 & microM, foi adicionado aos tubos e incubados a 37 & degC / 5% CO2 por 45 minutos. Os tubos foram então centrifugados por 15 minutos a 200 RCF. O meio contendo o excesso de corante foi então removido e substituído por meio RPMI fresco. As células T coradas de cada condição de ativação foram então diluídas em meio RPMI contendo 10 & microL / mL da sonda de necrose de iodeto de propídio do kit de apoptose cinética. As células foram então adicionadas às placas de cultura de células 2D ou 3D de 384 poços, já contendo um total de 2.000 células-alvo, em concentrações iguais a 40.000 células / poço, 20.000 células / poço ou 10.000 células / poço (Figura 1). Essas concentrações criaram proporções de células T 20: 1, 10: 1 ou 5: 1 para células-alvo em cada poço. Poços de controle negativo não tratados também foram incluídos para examinar os níveis de citotoxicidade das células-alvo basais ao longo do tempo. A Tabela 1 ilustra o layout final da placa.

tabela 1. Layout da placa de ensaio de citotoxicidade mediada por células 2D e 3D.


Procedimento automatizado de ensaio de citotoxicidade mediada por células

Figura 4. Sistema de imagem de células vivas Agilent BioTek BioSpa, incluindo Agilent BioTek BioSpa 8 e Agilent BioTek Cytation 5.


Placas de ensaio 2D e 3D, contendo células T e células alvo, foram adicionadas ao BioSpa 8, como parte do sistema de imagem de células vivas BioSpa (Figura 4), com as condições atmosféricas previamente definidas para 37 & degC / 5% CO2. Água também foi adicionada à panela para criar um ambiente umidificado, que foi monitorado. O software Agilent BioTek BioSpa foi configurado de forma que as placas fossem transferidas automaticamente para o Cytation 5 para campo claro e imagem fluorescente dos poços de teste a cada quatro horas por um total de sete dias. A Tabela 2 explica as imagens realizadas com cada canal. Para células em placas 2D, uma única imagem de ampliação de 4x foi obtida com cada canal para capturar uma população representativa de células por poço. O foco automático a laser foi incorporado para garantir o foco adequado na camada de células-alvo, bem como o procedimento de foco mais eficiente. Para células plaqueadas em 3D, uma vez que as células dentro dos esferóides da célula alvo 3D existiam em vários planos z, uma pilha z consistindo em cinco fatias foi capturada com cada canal. O foco automático a laser foi novamente incorporado. Duas imagens foram tiradas abaixo e acima do plano focal decidido.

Mesa 2. Célula gerada por canal de imagem.


Processamento de imagem 2D e 3D

Após a captura, as imagens 2D e 3D foram processadas antes da análise. Imagens 2D foram pré-processadas para remover o sinal de fundo de cada canal usando as configurações na Tabela 3.

Tabela 3. Parâmetros de pré-processamento de imagens 2D.


Para imagens 3D, primeiro uma projeção z das imagens capturadas no z-stack foi realizada para criar uma imagem final contendo apenas as informações mais em foco (Tabela 4).

Tabela 4. Critérios de projeção 3D Z


O pré-processamento da imagem projetada foi então executado para remover novamente o sinal de fundo de cada canal (Tabela 5).

Tabela 5. Parâmetros de pré-processamento de imagens 3D.


Análise celular de imagens processadas 2D e 3D

A análise celular foi realizada nas imagens processadas para determinar o sinal total proveniente das células alvo necróticas usando os critérios na Tabela 6.

Tabela 6. Critérios de identificação de células necróticas.


Uma etapa de análise de imagem adicional foi realizada nas imagens 3D para determinar até que ponto os esferóides das células alvo se desintegraram após o tratamento com células T (Tabela 7).

Tabela 7. Critérios de desintegração de esferóides.

Resultados e discussão

Detecção baseada em imagem de interação de células co-cultivadas

As células T, ativadas usando procedimentos de ativação direta e geral, foram adicionadas às células alvo em concentrações iguais a 20: 1, 10: 1, 5: 1 e 0: 1 para iniciar o ensaio de citotoxicidade mediada por células. Para monitorar a interação das células co-cultivadas, as placas foram fotografadas imediatamente após a adição de células T e a cada quatro horas subsequentes ao longo de todo o período de incubação de sete dias.

À medida que os tempos de incubação do ensaio aumentam, é aparente que as células T ativadas (fluorescência vermelha) procuram e se agrupam em torno das células-alvo que apresentam o antígeno por meio da ligação antígeno-receptor nos formatos 2D e 3D (Figura 5A). Esta agregação de células T está em contraste marcante com a distribuição mais uniforme da fluorescência vermelha no tempo 0.

Figura 5. Imagem de campo claro / CY5 da interação celular. 4x campo claro e imagens CY5 mostrando agrupamento de células T e ligação a células alvo (A) 2D ou (B) 3D. Tempo = 24 horas.

Quando as imagens do canal PI são sobrepostas com as do canal de campo claro, pode-se observar que o sinal fluorescente amarelo da sonda de células necróticas de iodeto de propídio se origina das mesmas células-alvo com células T ligadas (Figura 6). Isto confirma o efeito citotóxico a jusante da ligação das células T às células alvo.

Figura 6. Imagem de campo claro / PI da interação celular. 4x campo claro e imagens de PI mostrando células alvo necróticas (A) 2D ou (B) 3D em resposta à ligação de células T. Tempo = 24 horas.


Imagem cinética de indução de citotoxicidade de células alvo mediada por células T

Para determinar a cinética de indução de citotoxicidade nas células-alvo, a imagem deve ser realizada em intervalos regulares durante todo o período de incubação. Como o efeito citotóxico completo pode não ser alcançado até dias após a adição de células T, também é essencial que as células possam interagir por vários dias. Os controles ambientais do Cytation 5 e do BioSpa 8, bem como a transferência automática de placas de teste da incubadora para o imager, permitem que a análise cinética seja concluída sem comprometer a saúde celular. Nos experimentos realizados aqui, as imagens de campo claro e fluorescente foram capturadas a cada quatro horas por um total de sete dias. As Figuras 7 e 8 demonstram o efeito citotóxico iterativo que as células T, ativadas diretamente na presença de células 100% MDA-MB-231 e adicionadas na proporção de 20: 1, têm nas células alvo cultivadas em 2D e 3D, respectivamente.

Figura 7. Imagem CY5 / PI de indução de células alvo citotóxicas 2D. 4x sobrepostas imagens de CY5 e PI mostrando células T coradas e sinal da sonda de células necróticas de iodeto de propídio após (A) 0 (B) 48 (C) 96 e (D) períodos de incubação de cocultura de 168 horas.

Figura 8. Imagem de campo claro / CY5 / PI da indução de células-alvo citotóxicas 3D. 4x campo claro sobreposto, imagens de CY5 e PI mostrando células T coradas e sinal da sonda de células necróticas de iodeto de propídio após (A) 0 (B) 48 (C) 96 e (D) períodos de incubação de cocultura de 168 horas.


Quantificação da citotoxicidade da célula alvo

Após a captura da imagem, o nível de citotoxicidade de células alvo induzida por células T foi então quantificado.

Figura 9. Análise celular da citotoxicidade das células-alvo. 4x imagens mostrando fluorescência da sonda de células necróticas de iodeto de propídio após incubação de 96 horas. Máscaras de objeto (em azul) colocadas em torno das células alvo cultivadas (A) 2D e (B) 3D que atendem aos critérios de análise celular.

Usando os critérios de análise de imagem otimizados descritos na Tabela 6, máscaras de objeto foram colocadas em torno das células que atendem aos critérios de sinal de limite mínimo da sonda de células necróticas de PI (Figura 9). Como as células T têm um tamanho menor em comparação com as células alvo no formato 2D ou 3D, o valor de corte do tamanho mínimo do objeto foi definido de modo que células T necróticas únicas não fossem incluídas na análise. Isso pode ser visto nas Figuras 9A e 9B.

Um fenômeno também observado nas imagens cinéticas do ensaio 3D CMC é que o tumoróide começou a se desintegrar em resposta ao aumento da citotoxicidade, liberando grupos de células na mídia circundante. Embora menores do que o corpo tumoróide intacto, esses agregados permanecem maiores do que células T individuais e também emitem sinal da sonda de células necróticas de PI, portanto, são incluídos na análise final (Figura 9B).

A partir da análise realizada, o número de células necróticas por imagem foi calculado para células alvo cultivadas em 2D. Quando cultivadas em 3D, as células dentro do tumoróide e agregados menores existem em vários planos z. Portanto, para quantificar a citotoxicidade induzida com o maior nível de precisão, o sinal PI total em todas as máscaras de objeto por imagem foi quantificado. Os valores (contagem de células ou sinal PI total) calculados em cada ponto de tempo foram então automaticamente divididos pelo valor calculado no tempo 0 no software Gen5. Desta forma, pequenas variações entre as réplicas foram normalizadas. Após a análise, os resultados foram plotados para avaliar se as diferenças foram observadas na citotoxicidade de células alvo induzida entre as condições de teste. Os gráficos na Figura 10 mostram os dados calculados para células T adicionadas a poços de teste em uma proporção de 20: 1, ativadas na presença de 100%, 75%, 50% ou 0% de células MDA-MB-231, em comparação com células T não ativadas células.

