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As duplicatas de PCR podem ter sequências complementares?

As duplicatas de PCR podem ter sequências complementares?


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É comum, ao analisar dados de sequenciamento shotgun de genoma inteiro pareado, verificar e eliminar duplicatas de PCR. O raciocínio é que a probabilidade de amostrar um fragmento do genoma do mesmo comprimento exato da mesma posição exata no genoma várias vezes é extremamente baixo. Portanto, se você vir vários pares de leitura com a mesma sequência exata em ambos os pares, eles não representam eventos independentes, mas são cópias múltiplas do mesmo evento.

Minha pergunta é se as duplicatas do PCR podem ser complementos reversos entre si. Todas as duplicatas de PCR que eu mesmo observei eram exatamente a mesma sequência, exatamente na mesma fita. Existe uma razão técnica para isso, ou é possível que as duplicatas de PCR não possam estar na mesma fita que as outras?


Os protocolos de preparação de biblioteca direcional padrão Illumina que são usados ​​na instalação em meu prédio seguem o esquema abaixo:

Então, eu acho que isso fornece uma explicação técnica potencial para suas duplicatas perdidas, com a resposta ampla e simples sendo que depende do protocolo usado para fazer as bibliotecas.


Depende exatamente de onde está a etapa de PCR na preparação da sua biblioteca. Normalmente, há um que é feito depois que os adaptadores são adicionados, para amplificar fragmentos com primers intactos em ambos os lados. É claro que todas terão a mesma orientação.


Expressos duplicados invertidos estruturalmente estáveis ​​em genomas de mamíferos como elementos funcionais não codificadores

Duplicatas invertidas são um tipo de motivos repetitivos de DNA que consistem em duas cópias de sequências complementares reversas separadas por uma sequência espaçadora. Eles podem levar à instabilidade do genoma e muitos podem não ter função, mas alguns pequenos RNAs funcionais são processados ​​a partir de grampos de cabelo transcritos a partir desses elementos. Não está claro se o número generalizado de tais elementos nos genomas, especialmente os de mamíferos, é o resultado de altas taxas de geração de eventos de duplicação neutros ou levemente deletérios ou seleção positiva para funcionalidade. Para testar a funcionalidade de duplicatas invertidas intergênicas sem funções conhecidas, usamos duplicatas de espelho, um tipo de motivos repetitivos de DNA com poucas funções relatadas e pouco potencial para formar grampos de cabelo quando transcritos, como um controle não funcional. Identificamos um grande número de duplicatas invertidas em regiões intergênicas de genomas humanos e de camundongo, bem como 19 outros genomas de vertebrados. A caracterização da estrutura dessas duplicatas invertidas revelou maior proporção para formar grampos de cabelo estáveis ​​em comparação com duplicatas de espelho convertidas, sugerindo que as duplicatas invertidas podem produzir RNAs em grampo. O perfil de expressão em tecidos demonstrou que 7,8% dos humanos e 5,7% dos duplicados invertidos de camundongos foram expressos mesmo sob critérios estritos. Descobrimos que duplicatas invertidas expressas eram mais prováveis ​​de serem estruturalmente estáveis ​​do que duplicatas invertidas não expressas e duplicatas de espelho convertidas expressas. Ao datar duplicatas invertidas na árvore filogenética dos vertebrados, observamos maior conservação de duplicatas invertidas do que duplicatas espelhadas. Estas observações suportam a noção de que duplicatas invertidas expressas podem ser funcionais através da formação de RNAs em gancho.

Palavras-chave: O RNA em grampo de cabelo do Homo sapiens Mus musculus repete repetições invertidas do RNA não codificador.

© The Author (s) 2017. Publicado pela Oxford University Press em nome da Society for Molecular Biology and Evolution.

Figuras

Abundância de duplicatas invertidas e ...

Abundância de duplicatas invertidas e duplicatas espelhadas. ( UMA e B ) Esquemático ...

Estruturas de duplicatas invertidas. (…

Estruturas de duplicatas invertidas. ( UMA e B ) Gráfico de caixa e bigode ...