A partir da Figura 10, é evidente que a citotoxicidade induzida por células T aumenta em termos do grau de ativação direcionada das células em modelos de células 2D e 3D. As células T ativadas na presença de 100% das células MDA-MB-231 provocam o nível mais alto de citotoxicidade, enquanto aquelas ativadas apenas na presença de anticorpos e superquina induzem o menor aumento no número de células necróticas por imagem em relação ao número de células necróticas basais. Os modelos diferem em suas respostas cinéticas, no entanto. No modelo 2D (Figura 10A), a citotoxicidade mediada por células T atinge o pico em cerca de 24 horas após a adição das células T ativadas, conforme testemunhado pela razão de células necróticas de poços contendo células T para números de células necróticas de poços de controle negativo. Qualquer necrose adicional além de cerca de 3 dias é devido às limitações do modelo 2D, conforme observado pelo aumento da necrose ao longo do tempo evidente no controle negativo. Por outro lado, no modelo 3D (Figura 10B), as razões necróticas do sinal total da sonda PI continuam a aumentar ou estabilizar ao longo da execução cinética devido ao fato de que a saúde da célula é muito melhor retida no modelo de célula 3D não tratado.

A análise da indução de células necróticas foi então realizada em poços contendo células T diretamente ativadas na presença de 100% de células MDA-MB-231 e, em seguida, adicionado a células alvo plaqueadas 2D e 3D para o ensaio de CMC em proporções de 20: 1, 10: 1, 5: 1. Um controle negativo também foi incluído quando as células-alvo não foram tratadas.

Figura 10. Análise de indução de citotoxicidade do protocolo de ativação. Comparação da indução de células alvo citotóxicas por células T ativadas na presença de anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, superquina e 100% de células MDA-MB-231, 75% de células MDA-MB-231/25% de fibroblastos, 50% MDA-MB-231/50% de células de fibroblastos ou nenhuma célula. Dados para células T não ativadas também incluídos e plotados usando o eixo y esquerdo. Contagem de células necróticas ou sinal de PI total ao longo do tempo de células-alvo de controle negativo não tratadas plotadas no eixo y direito. Resultados mostrados para células T incubadas com (A) células alvo cultivadas em 2D ou (B) células alvo cultivadas em 3D por sete dias.

É evidente a partir da Figura 11 que as respostas cinéticas de citotoxicidade mediada por células T para diferentes razões de células T para células alvo para ambos os modelos 2D e 3D são obtidas ao longo do tempo. Essas descobertas são consistentes com os resultados anteriores da comparação do protocolo de ativação (Figura 10), bem como os resultados relatados com na Vivo testando.

Figura 11. Efeito da concentração de células T. Comparação da indução de células alvo citotóxicas por células T adicionadas a poços em concentrações de 40.000 células / poço (proporção de 20: 1), 20.000 células / poço (proporção de 10: 1), 10.000 células / poço (proporção de 5: 1) e 0 células / poço (controle negativo). Os resultados apresentados para células T incubadas com células alvo cultivadas (A) 2D ou (B) 3D durante sete dias.

Finalmente, os efeitos da ativação direcionada também podem ser medidos usando o canal de campo claro quando as células-alvo são cultivadas em 3D. Isso se deve ao fato de que, em resposta ao efeito das células T citotóxicas, os tumoróides se rompem com o tempo, ou explodem, liberando células e ECM dentro do poço. Usando os recursos de medição de confluência de Gen5 e as métricas otimizadas na Tabela 7, a extensão da desintegração tumoróide pode então ser quantificada. Apenas pixels dentro de cada imagem com um sinal de campo claro abaixo dos critérios de limite superior são incluídos no cálculo de confluência percentual. Quando visualizados no Gen5, os pixels discrepantes são vistos como brancos (Figura 12).

Figura 12. Determinação de confluência de imagem usando sinal de campo claro. 4x imagens de campo claro após análise de imagem e determinação de% de confluência. Os pixels não incluídos no cálculo da confluência aparecem em branco. Imagens mostradas após a interação celular e ligação com uma célula T de 10: 1 para a razão de célula alvo para (A) 72 (B) 116 (C) 136 e (D) períodos de incubação de 168 horas.

Os valores percentuais de confluência podem então ser representados graficamente ao longo do tempo para visualizar a cinética da desintegração tumoróide em resposta ao aumento das relações de células T para células-alvo.

As curvas na Figura 13 ilustram como a plotagem da confluência ao longo do tempo explica a cinética do efeito final. Como seria de se esperar, concentrações mais altas de células T ativadas destroem o tumoróide mais rápido do que concentrações mais baixas. Os tumoróides não tratados também mostram pouca mudança na confluência devido ao fato de que pouca ou nenhuma toxicidade celular é observada (Figura 10B), permitindo que o tumoróide permaneça intacto durante o período de incubação de sete dias.

Figura 13. Quantificação cinética da confluência da imagem. Gráfico da confluência percentual da imagem cinética do campo claro devido à desintegração tumoróide 3D.

Conclusão

Verificou-se que a ativação direta de células T, onde foram expostas a células-alvo por longos períodos in vitro, produziu um aumento significativo na citotoxicidade em comparação com a ativação geral sem células-alvo. Além disso, um efeito de diminuição era evidente se as células-alvo fossem co-cultivadas com fibroblastos no processo de ativação: quanto maior a proporção de fibroblastos, menos citotoxicidade evidente. Isso sugere que as células T podem ser incorporadas no processo de ativação para procurar e destruir as células-alvo.

O modelo de célula 3D foi muito superior ao modelo de célula 2D, pois a saúde da célula foi mantida ao longo das longas corridas cinéticas. A citotoxicidade pode ser quantificada usando iodeto de propídio que mede a ruptura da membrana plasmática ou com campo claro (sem rótulo) que mede o aumento da confluência por desagregação esferóide.

O sistema Agilent BioTek BioSpa, composto de um CO automatizado2 A incubadora que embaralha as microplacas para o leitor de imagem de células Agilent BioTek permite a automação imediata do ensaio de citotoxicidade cinética de 7 dias.


Resultados

Geração de um camundongo transgênico flox Nlrc5-stop como uma ferramenta para a expressão condicional de moléculas MHC de classe I

Foi demonstrado anteriormente que a expressão de MHC II em timócitos DP promove o desenvolvimento de células T CD4 selecionadas por timócitos restritas a MHC II (T-CD4) com um fenótipo semelhante a NKT 21, 22, 24, 29. Portanto, formulamos a hipótese de que a expressão de MHC I em timócitos DP poderia ter um efeito semelhante ao selecionar células T semelhantes a NKT restritas a MHC I (Fig. & # X000a0 1a). Normalmente, os timócitos murinos no estágio DP de seu desenvolvimento não expressam as moléculas clássicas de MHC I ou MHC II 19. Em busca de uma abordagem adequada para conduzir a expressão de MHC I estável em DP, selecionamos o fator de transcrição Nlrc5 (também conhecido como CITA) como um dos principais candidatos com essa função potencial. Nlrc5 é crucial para a transcrição não apenas de genes MHC I, mas também de componentes necessários para processamento de MHC I e carregamento de peptídeo, como & # x003b22m, Tap1 e Lmp2 25, 28. Além disso, Nlrc5 a expressão é fortemente reprimida no estágio de timócitos DP (dados da Fig. & # x000a0 1b de ImmGen 30). Para testar se o Nlrc5 poderia conduzir à expressão de MHC I mais alta in vitro, clonamos a sequência de codificação (CDS) do Nlrc5 gene em um vetor de expressão lentiviral. De fato, as amostras de células HEK 293 transduzidas mostraram que Nlrc5 foi suficiente para conduzir uma expressão de MHC I mais alta em comparação com as amostras de controle (Fig. & # X000a0 1c).

uma Representação esquemática da seleção positiva de células T inatas em timócitos DP. b Nível de expressão de mRNA de murino Nlrc5 em diferentes subconjuntos de células T de camundongos B6 WT. Os dados foram obtidos na ImmGen. c Análise de citometria de fluxo de células HEK 293 transduzidas com vetor de expressão de lentivírus que codifica o Nlrc5 sequência de codificação (CDS) ou com vírus vazio como controle. Como controles adicionais, células não transduzidas e coloração de controle de isotipo são mostradas. As células são analisadas 48 & # x02009h após a transdução. d Estrutura do tipo selvagem (WT) Rosa26 e o ​​alelo-alvo do camundongo transgênico (Nlrc5-stop flox). e Avaliação por citometria de fluxo da expressão de MHC I e MHC II em células T de camundongos transgênicos WT, CD4-Cre & # x02009 & # x000d7 & # x02009Nlrc5-stop flox (T-MHC I) e Plck-CIITA (T-MHC II). Os dados representam cinco experimentos independentes, n& # x02009 & # x02265 & # x020095 ratos por grupo experimental. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de dados de origem.