Expressão de duplicados invertidos. (…

Expressão de duplicados invertidos. ( UMA e B ) Porcentagem de estruturalmente estável ...

Conservação de duplicatas invertidas. (…

Conservação de duplicatas invertidas. ( UMA ) Duplicatas invertidas humanas originadas em cada ...


Ferramentas UMI: modelagem de erros de sequenciamento em identificadores moleculares exclusivos para melhorar a precisão da quantificação

Identificadores moleculares únicos (UMIs) são códigos de barras de oligonucleotídeos aleatórios que são cada vez mais usados ​​em experimentos de sequenciamento de alto rendimento. Por meio de um IHM, cópias idênticas originadas de moléculas distintas podem ser distinguidas daquelas originadas pela amplificação por PCR da mesma molécula. No entanto, os métodos bioinformáticos para alavancar as informações dos IHMs ainda não foram formalizados. Em particular, erros de sequenciamento na sequência UMI são freqüentemente ignorados ou então resolvidos de maneira ad hoc. Mostramos que os erros na sequência UMI são comuns e introduzimos métodos baseados em rede para contabilizar esses erros ao identificar duplicatas de PCR. Usando esses métodos, demonstramos precisão de quantificação aprimorada tanto em condições simuladas quanto em conjuntos de dados iCLIP reais e RNA-seq de célula única. A reprodutibilidade entre as réplicas de iCLIP e o agrupamento de RNA-seq de uma única célula são aprimorados usando nosso método proposto com base em rede, demonstrando o valor de contabilizar adequadamente os erros em UMIs. Esses métodos são implementados no pacote de software de ferramentas UMI de código aberto.

© 2017 Smith et al. Publicado pela Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Figuras

Erros de modelagem em IHMs. ( UMA ) Representação esquemática de como os IHMs são ...

Comparação de métodos com simulado ...

Comparação de métodos com dados simulados. Em cada painel, todos menos um de ...

UMI-tools melhora a reprodutibilidade entre iCLIP ...

UMI-tools melhora a reprodutibilidade entre réplicas iCLIP. ( UMA ) Distâncias médias de edição entre ...

UMI-tools melhora a precisão e clustering ...

As ferramentas UMI melhoram a precisão e o agrupamento em seq de RNA de uma única célula. ( UMA ) Edição média ...


MATERIAIS E MÉTODOS

Preparação e amplificação de DNA

Os oligonucleotídeos adaptadores foram fosforilados em 5 '(Phos) e purificados por HPLC. Adaptadores consistiu de YSnv 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGTAGAATGTG-3 ', e qualquer YSvA 5'-Phos-ATGCACATTCTA T GTVBDHVRYCTGAGTCGGAGACACGCAGGGATGAGATGG-3' ou 5'-Phos YSvG-ATGCACATTCTA C GTVBDHVRYCTGAGTCGGAGACACGCAGGGATGAGATGG-3 '. Os oligonucleotídeos foram emparelhados em 1x NEBuffer 2 (NEB), por aquecimento a 95 ° C por 5 min e resfriamento de 95 ° C a 20 ° C a uma taxa de 1 ° C min. O DNA genômico humano (Promega) foi digerido com FatI (NEB), preenchido com dCTP e ligado a adaptadores YSvG-YSnv ou YSvA-YSnv. As duas bibliotecas de adaptadores diferentes foram então agrupadas em volumes iguais e concentradas por grânulos AMPure XP (Agencourt Bioscience, Beverley, MA, EUA) antes do sequenciamento.