Para testar o papel de Nlrc5 in vivo, geramos um camundongo transgênico knock-in induzível, onde a expressão de Nlrc5 pode ser regulada positivamente de maneira específica para o tecido, em células que expressam a recombinase Cre. Em resumo, uma construção com um cassete de parada flanqueada por loxP na frente do murino Nlrc5 CDS foi inserido no Rosa26 locus (Fig. & # x000a0 1d). Este design permite Nlrc5 expressão uma vez que Cre recombinase está presente na célula. Esta linha de camundongo foi cruzada para o camundongo CD4-Cre iniciando a expressão de Cre no estágio DP. Observamos que MHC I (H-2Db e H-2Kb) foi altamente expresso em timócitos DP nesses camundongos, em comparação com os controles, que normalmente não o expressam (Fig. & # X000a0 1e e Fig. Suplementar & # x000a0 1a) . Timócitos e esplenócitos positivos simples (SP), que normalmente expressam níveis elevados de MHC I, exibiram níveis apenas ligeiramente mais elevados nesses camundongos. Digno de nota, a expressão de MHC II não foi afetada pelo Nlrc5 transgene (Fig. & # x000a0 1e).

Os alelos MHC Ib não clássicos que apresentam os peptídeos, Qa-1, Qa-2 e H2-M3, mostraram o mesmo padrão de expressão em timócitos que os alelos MHC Ia clássicos H2-Kb e H2-Db (ou seja, baixo DP timócitos) (Fig. Complementar & # x000a0 1d). Nlrc5 a superexpressão também levou à sua regulação positiva (Fig. Suplementar & # x000a0 1b). Em contraste, a expressão gênica das moléculas de apresentação não peptídica CD1d e MR1 é alta em timócitos DP (Fig. Suplementar & # x000a0 1e) e não foi alterada pela superexpressão de Nlrc5 (Fig. Complementar & # x000a0 1c). Isso sugere que a apresentação de peptídeos através de moléculas MHC Ia / Ib, em particular, está ausente em timócitos DP corticais devido à ausência de Nlrc5 expressão, enquanto a apresentação de lipídios e metabólitos são preservados.

Como um controle adicional, obtivemos camundongos transgênicos plck-CIITA 21, que superexpressam MHC II em células T a partir do estágio de timócito DP (Fig. & # X000a0 1e). Nas seções seguintes, ambas as cepas foram analisadas em paralelo. Para simplificar, nos referimos a CD4-Cre / Nlrc5-stop flox como & # x0201cT-MHC I & # x0201d mouse e pLck-CIITA como & # x0201cT-MHC II & # x0201d mouse.

A expressão de MHC I em timócitos DP resultou em um aumento nas células T PIL

A arquitetura do timo e a distribuição geral do subconjunto no timo não mostraram alterações marcantes entre o tipo selvagem (WT) e os companheiros de ninhada T-MHC I (Fig. & # X000a0 2a & # x02013c e Fig. Suplementar & # x000a0 2). Não houve diferenças significativas na frequência de DN, DP, células T CD4 SP, células T & # x003b3 & # x003b4 ou células T & # x003b3 & # x003b4 NKT (definidas como células T PLZF + & # x02009 & # x003b3 & # x003b4). Os camundongos T-MHC II mostram uma frequência de CD8 SP aumentada devido à indução de células T CD8 & # x0201cmemory & # x0201d, como previamente descrito 31. Em contraste, os camundongos T-MHC I mostraram, se alguma coisa, uma ligeira redução no número e frequência de células T CD8 SP, e um pequeno aumento no número de células MAIT (Fig. & # X000a0 2a & # x02013c e gating na Fig. Suplementar. # x000a0 3a e # x02013c). As células iNKT foram aproximadamente duas vezes reduzidas em número e frequência em ambos os camundongos T-MHC I e T-MHC II. A redução no número e na frequência de células iNKT foi ainda mais proeminente no baço e a mesma tendência de redução também estava presente no fígado (Fig. Suplementar & # x000a0 4a, b). Não houve diferenças significativas na célula MAIT e no número de células & # x003b3 & # x003b4 NKT no baço (Fig. Suplementar & # x000a0 4d, e). Surpreendentemente, Treg a frequência celular não foi afetada em camundongos T-MHC II, mas aumentou no timo e baço de camundongos T-MHC I. No baço, essa diferença também foi estatisticamente significativa no número de células (Fig. Suplementar & # x000a0 4b painel inferior). No geral, o camundongo transgênico T-MHC I não apresentou alterações importantes no desenvolvimento de linfócitos, exceto por um aumento modesto em Treg e uma diminuição na frequência e número de células iNKT.

uma Gráficos de citometria de fluxo representativos de timócitos totais de camundongos WT, T-MHC I e T-MHC II. b Quantificação de dados de acordo com a estratégia de gating exibida em uma. As frequências das células são plotadas no eixo esquerdo e os números no eixo direito. c Contagens de células totais de células MAIT e células & # x003b3 & # x003b4NKT no timo de camundongos WT e T-MHC I. d Gráficos representativos da estratégia de citometria de fluxo para a identificação de células PIL no timo WT. e Gráficos de citometria de fluxo representativos de coloração para células PIL comparando WT com camundongos T-MHC I e T-MHC II do timo e baço. f Frequência (plotada no eixo esquerdo) e número (plotado no eixo direito) de células PIL de camundongos WT, T-MHC I e T-MHC II definidos pela estratégia de citometria de fluxo descrita em d. b, c, f Cada ponto representa um animal: n& # x02009 = & # x0200910 animais por grupo (grupos WT e T-MHC I) e n& # x02009 = & # x020098 animais (grupo T-MHC II) em b, n& # x02009 = & # x020094 animais por grupo em c e n& # x02009 = & # x020099 animais por grupo em f. Os dados são representativos de cinco em uma, b e oito em d& # x02013f experimentos independentes.Um experimento foi realizado em c. Mann bicaudal não pareado & # x02013 O teste de Whitney foi realizado em b, c, f) p& # x02009 & # x02265 & # x020090.01 não são representados, **p& # x02009 & # x0003c & # x020090.01, ***p& # x02009 & # x0003c & # x020090.001 e ****p& # x02009 & # x0003c & # x020090.0001. Os dados são preenviado como valores médios & # x02009 & # x000b1 & # x02009SD. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de dados de origem.

Em seguida, procuramos determinar se as células com fenótipo semelhante a NKT foram expandidas no camundongo transgênico T-MHC I semelhante ao observado com camundongos T-MHC II (Fig. & # X000a0 1a). PLZF é o principal fator de transcrição que confere características inatas à linhagem de células iNKT 14. Portanto, estabelecemos uma estratégia de gating que permitiu a identificação de células T PIL específicas de peptídeo, por gating em células TCR & # x003b2 + PLZF + e excluindo outros subconjuntos conhecidos por expressar PLZF, como células iNKT, & # x003b3 & # x003b4 células T, e células MAIT (Fig. & # x000a0 2d). Com essa estratégia, identificamos uma pequena fração de células T PIL presentes em irmãos de ninhada WT, aumentando em quatro vezes em camundongos T-MHC I (Fig. & # X000a0 2e, f). No entanto, essa mudança foi menos robusta do que o aumento de 10 & # x0201315 vezes das células T PIL no T-MHC II.

A expansão de células T PIL é dependente de SAP e não mediada por Nlrc5 de uma forma intrínseca à célula

Embora não tenhamos observado a suprarregulação da superfície CD1d em resposta à expressão de Nlrc5 em timócitos DP, é formalmente possível que as células T PIL sejam dependentes de CD1d. Portanto, cruzamos camundongos T-MHC I com Cd1d & # x02212 / & # x02212 ratos. A deficiência de CD1d anulou o desenvolvimento de células iNKT, como esperado, mas se alguma coisa, aumentou o número de células T PIL em camundongos T-MHC I (Fig. & # X000a0 3a, b). Assim, a maioria das células T PIL são provavelmente restritas a MHC Ia / Ib, pois seus números dependem da expressão de MHC I em timócitos DP, mas não dependem de CD1d.