Para análises de PCR, geramos bibliotecas ligando os adaptadores YSvA2-YSnv e YSvG2-YSnv ao DNA genômico humano digerido com FatI e preenchido com dCTP. YSvA2 tem a sequência 5'-Phos-AGTGAGTCGHNNTGTVBDHVRYCTGAGTCGGAGACACGCAGGGATGAGATGGCACATTCTA-3 ', 5'-Phos YSvG2-AGTGAGTCGHNNCGTVBDHVRYCTGAGTCGGAGACACGCAGGGATGAGATGGCACATTCTA-3' e 5'-Phos YSnv2-ATGTAGAATGTGTCTCCCTAT-3 '. Após a ligação do adaptador, as bibliotecas foram agrupadas em volumes iguais e concentradas usando esferas AMPure XP. A biblioteca de DNA agrupada foi então diluída para 50 ng / μl em tampão 1x Taq DNA ligase (NEB) com tala de oligonucleotídeo 1,5 μM (5′-CGACTCACTATAGGGAGA-3 ′) e 40 U de Taq DNA ligase (NEB) em uma reação de 50 μl . A reação foi aquecida a 95 ° C durante 5 min antes da incubação a 45 ° C durante 90 min. Após a ligação, diferentes volumes da reação de circularização foram adicionados às reações de iPCR individuais (correspondendo a biblioteca de 50, 100 e 250 ng). As reações de iPCR continham 0,3 μM cada 5′-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCA GTCTCAGAAAGGCAGTGCGGTAAATGCA-3 ′ e reverso 5′-GTGTGTAGTACCAGCAGAGGGGG-3 ′ primer, 1x GoTaM Incolor Flexi Buffer 2,5 m (PromegaCl) 2 , 0,2 mM cada dNTP e 1,25 U de GoTaq Hot Start Polymerase (Promega). A ciclagem foi realizada a 95 ° C por 2 min seguido por 31 ciclos a 95 ° C por 30 s, 62 ° C por 30 se 72 ° C por 2 min 30 s e uma extensão final a 72 ° C por 10 min. Os produtos de PCR foram purificados por esferas AMPure XP antes do sequenciamento.

O modelo para sequenciamento foi quantificado por PicoGreen e Bioanalyzer DNA 1000 Lab-Chip (Agilent) e diluído para 1 × 10 7 moléculas / μl. As bibliotecas foram amplificadas por PCR de emulsão usando o kit GS Titanium emPCR (Lib-L) (454, Roche, Basel) usando as recomendações do fabricante, exceto que a biblioteca de entrada consistia em DNA de fita dupla. Cada amostra foi sequenciada em 1/16 de um único PicoTitrePlate usando o kit GS FLX Titanium Sequencing XLR70 (454, Roche, Basel) de acordo com as recomendações do fabricante. O processamento de sinal foi realizado usando o pipeline de análise de dados de espingarda 454 padrão.

Processamento de dados

As leituras foram processadas e mapeadas usando o mapeador Roche Newbler. Scripts personalizados foram usados ​​para processar os dados usando Python. Os gráficos foram produzidos usando ggplot2 em R (12, 13).


Discussão

As duas ferramentas computacionais mais amplamente utilizadas para remoção de duplicatas de PCR, Picard MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard/) e SAMtools rmdup [3] dependem apenas das coordenadas de mapeamento de leituras de sequenciamento. Nossos dados sugerem que a maioria das leituras idênticas refletem a realidade biológica. Assim, a remoção de leituras duplicadas de PCR usando apenas as coordenadas de mapeamento elimina erroneamente muitas leituras utilizáveis, particularmente aquelas produzidas a partir de transcrições curtas e pequenos RNAs. Isso é consistente com um estudo anterior que comparou os dados de RNA-seq gerados usando três métodos de preparação de biblioteca diferentes (Smart-Seq, TruSeq e UMI-seq) [43] e relatou que a remoção de duplicatas de PCR sem UMIs introduziu viés nos dados de RNA-seq. Existem também métodos computacionais que avaliam as taxas de duplicação de PCR sem UMIs, por exemplo, usando mapeamento de leituras para variantes heterozigotas [44] ou níveis de expressão gênica [45], mas eles apenas estimam frequências duplicadas e não podem identificar com precisão leituras duplicadas. Nossa abordagem se baseia em UMIs e pode identificar com precisão todas as duplicatas de PCR, independentemente da expressão do gene e variantes genômicas.