uma Gráficos representativos de citometria de fluxo de timócitos totais de Cd1d & # x02212 / & # x02212 e Cd1d & # x02212 / & # x02212 Camundongos T-MHC I. b Frequência de células tímicas iNKT e PIL e comparação de número entre WT e Cd1d & # x02212 / & # x02212, e T-MHC I e Cd1d & # x02212 / & # x02212 Camundongos T-MHC I. c Gráficos de citometria de fluxo representativos de um conjunto de camundongos quiméricos de medula óssea (BM) desiguais 8 semanas após o transplante. Camundongos WT CD45.1 + foram irradiados letalmente e transplantados com uma mistura de medula óssea WT CD45.1 / 2 + e T-MHC I CD45.2 + em uma proporção de 1 & # x02009: & # x0200910. Este grupo experimental é descrito como grupo WT & # x02009 + & # x02009T-MHC I. No grupo de controle, os camundongos foram transplantados com uma mistura de medula óssea WT CD45.1 / 2 + e WT CD45.2 + na proporção de 1 & # x02009: & # x0200910. Este grupo experimental é descrito como grupo WT & # x02009 + & # x02009WT. São mostrados gráficos de citometria de fluxo que exibem a estratégia de passagem do grupo WT & # x02009 + & # x02009WT (nos dois painéis à esquerda). Nos quatro painéis direitos (em verde) são mostrados gráficos representativos exibindo frequências de células PIL (com acesso em WT CD45.1 / 2 +) do grupo WT & # x02009 + & # x02009WT (à esquerda) e WT & # x02009 + & # Grupo x02009T-MHC I (à direita). A avaliação da frequência da célula PIL é mostrada em d. e Gráficos representativos de citometria de fluxo de timócitos totais de Sh2d1a & # x02212 / & # x02212 (Deficiente em SAP) e Sh2d1a & # x02212 / & # x02212 Camundongos T-MHC I. iNKT, PIL e Treg frequência celular são mostradas em f. b, d, f Cada ponto representa um animal: n& # x02009 = & # x0200910 animais por grupo (grupos WT e T-MHC I), n& # x02009 = & # x020097 animais (CD1d & # x02212 / & # x02212 grupo), n& # x02009 = & # x020093 animais (CD1d & # x02212 / & # x02212 Grupo T-MHC I), n& # x02009 = & # x020098 animais (grupo WT & # x02009 + & # x02009WT), n& # x02009 = & # x020099 animais (grupo WT & # x02009 + & # x02009T-MHC I), n& # x02009 = & # x020095 animais (Sh2d1a & # x02212 / & # x02212 grupo), e n& # x02009 = & # x020096 animais (Sh2d1a & # x02212 / & # x02212 Grupo T-MHC I). Os dados são representativos de quatro em uma, b, e, f e dois em c, d experimentos independentes. Mann bicaudal não pareado & # x02013 O teste de Whitney foi realizado em b, d e um Student bicaudal não pareado & # x02019s t-teste foi realizado em f ns, não significativo (p& # x02009 & # x02265 & # x020090.05), *p& # x02009 & # x0003c & # x020090.05, **p& # x02009 & # x0003c & # x020090.01, ***p& # x02009 & # x0003c & # x020090.001 e ****p& # x02009 & # x0003c & # x020090.0001. Os dados são apresentados como valores médios & # x02009 & # x000b1 & # x02009SD. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de dados de origem.

Em seguida, investigamos se MHC I era necessário em timócitos DP vizinhos para o desenvolvimento de células T PIL, ou se era devido a um efeito intrínseco de célula desconhecido de superexpressão de Nlrc5. Para este fim, estabelecemos um conjunto de camundongos quiméricos BM desiguais, onde os receptores WT foram letalmente irradiados e transplantados com uma mistura de WT e T-MHC I BM em uma proporção de 1 & # x02009: & # x0200910 de diferentes camundongos congênicos. Com esta configuração, 90% dos timócitos vizinhos expressariam MHC I e são, portanto, capazes de induzir a seleção de células T PIL em progenitores WT. Um grupo de controle recebeu uma mistura de WT e WT BM de diferentes camundongos congênicos. De fato, 8 semanas após o transplante, um aumento significativo nas células T PIL estava presente entre as células derivadas de WT BM quando os timócitos vizinhos expressavam MHC I, em comparação com o grupo de controle (Fig. & # X000a0 3c, d). Um aumento significativo na frequência de células T PIL estava presente também no baço. Portanto, este resultado desfavorece a possibilidade de que a expressão forçada de Nlrc5 promova o desenvolvimento de PILs de uma forma intrínseca à célula e confirma a hipótese de que as células T PIL se expandem devido à regulação positiva de MHC I em timócitos DP vizinhos. Notavelmente, a frequência de Treg as células não aumentaram entre as células derivadas de WT BM, mas foram apenas observadas entre as células derivadas de T-MHC I (Fig. Suplementar & # x000a0 5a, b). Isso indica que a expansão observada de Treg as células no camundongo T-MHC I são mediadas pela expressão de Nlrc5 de uma forma intrínseca à célula.

Um requisito crucial para o desenvolvimento de células iNKT é o desencadeamento das vias de sinalização SLAM-SAP durante a seleção do agonista 13. Portanto, procuramos determinar se a deficiência de SAP tem o mesmo impacto nas células T PIL que no desenvolvimento das células iNKT. Esperava-se que a falta de SAP anulasse completamente o desenvolvimento de células iNKT. Também anulou a geração de células T PIL no timo (Fig. & # X000a0 3e, f) e no baço (Fig. Suplementar & # x000a0 5c, d). Isso indica que as células PIL T e as células iNKT empregam vias de sinalização semelhantes durante sua seleção e desenvolvimento.

As células T PIL são encontradas nos mesmos subconjuntos efetores das células iNKT

As células tímicas iNKT existem em três subconjuntos efetores bem definidos (iNKT1, 2 e 17), análogos às células T auxiliares ativadas perifericamente 32. Usando a coloração do fator de transcrição, descobrimos que as células T PIL também segregam em três subconjuntos semelhantes, que chamamos de PIL1 (PLZF lo Tbet + ROR & # x003b3t -), PIL2 (PLZF hi ROR & # x003b3t -) e PIL17 (PLZF int ROR & # x003b3t +) células (Fig. & # x000a0 4a). A expressão de NK1.1 em PIL1, CD4 em PIL2 e CD138 em células PIL17 também foi semelhante à dos subconjuntos de células iNKT (Fig. Suplementar & # x000a0 6a). Portanto, isso é sugestivo de que cada fração PIL pode exibir propriedades funcionais semelhantes ao subconjunto de células iNKT correspondente. Vários estudos independentes mostraram que os três subconjuntos NKT têm programas de expressão gênica bastante distintos 33 & # x02013 35. Na verdade, a expressão de um grande painel de moléculas funcionalmente relevantes, incluindo CD122, CXCR3, CD69, PD1, CCR6 e CD25 foi semelhante entre os subconjuntos PIL e iNKT (Fig. Suplementar & # x000a0 6b), assim como foi a produção do interferon de citocinas - & # x003b3 (IFN & # x003b3), interleucina (IL) -4 e IL-17A após estimulação in vitro (Fig. Suplementar & # x000a0 6c) 32, 33. Tomados em conjunto, esses dados inferem que programas análogos de transcrição e funcionais operam em células PIL e iNKT.

uma Semelhante às células iNKT, as células T PIL segregam em três subconjuntos definidos pelo padrão de expressão dos fatores de transcrição PLZF e ROR & # x003b3t. São mostrados gráficos de citometria de fluxo representativos comparando subconjuntos de células T PIL de camundongos WT, T-MHC I e T-MHC II. b Comparações de frequências de subconjunto de células T PIL (linha superior) e números (linha inferior). c Gráficos de citometria de fluxo representativos de coloração para CD4 e CD8 & # x003b1 em células PIL de camundongos WT, T-MHC I e T-MHC II. d Avaliação por citometria de fluxo do repertório da cadeia TCR V & # x003b2 de células T PIL tímicas de camundongos WT, T-MHC I e T-MHC II em comparação com células T convencionais. e Gráficos exemplares mostrando a coloração para TCR & # x003b2 em subconjuntos de células iNKT em comparação com subconjuntos de células T PIL de camundongos WT, T-MHC I e T-MHC II. Todos os animais analisados ​​são de geração F1 com camundongos BALB / c (adicionalmente caracterizados na Fig. & # X000a0 6). f Padrão de expressão de CD44 e NK1.1 em (da esquerda para a direita) células T iNKT, WT PIL, T-MHC I PIL e T-MHC II PIL. b Cada ponto representa um animal: n& # x02009 = & # x020098 animais por grupo (grupos WT e T-MHC II) e n& # x02009 = & # x020099 animais (grupo T-MHC I). Os dados são representativos de sete em uma& # x02013c e três em d& # x02013f experimentos independentes. Mann bicaudal não pareado & # x02013 O teste de Whitney foi realizado em b ns, não significativo (p& # x02009 & # x02265 & # x020090.05), *p& # x02009 & # x0003c & # x020090.05, **p& # x02009 & # x0003c & # x020090.01, ***p& # x02009 & # x0003c & # x020090.001 e ****p& # x02009 & # x0003c & # x020090.0001. Os dados são apresentados como valores médios & # x02009 & # x000b1 & # x02009SD. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de dados de origem.

Notavelmente, as células T PIL restritas a MHC I e MHC II foram diferenciadas em três subconjuntos (Fig. & # X000a0 4a, b). No entanto, células T PIL restritas a MHC II em animais T-MHC II mostraram uma forte distorção em direção ao fenótipo efetor PIL2, em detrimento de PIL17. Isto é consistente com a superprodução bem descrita de IL-4 por PLZF + T-CD4s em camundongos pLck-CIITA 31. No entanto, os três subconjuntos estavam presentes em proporções semelhantes em camundongos WT e T-MHC I (Fig. & # X000a0 4a, b).

Como mencionado acima, as células T PIL podem ser fenotipicamente e funcionalmente semelhantes às células iNKT. No entanto, em contraste com as células iNKT, elas são selecionadas em moléculas MHC clássicas. Portanto, inspecionamos a expressão do co-receptor de TCR e o uso da cadeia V & # x003b2 de TCR. Como relatado anteriormente, as células T PIL que se desenvolvem em camundongos T-MHC II foram encontradas em grande parte com CD4 SP com uma pequena fração de células DN (Fig. & # X000a0 4c). Surpreendentemente, as células T PIL em camundongos T-MHC I não expressaram exclusivamente CD8, mas segregaram em CD4 SP, CD8 SP e DN, semelhantes aos de camundongos WT, sugerindo que as células T PIL em camundongos WT podem estar mais intimamente relacionadas com Células restritas a MHC I (Fig. & # X000a0 4c). Embora não tenhamos observado um viés grave no uso da cadeia TCR V & # x003b2 por células T PIL, houve um aumento notável na frequência das células V & # x003b23 + e V & # x003b25.1 / V & # x003b25.2 + dentro das células PIL T -conjunto de células de camundongos WT e T-MHC I. Além disso, um pequeno aumento na frequência de células V & # x003b26 + estava presente nas células T PIL de camundongos T-MHC II (Fig. & # X000a0 4d).