Os oito tecidos de camundongo que analisamos abrangem uma gama de complexidade de transcriptoma: análises anteriores mostraram que o transcriptoma de testículo de camundongo contém

18.700 transcritos de codificação de proteínas autossômicas,

31,7 Mb de RNA intergênico, enquanto o transcriptoma do fígado contém apenas

15.500 transcritos codificadores de proteínas autossômicas,

7,2 Mb de RNA intergênico [29]. Entre os oito tecidos de camundongo que testamos, a remoção de leituras duplicadas com base apenas em coordenadas de mapeamento elimina muitas leituras biologicamente significativas, mesmo quando as bibliotecas foram feitas usando amplo RNA inicial e condições experimentais ideais. Dada a anti-correlação entre a complexidade do RNA e a ocorrência de duplicado de PCR, os UMIs irão melhorar a precisão da comparação da abundância de RNA longa ou pequena em diferentes tecidos ou tipos de células. RNAs curtos, como miRNAs e piRNAs, bem como transcritos altamente abundantes são particularmente suscetíveis à subestimação pelo método de coordenadas de mapeamento convencional de remoção de duplicatas por PCR.

Testamos a importância de um aspecto-chave do processamento de dados necessário para correção de erros usando IHMs e mostramos que em condições experimentais típicas para sequenciamento em massa (Fig. 4, linhas pontilhadas Arquivo adicional 2: Figura S1), corrigindo ou não corrigindo erros na IHM sequências tem pouco efeito absoluto na quantificação de duplicados de PCR. No entanto, bibliotecas de sequenciamento feitas de um pequeno número de células ou de uma pequena quantidade de tecido ou RNA, tornaram-se cada vez mais comuns [46] e são mais gravemente afetadas por duplicatas de PCR. O sequenciamento de uma única célula apresenta três desafios específicos para a remoção de duplicatas por PCR. Primeiro, ele usa uma quantidade limitada de RNA inicial, causando baixa complexidade da biblioteca. Em segundo lugar, a descoberta contínua de novas espécies de RNAs não codificantes, muitos mal compreendidos, aumenta o número de espécies sendo medidas, exigindo UMIs mais longos. Finalmente, a profundidade de sequenciamento cada vez mais alta fornecida pelos avanços na tecnologia aumenta o número de espécies que podem ser detectadas e o ruído de fundo. Juntos, esses três fatores tornam a medição duplicada de PCR sem correção de erro UMI especialmente problemática para sequenciamento de célula única. Na verdade, uma série de protocolos foram desenvolvidos para incorporar UMIs para sequenciamento de uma única célula [47]. Compilamos todos os métodos UMI conhecidos por nós no arquivo adicional 3, incluindo os protocolos bulk e single-cell, RNA-seq e pequenos RNA-seq.

Comparado a outros protocolos UMI (arquivo adicional 3), nosso método tem vários recursos novos. Primeiro, nosso protocolo UMI RNA-seq fragmenta o RNA antes da iniciação aleatória do hexâmero da síntese de cDNA. Ele captura tanto o RNA poli (A) + quanto o poli (A) - RNA enquanto limita o viés da extremidade 3′. Em comparação, a síntese de cDNA de troca de modelo é comumente usada em protocolos de sequenciamento de célula única, ela captura cDNAs de comprimento total de forma mais eficiente, mas também é propensa a viés significativo de extremidade 3 'e perda de espécies de poli (A) - RNA devido a oligo (dT ) iniciação [14, 48, 49]. Em segundo lugar, nosso protocolo UMI RNA-seq rendeu dados de alta qualidade de material de partida de 125 ng e nosso protocolo UMI pequeno RNA-seq de 39 ng. Nossos protocolos não requerem pré-amplificação e realizam fragmentação antes da síntese de cDNA. Consequentemente, esses métodos capturam todas as duplicatas de PCR. Terceiro, nosso protocolo pode acomodar um grande número de UMIs: sequências aleatórias com 5✕2 nt para RNA-seq e 9✕2 nt para RNA-seq pequeno. Assim, nosso protocolo pode ser usado para estudar RNA com alta diversidade de sequência: por exemplo, piRNA na linha germinativa. Em nossas mãos, longos trechos de nucleotídeos aleatórios interferem na construção e no sequenciamento da biblioteca, enquanto o uso e a colocação de localizadores UMI melhoram a qualidade do sequenciamento. Com o uso crescente de pequenas quantidades de materiais iniciais, nosso protocolo complementa outras abordagens (arquivo adicional 3).

Nossa abordagem UMI se baseia em protocolos bem estabelecidos, exigindo poucas alterações nos procedimentos e pouco custo adicional. Esperamos que a análise UMI seja particularmente útil ao sequenciar RNAs derivados de um número limitado de loci genômicos, como CaptureSeq [50] e CAGE-seq [51]. Nossa abordagem pode, teoricamente, ser adaptada a qualquer técnica de sequenciamento usando adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos. Por exemplo, o sequenciamento da imunoprecipitação da cromatina (ChIP-seq) e sua alternativa CUT & ampRUN pesquisam as regiões genômicas ligadas por proteínas de interesse [52, 53]. O método CUT & ampRUN usa uma nuclease para alcançar a clivagem da cromatina mais precisa do que o procedimento ChIP-seq convencional, que utiliza sonicação para cisalhar o DNA aleatoriamente. Consequentemente, CUT & ampRUN aumenta a probabilidade de leituras idênticas, mas significativas. Por sua natureza, os fragmentos ligados a proteínas também mapeiam para uma porção menor de posições genômicas do que as leituras de RNA-seq. Os UMIs podem melhorar a descoberta de locais de ligação de proteínas, minimizando o ruído. Da mesma forma, perfis de sequenciamento de degradome as extremidades 5 'de produtos de RNA clivado 3' [54] incorporando UMIs permitirá a quantificação precisa da abundância de RNA clivado.


O que são primers de PCR?

Os primers são fitas simples de ácidos nucléicos (oligonucleotídeos sintéticos) que são necessários para iniciar a PCR. Essas fitas simples de DNA ou RNA são específicas e complementares à porção da sequência de DNA / RNA alvo. Durante a fase de resfriamento (anelamento) da PCR, o primer se liga ao alvo e inicia a cópia da sequência de DNA / RNA alvo. Os primers são usados ​​em pares, conhecidos como primers direto e reverso. Oferecemos oligos personalizados em vários formatos.

As sequências de primer devem ser escolhidas para atingir uma região única do DNA, evitando a possibilidade de hibridização com uma sequência semelhante. Ao projetar os primers, os pares devem ter temperaturas de fusão semelhantes porque a etapa de recozimento ocorre para ambas as fitas simultaneamente. Além disso, um primer com um Tm (temperatura de fusão) muito mais alta do que a temperatura de anelamento da reação poderia hibridizar e se estender em uma sequência de DNA indesejada. UMA Tm muito mais baixa do que a temperatura de recozimento pode resultar em falha no recozimento.


Clonagem Molecular

Em geral, a palavra "clonagem" significa a criação de uma réplica perfeita, no entanto, em biologia, a recriação de um organismo inteiro é chamada de "clonagem reprodutiva". Muito antes de serem feitas tentativas de clonar um organismo inteiro, os pesquisadores aprenderam como reproduzir regiões ou fragmentos desejados do genoma, um processo conhecido como clonagem molecular.

A clonagem de pequenos fragmentos do genoma permite a manipulação e o estudo de genes específicos (e seus produtos proteicos) ou de regiões não codificantes isoladas. Um plasmídeo (também chamado de vetor) é uma pequena molécula de DNA circular que se replica independentemente do DNA cromossômico. Na clonagem, as moléculas de plasmídeo podem ser usadas para fornecer uma pasta & # 8220 & # 8221 na qual inserir um fragmento de DNA desejado. Os plasmídeos são geralmente introduzidos em um hospedeiro bacteriano para proliferação. No contexto bacteriano, o fragmento de DNA do genoma humano (ou genoma de outro organismo que está sendo estudado) é referido como DNA estranho, ou transgene, para diferenciá-lo do DNA da bactéria, que é chamado de DNA do hospedeiro.