Foi mostrado anteriormente que os subconjuntos de células tímicas iNKT exibem diferentes níveis de TCR em sua superfície, uma característica que é mais proeminente no fundo BALB / c 33, 36. Os níveis de TCR são mais altos nas células NKT2, mais baixos nas células NKT1 e intermediários nas células NKT17. Além disso, essas diferenças nos níveis de expressão de TCR e, portanto, a força de sinalização presumida, são relatadas como fundamentais para o comprometimento e diferenciação do subconjunto de células iNKT 37 & # x02013 39. No entanto, o TCR de superfície não diferiu significativamente entre os subconjuntos de células T PIL (Fig. & # X000a0 4e), sugerindo que outros fatores além do nível de expressão de TCR podem ditar o comprometimento e a diferenciação do subconjunto nessas células.

Estudos históricos no campo da biologia celular iNKT usaram CD44 e NK1.1 como marcadores para avaliar a maturidade e o estágio de desenvolvimento das células iNKT 40. Usando esses marcadores, uma proporção maior de células T PIL foi encontrada para ser CD44 baixo em comparação com células iNKT, indicando um estágio menos maduro (Fig. & # X000a0 4f).

O desenvolvimento de células T CD8 do fenótipo de memória requer envolvimento do co-receptor CD4 em células T PIL

Conforme relatado anteriormente, a frequência de células T CD8 SP foi aumentada no timo de camundongos T-MHC II (Fig. & # X000a0 2b) 21, 22, 31. Isso foi mostrado para ser causado por IL-4 produzida por células PIL T (chamadas células T-CD4 naquele relatório), que medeia o desenvolvimento do fenótipo de memória CD8 T (TMP) células através da indução de eomesodermina (Eomes) 41. Assim, uma grande proporção de células T CD8 SP em camundongos T-MHC II expressam Eomes (Fig. & # X000a0 5a) e têm um fenótipo de memória 31. Para nossa surpresa, não houve aumento no Eomes + CD8 TMP em camundongos T-MHC I (Fig. & # x000a0 5b). Como a interação do TCR com o MHC II pode invocar a sinalização do co-receptor CD4, raciocinamos que a indução da produção de IL-4 pelas células PIL T e, conseqüentemente, o aumento do T CD8MP as células podem ser o resultado da sinalização do co-receptor CD4. Para testar essa hipótese, cruzamos camundongos T-MHC I com camundongos transgênicos CD8.4. Nestes camundongos, a cauda citoplasmática do endógeno Cd8a gene foi substituído pela cauda citoplasmática de CD4 42. O transgene CD8.4 não causou um aumento no número total de células T PIL em camundongos T-MHC I (Fig. & # X000a0 5c), mas mudou a proporção de células T PIL em favor de células PLZF hi PIL2 ( Fig. & # X000a0 5d), que produzem IL-4. Consistente com isso, o número de CD8 TMP foi marcadamente aumentado em camundongos CD8.4 T-MHC I (Fig. & # x000a0 5e). Uma tendência semelhante foi observada no baço (Fig. Suplementar & # x000a0 7). Assim, o co-receptor particular envolvido na detecção de ligantes MHC em timócitos DP influencia a diferenciação do subconjunto efetor de células T PIL e tem efeitos secundários de T CD8MP desenvolvimento.

uma Gráficos de citometria de fluxo representativos de coloração intracelular para Eomes em timócitos CD8 SP de camundongos WT, T-MHC I e T-MHC II. b Número (plotado no eixo direito) e frequência (plotado no eixo esquerdo) de CD8 TMP células entre as células CD8 SP no timo de camundongos WT, T-MHC I e T-MHC II, definidas pela estratégia de gating mostrada em uma. c Gráficos de citometria de fluxo representativos de timócitos comparando a frequência de células T PIL de camundongos T-MHC I com camundongos CD8.4 Tg / + & # x000a0T-MHC I. São mostradas avaliações resumidas para o número de células T PIL e frequência (dois painéis à direita). d Gráficos de citometria de fluxo representativos e avaliação resumida para frequência de subconjunto de células T PIL2 entre timócitos de camundongos T-MHC I e CD8.4 Tg / + & # x000a0T-MHC I. Ambos os grupos são comparados a camundongos WT. e Gráficos de citometria de fluxo de exemplaridade de CD8 TMP frequência celular entre as células CD8 SP no timo de camundongos T-MHC I com camundongos Tg / + T-MHC I CD8.4 (dois painéis à esquerda) e avaliação resumida de CD8 TMP número de célula (painel direito). Cada ponto representa um animal: n& # x02009 = & # x020099 animais por grupo (grupos WT e T-MHC II) em uma, b, n& # x02009 = & # x020099 animais (grupo T-MHC I) em c, d, n& # x02009 = & # x020097 animais (grupo T-MHC I) em b, e, e n& # x02009 = & # x020094 animais (grupo CD8.4 Tg / + T-MHC I) em c& # x02013e. Os dados são representativos de 7 pol. uma, b e 2 em c& # x02013e experimentos independentes. Mann bicaudal não pareado & # x02013 O teste de Whitney foi realizado em b& # x02013e ns, não significativo (p& # x02009 & # x02265 & # x020090.05), *p& # x02009 & # x0003c & # x020090.05, **p& # x02009 & # x0003c & # x020090.01 e ****p& # x02009 & # x0003c & # x020090.0001. Os dados são apresentados como valores médios & # x02009 & # x000b1 & # x02009SD. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de dados de origem.

Células T PIL competem com células iNKT por um nicho celular dentro do timo

Semelhante ao que foi relatado anteriormente com o camundongo T-MHC II 43, observamos uma redução de duas a três vezes no número de células iNKT específicas de lipídios em camundongos com números aumentados de células T PIL devido à expressão de MHC I ou MHC II em Timócitos DP (Fig. & # X000a0 2b). De nota, a contagem total de células reunidas de células PILs & # x02009 + & # x02009iNKT não foi significativamente diferente entre os camundongos WT e T-MHC I (dados não mostrados). Como as células T específicas de peptídeo e lipídeo requerem sinalização SAP dos co-receptores da família SLAM de superfície para se desenvolver em células T PIL ou células iNKT, respectivamente, isso sugere que os dois tipos de células podem estar em competição entre si por um nicho celular dentro do timo. Para testar ainda mais essa noção, examinamos camundongos B6xBALB / c F1, que têm um nicho de células iNKT ligeiramente maior (duas vezes) 32, 44. Se um nicho semelhante regula as células T PIL, então podemos esperar mais células T PIL em camundongos F1. De fato, tanto a porção quanto o número de células T PIL em camundongos T-MHC I e T-MHC II foram maiores em animais no fundo F1 em comparação com o fundo B6 (Fig. & # X000a0 6a, b e Fig. Suplementar & # x000a0 8a, b) inferir a existência de um nicho maior para o desenvolvimento de células T PIL no fundo F1. Observamos uma relação inversa entre o número de células iNKT e células T PIL em ambos os camundongos B6 e F1 (Fig. & # X000a0 6c e Fig. Suplementar & # x000a0 8c). Tomados em conjunto, com a expansão das células T PIL em camundongos que não possuem células iNKT (Fig. & # X000a0 3b), esses dados sugerem fortemente que as células T PIL e as células iNKT competem pelo mesmo nicho celular. Como um aparte, o desvio relatado de células iNKT em direção ao subconjunto PFZF hi NKT2 em camundongos F1 32 também foi observado em células T PIL (Fig. & # X000a0 6d e Fig. Suplementar & # x000a0 8d). Isso sugere que os mesmos fatores controlam o subconjunto efetor de células T iNKT e PIL em diferentes cepas, que são mais prováveis ​​de serem citocinas ambientais, fatores intrínsecos celulares ou moléculas coestimulatórias em vez de autoantígenos específicos.

uma Camundongos B6 WT, T-MHC I e T-MHC II foram cruzados com camundongos BALB / c e companheiros de ninhada da geração F1 (rotulados como F1, F1 T-MHC I e F1 T-MHC II) foram analisados ​​por citometria de fluxo para frequência de células T iNKT e PIL no timo. b Avaliação resumida da frequência de células T iNKT e PIL (painel esquerdo) e número (painel direito) de camundongos WT, T-MHC I e T-MHC II no fundo B6 e F1. c Correlação inversa entre o número de células iNKT e o número de células T PIL no timo de WT (pontos pretos), T-MHC I (triângulos vermelhos) e camundongos T-MHC II (triângulos inversos azuis) em B6 (painel esquerdo) e fundo F1 (painel direito). d São mostrados gráficos de citometria de fluxo comparando subconjuntos de células T iNKT e PIL de camundongos WT, T-MHC I e T-MHC II no fundo B6 (linha superior) e F1 (linha inferior). Cada ponto representa um animal: n& # x02009 = & # x0200910 animais por grupo (grupos WT e T-MHC I), n& # x02009 = & # x020098 animais (grupo T-MHC II), n& # x02009 = & # x020099 animais (grupo F1 WT), n& # x02009 = & # x020096 animais (grupo F1 T-MHC I), e n& # x02009 = & # x020097 animais (grupo F1 T-MHC II) em uma& # x02013d. Os dados são representativos de sete experimentos independentes. Mann bicaudal não pareado & # x02013 O teste de Whitney foi realizado em b ns, não significativo (p& # x02009 & # x02265 & # x020090.05), ***p& # x02009 & # x0003c & # x020090.001 e ****p& # x02009 & # x0003c & # x020090.0001. R 2 valores e p-valores em c foram calculados ajustando a regressão não linear e realizando um teste de Goodness-of-Fit e um teste F extra-soma dos quadrados. Os dados são apresentados como valores médios & # x02009 & # x000b1 & # x02009SD. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de dados de origem.