Os plasmídeos ocorrem naturalmente em populações bacterianas (como Escherichia coli) e têm genes que podem contribuir com características favoráveis ​​ao organismo, como resistência a antibióticos (a capacidade de não ser afetado por antibióticos). Os plasmídeos foram reaproveitados e projetados como vetores para a clonagem molecular e a produção em grande escala de reagentes importantes, como a insulina e o hormônio de crescimento humano. Uma característica importante dos vetores de plasmídeo é a facilidade com que um fragmento de DNA estranho pode ser introduzido através do sítio de clonagem múltipla (MCS). O MCS é uma sequência curta de DNA contendo vários locais que podem ser cortados com diferentes endonucleases de restrição comumente disponíveis. As endonucleases de restrição reconhecem sequências específicas de DNA e as cortam de maneira previsível, sendo naturalmente produzidas por bactérias como mecanismo de defesa contra DNA estranho. Muitas endonucleases de restrição fazem cortes escalonados nas duas fitas de DNA, de modo que as extremidades do corte tenham uma saliência de fita simples de 2 ou 4 bases. Como essas saliências são capazes de recozer com saliências complementares, elas são chamadas de "extremidades pegajosas". A adição de uma enzima chamada DNA ligase une permanentemente os fragmentos de DNA por meio de ligações fosfodiéster. Desta forma, qualquer fragmento de DNA gerado pela clivagem por endonuclease de restrição pode ser dividido entre as duas extremidades de um DNA de plasmídeo que foi cortado com a mesma endonuclease de restrição (Figura).


Replicação de DNA em eucariotos

Como os genomas eucarióticos são muito complexos, a replicação do DNA é um processo muito complicado que envolve várias enzimas e outras proteínas. Ocorre em três estágios principais: iniciação, alongamento e término.

Lembre-se de que o DNA eucariótico se liga a proteínas conhecidas como histonas para formar estruturas chamadas de nucleossomos. Durante a iniciação, o DNA fica acessível às proteínas e enzimas envolvidas no processo de replicação. Como a máquina de replicação sabe onde na dupla hélice do DNA deve começar? Acontece que existem sequências de nucleotídeos específicas chamadas origens de replicação, nas quais a replicação começa. Certas proteínas se ligam à origem da replicação, enquanto uma enzima chamada helicase se desenrola e abre a hélice do DNA. À medida que o DNA se abre, estruturas em forma de Y chamadas garfos de replicação são formadas (Figura 3). Duas bifurcações de replicação são formadas na origem da replicação e são estendidas em ambas as direções conforme a replicação prossegue. Existem várias origens de replicação no cromossomo eucariótico, de modo que a replicação pode ocorrer simultaneamente em vários locais do genoma.

Durante o alongamento, uma enzima chamada DNA polimerase adiciona nucleotídeos de DNA à extremidade 3 e # 8242 do modelo. Como a DNA polimerase só pode adicionar novos nucleotídeos no final de um backbone, uma sequência de primer, que fornece esse ponto de partida, é adicionada com nucleotídeos de RNA complementares. Este primer é removido posteriormente, e os nucleotídeos são substituídos por nucleotídeos de DNA. Uma fita, que é complementar à fita de DNA parental, é sintetizada continuamente em direção à forquilha de replicação para que a polimerase possa adicionar nucleotídeos nessa direção. Esta fita sintetizada continuamente é conhecida como a fita principal. Como a DNA polimerase só pode sintetizar DNA na direção 5 & # 8242 a 3 & # 8242, a outra nova fita é reunida em pedaços curtos chamados fragmentos de Okazaki. Cada fragmento de Okazaki requer um primer feito de RNA para iniciar a síntese. A fita com os fragmentos de Okazaki é conhecida como fita retardada. Conforme a síntese prossegue, uma enzima remove o primer de RNA, que é então substituído por nucleotídeos de DNA, e as lacunas entre os fragmentos são seladas por uma enzima chamada DNA ligase.

O processo de replicação do DNA pode ser resumido da seguinte forma:

  1. O DNA se desenrola na origem da replicação.
  2. Novas bases são adicionadas às fitas parentais complementares. Uma nova vertente é feita continuamente, enquanto a outra vertente é feita em pedaços.
  3. Os primers são removidos, novos nucleotídeos de DNA são colocados no lugar dos primers e a estrutura é selada por DNA ligase.

Como funciona o PCR?