Estimulação de células mononucleares do sangue periférico humano

Células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) são rotineiramente isoladas de amostras de sangue e então usadas em vários campos de pesquisa, incluindo doenças autoimunes, doenças infecciosas, desenvolvimento de vacinas e câncer. O ensaio ELISpot monitora respostas imunes celulares ex vivo a estímulos antigênicos. Aqui, usamos o leitor multimodo de imagem de células Agilent BioTek Cytation 7 em conjunto com o leitor de microplaca Agilent BioTek Gen5 e o software de imagem para quantificar as alterações na secreção de citocinas em PBMCs usando o formato de ensaio ELISpot colorimétrico.

Introdução

As células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) são estimuladas diferencialmente para secretar uma série de citocinas como resultado de uma cascata mediada por receptor com base no tipo de célula e nos estímulos. A resposta desse grupo diverso de células a diferentes estímulos oferece insights sobre seu papel na doença e no desenvolvimento de modalidades de tratamento.

PBMCs são células do sangue periférico que possuem um núcleo redondo. 1 Essas células consistem em linfócitos (células T, B e NK), bem como monócitos. Outras células do sangue periférico não têm núcleos (eritrócitos e plaquetas) ou têm núcleos multilobados (neutrófilos, basófilos e eosinófilos). Em humanos, os linfócitos constituem a maioria da população de PBMC, seguidos pelos monócitos e apenas uma pequena porcentagem das células dendríticas. 2

As citocinas são proteínas ou peptídeos de pequeno peso molecular secretados por muitos tipos de células (particularmente células do sistema imunológico) que regulam a duração e a intensidade da resposta imunológica. A citocina interleucina 2 (IL-2) é uma molécula reguladora celular pleiotrópica produzida pelas células linfoides em resposta a diversos estímulos. Desempenha um papel na prevenção de doenças autoimunes, promovendo a diferenciação de células T imaturas em células T reguladoras. 3 Além disso, a IL-2 causa a diferenciação de células T em células T efetoras e células T de memória quando a célula T original foi estimulada por um antígeno. 4 O interferon gama (IFN- & gama) é uma citocina crítica para a imunidade inata e adaptativa contra infecções. O IFN- & gama é produzido predominantemente por células natural killer (NK) e natural killer T (NKT) como parte da resposta imune inata e por linfócitos T citotóxicos (CTL) células T efetoras uma vez que a imunidade antígeno-específica se desenvolve. 5 A importância do IFN- & gama no sistema imunológico decorre em parte de sua capacidade de inibir a replicação viral diretamente e de seus efeitos imunoestimuladores e imunomoduladores. A expressão aberrante de IFN- & gama está associada a uma série de doenças autoinflamatórias e autoimunes.

A ativação de células T é normalmente iniciada pela interação de um receptor de superfície celular com sua molécula ligante específica, juntamente com uma molécula coestimuladora. 6 Esse evento de ligação desencadeia a rápida hidrólise dos fosfolipídios de inositol em diacilglicerol e fosfatos de inositol pela fosfolipase C (PLC).

O diacilglicerol é um ativador alostérico da proteína quinase C (PKC). A ativação de PKC e os fosfatos de inositol, que desencadeiam a liberação e mobilização de Ca 2+, resultam em uma cascata de respostas celulares adicionais que medeiam a ativação de células T (Figura 1). Duas dessas respostas celulares são a produção e secreção de IL-2 e INF- & gama. Triptolide é um triepóxido diterpeno que é um potente imunossupressor e antiinflamatório (Figura 2). Foi demonstrado que o triptólido inibe a expressão de IL-2 em células T ativadas no nível da caixa de purina / fator nuclear e ativação da transcrição mediada por NF- & kappaB. 7

figura 1. Esquema da cascata de sinais para estimulação da secreção de IL-2 e INF- & gama.

Figura 2. Estrutura do triptólido.


Embora alguns PBMCs sejam conhecidos por produzir IL-2 e INF- & gama, em condições normais de crescimento pouco é produzido. Somente após a estimulação, quantidades substanciais das citocinas serão expressas. 8 A fitohemaglutinina (PHA) é uma lectina que se liga aos açúcares das proteínas de superfície glicosiladas, incluindo o receptor de células T (TCR), e os liga de forma inespecífica. O resultado é a estimulação de baixo nível da cascata de sinal necessária para a secreção de IL-2 ou INF- & gama. 9 Da mesma forma, o Phorbol miristato acetato (PMA) é um pequeno composto orgânico, de estrutura análoga ao diacilglicerol, que se difunde através da membrana celular para o citoplasma, onde ativa diretamente a Proteína Quinase C (PKC). Quando usado em combinação com a ionomicina, um ionóforo de cálcio, que desencadeia a liberação de cálcio, resulta em um nível moderado de liberação de citocinas. No entanto, quando o PMA e um coestimulador, como o PHA, estimulam células PBMC simultaneamente, a produção de citocinas é fortemente aumentada. 10

O procedimento de ensaio ELISpot é muito semelhante ao de um ELISA convencional. As placas são primeiro revestidas com o anticorpo de captura apropriado. As células secretoras cultivadas são adicionadas aos poços juntamente com qualquer mitógeno ou antígeno experimental interessado. As células são mantidas por um período de tempo após o qual são removidas. O analito secretado permanece ligado aos anticorpos de captura nas proximidades do local na placa onde a célula que produziu o analito estava situada. Após a remoção das células e quaisquer materiais não ligados, um anticorpo de detecção (geralmente biotinilado) é adicionado seguido por um conjugado de enzima com uma incubação para permitir a ligação e uma lavagem para remover os materiais não ligados após cada etapa. Conforme o substrato é convertido pela enzima conjugada em compostos coloridos, pontos no fundo da membrana da placa nos locais de captura do analito original são formados. Os pontos resultantes são então analisados ​​/ contados usando análise de imagem. (Figura 3).

Figura 3. Procedimento de coloração ELISpot.

Experimental

O kit colorimétrico IL-2 ELISpot humano foi obtido da U-CyTech biosciences (Utrecht, Holanda) e um kit IFN- & gama / IL-2 ELISpot humano de duas cores foi obtido da Cellular Technology Limited (Cleveland, OH). Phorbol 12-miristato (PMA) e triptólido (número de peça T3652) foram adquiridos na Millipore-Sigma. Ionomycin (número de peça 407952) era da EMD-Millipore. PBMCs humanos foram obtidos de Astarte Biologicals (Bothell, WA). Membrana branca de PVDP de 96 poços (número de peça MSIP4W10) eram da Millipore-Sigma.

Cultura de células: PBMCs humanos purificados foram recebidos e mantidos congelados até serem necessários. Após descongelamento rápido, as células foram imediatamente diluídas 1:10 em RPMI-1640 mais FBS a 10% suplementado com glutamina 2 mM, penicilina e estreptomicina. As células foram centrifugadas a 300 g durante 10 minutos e o sobrenadante removido. As células foram ressuspensas em 10 mL de meio RPMI fresco, contadas e diluídas conforme necessário para fornecer uma densidade de 5 & vezes 10 4 células / poço.

Revestimento da placa: Um kit ELISpot de IL-2 humana da U-CyTech Biosciences ou um kit INF- & gama / IL-2 humano de 2 cores da CTL foram usados ​​para essas experiências. Placas de membrana de PVDF são primeiro revestidas com a concentração apropriada de anticorpo de captura (anti-IL-2 ou anti-FTN- & gama) e deixadas para absorver durante a noite a 4 & degC. O anticorpo não ligado é aspirado e a placa é lavada manualmente 3x com PBS. Os poços são então preenchidos com uma solução de bloqueio (200 e microL) e incubados por pelo menos 1 hora em temperatura ambiente. O tampão de bloqueio é aspirado sem lavagem imediatamente antes da adição das células.

Semeadura de células: A menos que indicado de outra forma, as células foram semeadas em placas de membrana de 96 poços previamente revestidas com anticorpo a uma densidade de 5 & vezes 104 / poço. PBMCs foram estimulados a secretar IL-2 com uma mistura de PMA (50 ng / mL) e ionomicina (1 & microg / mL). Os experimentos típicos usaram um volume de 100 e microL para células seguido pela adição de 100 e microL de mistura de estimulante a uma concentração de 2x.

Inibição de triptólido: PBMCs foram semeados a 5 & vezes 10 4 / poço em volume de 50 & microL de meio RPMI completo. Depois de permitir que as células se recuperem por 1 hora a 37 & degC, em um CO 5% umidificado2 ambiente, o tratamento com triptólido foi adicionado em meio RPMI completo a 4x da concentração final para cada poço em 50 & microL. A mistura de estímulos de IL-2 (2x) foi então adicionada em 100 e microL para um volume final de 200 e microL.

Ensaio ELISpot de uma cor: Os ensaios foram realizados de acordo com as instruções do kit U-Cytech BioSciences. Após a semeadura, as células foram incubadas por 24 horas, a 37 & degC em um CO a 5% umidificado2 placas de ambiente e, em seguida, testado usando um kit ELISpot. Resumidamente, as células foram removidas por lavagem 5x com 250 & microL PBS-Tween 0,05% usando um distribuidor multimodo Agilent BioTek MultiFlo FX. Um anticorpo de detecção biotinilado (100 e microL) é adicionado ao poço e incubado por 60 minutos a 37 ° C ou durante a noite a 5 ° C, após o que o anticorpo de detecção não ligado foi removido por lavagem. Um conjugado de estreptavidina-HRP foi então adicionado (100 & microL) e incubado a 37 & degC por 60 minutos. Novamente, o conjugado não ligado é removido por lavagem. Em seguida, um substrato de AEC de duas partes foi adicionado que deposita o corante no fundo da membrana do poço. As reações foram interrompidas após 30 minutos à temperatura ambiente por lavagem com água desionizada (250 e microL) 3x usando o MultiFlo FX e deixadas secar no escuro. Poços inteiros foram então fotografados.

Desenvolvimento de ELISpot de duas cores: Os ensaios foram realizados de acordo com o C.T. L. Instruções do kit ELISpot de 2 cores Immunospot. Após a semeadura, as células foram incubadas por 24 horas, a 37 & degC em um CO a 5% umidificado2 as placas de ambiente foram então testadas usando um kit ELISpot. Resumidamente, as células foram removidas por lavagem 5x com 250 & microL PBS-Tween 0,05% usando um distribuidor multimodo MultiFlo FX. Uma solução de anticorpo de detecção (80 & microL / poço) foi adicionada ao poço e deixada incubar em temperatura ambiente (RT) por 120 minutos, após o que o anticorpo de detecção não ligado é removido por lavagem. Solução terciária (80 & microL / poço) foi adicionada e deixada incubar por 60 minutos em temperatura ambiente. Os reagentes que não reagiram foram removidos por lavagem 2x com PBS-Tween, seguido por 2 lavagens com dH2O e depois secar ao ar livre no escuro. A solução reveladora azul foi então adicionada (80 & microL / poço) e incubada por 15 minutos à temperatura ambiente. A reação foi interrompida por lavagem 3x com dH2O. A solução de revelador vermelho foi então adicionada (80 & microL / poço) e incubada à temperatura ambiente por 7 minutos. A placa foi lavada 3x com dH2O. A placa é seca ao ar no escuro por pelo menos 2 horas antes da imagem.

Lavagem de placas

As placas foram lavadas de acordo com as instruções do kit de ensaio usando um MultiFlo Washer Dispenser (BioTek Instruments. O tampão de lavagem consistia em PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 7,4 mM) suplementado com 0,05% de Tween 20. A menos que especificamente indicado, as placas foram lavadas cinco vezes com 250 µL de tampão por poço.

Imagem de placa: As microplacas preparadas foram fotografadas usando um leitor multimodo de imagem de células Cytation configurado com uma câmera colorida vertical. O gerador de imagens usa uma fonte de luz LED branca em conjunto com uma câmera digital colorida. Uma série de imagens foi tirada com a lente 2x para obter a imagem de todo o poço em um único quadro. Uma vez que o plano focal e a exposição da câmera foram determinados manualmente, as imagens foram capturadas automaticamente usando uma rotina de altura focal fixa usando luz refletida no Gen5.

Tabela 1. Parâmetros de captura e pré-processamento de imagens.

mesa 2. Parâmetros de análise de imagem.

Resultados e discussão

Experimentos iniciais demonstram a especificidade da reação ELISpot. PBMCs que foram estimulados com uma combinação de PMA / ionomicina produzem vários pontos, enquanto as células não estimuladas produzem poucos ou nenhum. O tratamento sozinho sem PBMCs não produz manchas.

Figura 4. Especificidade da reação IL-2 ELISpot. Imagens de poços ELISpot contendo PBMCs tratados com ou sem PMA (1 ng / mL), ionomicina (1 & microg / mL). Controle negativo que não tem células, mas recebeu estimulante.


O dimensionamento correto dos objetos identificados é necessário para determinações precisas. A intenção do ensaio ELISpot é identificar e quantificar o número de células que respondem a estímulos específicos. A placa revestida com anticorpo captura seu alvo específico em vez da célula secretora real. Enquanto a maior parte do analito secretado será capturado na área imediatamente ao redor da posição da célula, parte do analito se difundirá na mídia e será capturado em outro lugar. A alta concentração de analito próximo à célula resultará em um ponto tão grande ou maior do que o tamanho físico da célula, enquanto o analito disperso resultará em depósitos intensos muito pequenos. A Figura 5 demonstra o número de manchas presentes em um poço ELISpot típico. Apenas os pontos que excedem 25 & microm em tamanho são designados como pontos verdadeiros.

Figura 5. Gráfico de dispersão do tamanho do objeto vs densidade vermelha. Todos os pontos atingindo um limite verde de 7000 maior do que foram plotados contra seu número de designação. O limite de tamanho de 25 & microm é indicado com uma linha vertical azul.

O número de pontos registrados produzidos a partir de células estimuladas é proporcional ao número de células secretoras. Quando uma titulação de PBMCs é exposta a uma concentração fixa de estimulante, o número de pontos contados é proporcional ao número de células. Conforme demonstrado na Figura 6, aumentar o número de células em um poço resulta em um aumento na contagem de pontos. Contagens de células acima de 50.000 por poço resultaram na coalescência dos pontos. Os experimentos subsequentes usaram 5.000 células por poço.

Figura 6. Titulação de células. PBMC foram semeados em várias concentrações em uma placa de ELISpot e estimulados com 50 ng / mL de PMA, 1 µg / mL de ionomicina por 24 horas. A placa ELISpot foi então testada quanto à secreção de IL-2. Os pontos de dados representam a média de 8 determinações.


A estimulação da secreção de IL-2 por uma mistura de PMA e ionomicina é dependente da dose. Conforme observado na Figura 7, o aumento da concentração de PMA produz mais manchas.

Figura 7. Titulação de estimulação de PMA. PBMCs (5000 células / poço) foram estimulados com várias diluições de PMA e 1 & microg / mL Ionomycin por 24 horas em uma placa ELISpot revestida com anticorpo IL-2. Após a estimulação, a secreção de IL-2 foi avaliada e os pontos contados. Os pontos de dados representam a média de 7 determinações.

O pré-tratamento de PBMCs com Triptolide por 1 hora antes da estimulação reduz a secreção de IL-2 de uma maneira dependente da dose. Conforme demonstrado na Figura 8, concentrações crescentes de triptólido resultam em menos manchas indicativas de uma célula secreta de IL-2. Nestes experimentos, uma dose estimulatória de 80% do máximo foi empregada. O IC50 nessas condições foi determinado como 40 nM, o que é semelhante ao relato da literatura 8.

Figura 8. Inibição da secreção de IL-2 por triptólido. PBMCs (5000 células / poço) foram pré-incubados por 60 minutos com várias concentrações de triptólido foram estimulados com 6 ng / mL de PMA, 1 & microg / mL de ionomicina, para secretar IL-2. Após 24 horas, a placa ELISpot foi testada quanto à secreção de IL-2. Os dados representam a média de 7 pontos de dados.

Os ensaios Multiplex ELISpot estão disponíveis para quantificar vários analitos diferentes simultaneamente. Embora existam vários ensaios baseados em fluorescência que fornecem informações para até 4 analitos em um único poço, os ensaios ELISpot colorimétricos são limitados a dois analitos por poço. Experimentos iniciais usando um ELISpot de duas cores específico para IL-2 e IFN- & gama humana demonstraram a especificidade do ensaio para identificar especificamente células secretoras de IL-2 ou IFN- & gama. Neste ensaio, as células secretoras de IL-2 podem ser visualizadas pela formação de manchas azuis, enquanto aquelas secretoras de IFN- & gama formam manchas vermelhas. Conforme observado no experimento de controle (Figura 9), os poços revestidos com anticorpos anti-IL-2 apenas formam manchas azuis, enquanto os poços revestidos apenas com anticorpos anti-IFN- & gama formam apenas manchas vermelhas. Os poços que receberam ambos os anticorpos de revestimento formaram pontos vermelhos e azuis, enquanto as células sem estimulação de PBMCs ou PMA não formaram quaisquer pontos.

Figura 9. Especificidade da detecção de ELISpot de dois analitos. Imagens de poços de ELISpot que têm PBMC que foram tratados com ou sem PMA (10 ng / mL). As membranas dos poços foram revestidas com anticorpos específicos de IL-2 e IFN- & gama e cor desenvolvida para IL-2 ou IFN- & gama ou ambos. Controle negativo que não tem células, mas recebeu estimulante.

A discriminação entre os pontos de cor vermelha e azul pode ser obtida usando as diferenças nas densidades de vermelho e azul dos pontos. Os gráficos de histograma na Figura 10 demonstram diferenças na razão de densidade de vermelho / azul calculada entre poços de controle apenas vermelho e azul. A média da razão vermelho / azul mais duas vezes seu desvio padrão pode ser usada como o limite superior para manchas somente vermelhas. Da mesma forma, a média menos dois desvios padrão dos controles de ponto azul define o limite inferior da razão vermelho / azul para pontos azuis. Pontos com valores de razão entre esses dois limites são considerados azuis e vermelhos.

Figura 10. Análise de histograma de frequência de valores de razão de intensidade ELISpot vermelho-azul. A frequência dos valores de razão vermelho-azul de 8 poços de controle apenas vermelho e azul. A média e a média mais ou menos 2 vezes o desvio padrão da população são indicadas.

Esses valores de limiar podem ser usados ​​para quantificar reações de cor única onde apenas reações de IL-2 ou IFN- & gama são desenvolvidas. Conforme mostrado na Figura 11, as citocinas IL-2 e IFN- & gama são secretadas quando PBMCs são estimulados com PMA. A estimulação ocorre de forma dependente da concentração com o EC50 valores sendo muito semelhantes (CE50= 0,05 ng / mL). Curiosamente, duas vezes mais PBMCs, conforme medido pela contagem de manchas, são susceptíveis de secretar IFN- & gama em comparação com IL-2.

Figura 11. Comparação da secreção de IL-2 e IFN- & gama por PBMCs após estimulação com PMA. PBMCs foram estimulados com PMA em uma placa ELISpot de membrana PVDF revestida com anticorpos de captura IL-2 e IFN- & gama. Após 24 horas, as placas foram processadas e as cores desenvolvidas em poços paralelos. Os pontos (vermelho e azul) foram quantificados e representados graficamente como uma função da concentração de PMA. Os dados representam a média e o desvio padrão de poços duplicados.

A análise multiplex de 2 cores no mesmo poço pode ser realizada quando ambas as cores são desenvolvidas usando os mesmos critérios. Um histograma de frequência dos dados de vários poços separados, onde ambas as cores foram desenvolvidas nos poços, é representado na Figura 12. Quando as imagens são examinadas a olho nu, a maioria dos pontos nos poços tem pontos que são visivelmente vermelhos ou azuis, com um menor porcentagem que aparece uma mistura. Essas observações são corroboradas pelo histograma de frequência representado na Figura 12 que demonstra que os pontos identificados têm um espectro de valores de razão vermelho / azul.Existem dois picos óbvios com base na proporção vermelho / azul que correspondem aos pontos vermelhos e azuis observados quando apenas uma cor foi desenvolvida. Entre seus respectivos valores de corte está um número significativo de pontos que têm uma proporção intermediária de vermelho / azul.

Figura 12. Histograma de frequência dos valores da relação vermelho-azul ELISpot. A proporção vermelho-azul dos pontos ELISpot de 8 poços de uma placa de ensaio ELISpot de duas cores foram representados graficamente como uma função da frequência. A análise de subpopulações com base em valores de corte para manchas vermelhas, azuis ou vermelhas e azuis são indicadas por cores.

Estes correspondem visivelmente a manchas que aparecem roxas (ou seja, uma mistura de vermelho e azul). O número relativo de pontos identificados como vermelhos ou azuis é semelhante aos números identificados quando uma única cor foi desenvolvida. Quando se analisa os dados com um gráfico de dispersão que compara a razão vermelho / azul com o tamanho do ponto, dois grupos soltos de pontos que correspondem a pontos vermelhos ou azuis são observados junto com um número de pontos de razão intermediária (Figura 13). Embora todas as três subpopulações de manchas tenham o mesmo tamanho, as manchas vermelhas tendem a ser mais numerosas e menores em tamanho do que as manchas identificadas como azuis.

Figura 13. Gráfico de dispersão dos valores da razão vermelho-azul ELISpot. A proporção vermelho-azulado de manchas ELISpot de 8 poços de uma placa de ensaio ELISpot de duas cores foram representadas graficamente como uma função do tamanho. A análise de subpopulações com base em valores de corte para pontos vermelhos, azuis ou vermelhos e azuis são indicados.

Esta análise multiplex pode ser usada em poços individuais com diferentes condições experimentais. A Figura 14 demonstra a resposta de PBMCs à estimulação de PMA, onde as cores azul (IL-2) e vermelha (IFN- & gama) são desenvolvidas no mesmo poço. Tal como acontece com o desenvolvimento separado da cor, o PMA estimulou a secreção de citocinas em PBMCs de uma maneira dependente da concentração. Além disso, mais PBMCs secretaram IFN- & gama do que IL-2, com EC equivalente50 valores. Se compararmos o número total de células que secretam IFN- & gama (manchas vermelhas apenas mais manchas vermelhas e azuis) ou o número total de células que secretam IL-2 (manchas azuis apenas mais manchas vermelhas e azuis), os números são consistentes com os poços onde apenas uma cor foi desenvolvida.

Figura 14. Comparação da secreção de IL-2 e IFN- & gama em PBMCs estimulados. PBMCs foram estimulados com várias concentrações de PMA usando uma placa de membrana de PVDF de 96 poços que foi pré-revestida com anticorpos anti-IL-2 e anti-IFN- & gama. Após o processamento ELISpot, os poços da placa foram fotografados e as imagens analisadas usando Gen5. A análise de subpopulação definiu pontos que eram vermelhos, azuis ou uma mistura de vermelho e azul. O número de cada subpopulação spot foi representado graficamente contra a concentração de PMA. Os dados representam a média e o desvio padrão de 4 determinações.

Discussão

Esses dados demonstram a utilidade do leitor multimodo de imagem de célula Agilent BioTek Cytation 7 em conjunto com o leitor de microplaca Agilent BioTek Gen5 e o software de imagem para obter imagens e analisar placas de ensaio ELISpot PVDF colorimétricas. A combinação de um PMA / ionomicina demonstrou estimular marcadamente a secreção de IL-2 em PBMCs. Sem estimulação, a IL-2 está virtualmente ausente. A capacidade do triptólido, um conhecido inibidor da transcrição, de prevenir a secreção de IL-2 sugere que uma nova síntese de proteína é necessária após a estimulação. 11

ELISpot é um ensaio sensível para monitorar a resposta imune celular ex vivo no nível de uma única célula, detectando proteínas secretadas liberadas pelas células. Esta técnica foi derivada do ensaio imunoenzimático em sanduíche (ELISA) para acomodar o uso de células inteiras para identificar a frequência das células secretoras. Como tal, há uma série de parâmetros críticos que precisam ser otimizados para que os experimentos sejam bem-sucedidos. Dependendo do grau de secreção celular, os pontos desenvolvidos podem ser bastante grandes. O número esperado de células positivas é de maior importância do que o número total de células usadas inicialmente. A presença de muitas células secretoras resulta na coalescência dos pontos individuais, dificultando a determinação numérica. Por exemplo, uma investigação de um evento secretor relativamente raro exigiria que um número maior de células fosse semeado em comparação com um evento mais comum. O momento da resposta em relação à estimulação e / ou inibição é importante. Os eventos mediados pelo receptor geralmente levam mais tempo para provocar uma resposta do que uma molécula estimuladora que pode interagir diretamente com a célula. É importante que seja utilizado um intervalo apropriado entre a estimulação e a medição. O teste de inibidores ainda requer a presença de um agente estimulante. Nessas experiências, é importante que seja usada uma concentração menor do que a máxima do agente estimulador, para que não mascare quaisquer efeitos inibitórios.

O Cytation 7 é uma plataforma ideal para interpretar ensaios ELISpot de membrana PVDF colorimétrica. O gerador de imagens é compatível com imagens digitais coloridas de cima para baixo com objetivas de microscópio 2x, 4x e 8x instaladas de fábrica. A objetiva 2x pode capturar todo o poço em uma única imagem, tornando-a ideal para a determinação de ELISpot de 96 poços. Se desejado, uma resolução mais alta pode ser obtida usando uma objetiva de maior ampliação e uma montagem do poço. Usando esta câmera, tanto a luz refletida quanto a transmitida podem ser usadas para obter imagens ideais. Embora esta pesquisa tenha usado apenas a câmera vertical de cima para baixo com placas de membrana PVDF, o gerador de imagens também suporta imagens de campo claro usando uma câmera invertida para ensaios ELISpot de coloração de prata. Além disso, o microscópio invertido suporta microscopia baseada em fluorescência com LED e cubos de filtro. O leitor de microplaca Gen5 e o software de imagem, além de controlar a função do leitor, podem ser usados ​​para realizar a costura de blocos de imagens de montagem separados, realizar subtração de fundo e mascarar regiões fora do poço antes da análise.