A PCR é baseada na capacidade de uma enzima DNA polimerase de sintetizar uma fita complementar a um segmento-alvo de DNA em uma mistura de tubo de ensaio das quatro bases de DNA. Como a DNA polimerase não pode iniciar a adição de bases a uma fita de DNA, a mistura também deve conter dois fragmentos de DNA chamados primers. Os iniciadores têm cerca de 20 pares de bases de comprimento e sequências complementares às áreas adjacentes a cada lado da sequência alvo.

O projeto do primer requer que a sequência de DNA em torno do segmento a ser amplificado já seja conhecida. Os primers podem ser construídos em laboratório ou adquiridos de fornecedores comerciais. Se bem escolhida, a sequência de 20-25 pares de bases será única em todo o genoma humano, portanto, corresponderá apenas ao local especificamente escolhido. Isso garantirá que a área a ser copiada seja limitada ao segmento de destino específico. Para um vídeo informativo sobre o design do primer, consulte a guia PCR Primer Design no topo desta página.

O processo básico de PCR é ilustrado no diagrama abaixo.

Magnus Manske [CC BY-SA 2.5 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/2.5), GFDL (http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html) ou CC-BY-SA -3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/)], via Wikimedia Commons.

1) A mistura contendo a amostra de DNA, primers, bases de nucleotídeos livres e DNA polimerase é aquecida a 96 ° C para desnaturar (separar as duas fitas) o DNA de fita dupla

2) Em seguida, é resfriado a 68 ° C para permitir que os iniciadores encontrem e se unam (liguem) às suas sequências complementares nas fitas separadas.

3) A temperatura é então elevada para 72 ° C e a polimerase (P) estende os primers em novas fitas complementares para cada uma das fitas originais de DNA.

4) O primeiro ciclo está completo. As duas fitas de DNA resultantes constituem o DNA modelo para o próximo ciclo, dobrando assim a quantidade de DNA duplicado em cada novo ciclo.

Ciclos repetidos de aquecimento e resfriamento multiplicam o DNA alvo exponencialmente, uma vez que cada nova fita dupla se separa para se tornar dois modelos para síntese posterior. Em cerca de 1 hora, 20 ciclos de PCR podem amplificar o alvo um milhão de vezes. Em 32 ciclos com 100% de eficiência, 1,07 bilhão de cópias da região alvo do DNA são criadas

Todo o processo de ciclo do PCR é automatizado e pode ser concluído em apenas algumas horas. É dirigido por uma máquina chamada termociclador, que é programada para alterar a temperatura da reação a cada poucos minutos para permitir a desnaturação e síntese do DNA. Para evitar a destruição das enzimas necessárias nas misturas pelas altas temperaturas necessárias para desnaturar o DNA, as enzimas de bactérias que prosperam em fontes termais são usadas no processo.


Componentes

O PCR é usado para amplificar uma região específica de uma fita de DNA (o DNA alvo). A maioria dos métodos de PCR normalmente amplificam fragmentos de DNA de até

10 pares de bases de quilo (kb), embora algumas técnicas permitam a amplificação de fragmentos de até 40 kb de tamanho. A reação produz uma quantidade limitada de produto amplificado final que é governado pelos reagentes disponíveis na reação e pela inibição por feedback dos produtos da reação. Uma configuração de PCR básica requer os seguintes componentes e reagentes:

  • Molde de DNA que contém a região de DNA (alvo) a ser amplificado
  • Dois primers que são complementares às extremidades 3 & prime (três prime) de cada uma das fitas sense e anti-sense do DNA alvo
  • Taq polimerase ou outra DNA polimerase com uma temperatura ótima em torno de 70 & degC
  • Desoxinucleosídeo trifosfatos (nucleotídeos dNTPs contendo grupos trifosfato), os blocos de construção a partir dos quais a DNA polimerase sintetiza uma nova fita de DNA
  • Solução tampão, proporcionando um ambiente químico adequado para ótima atividade e estabilidade da DNA polimerase. Cátions valentes, íons de magnésio ou manganês geralmente Mg2 +
  • Íons de potássio cátion monovalentes

Normalmente, o PCR consiste em uma série de 20-40 mudanças de temperatura repetidas, chamadas de ciclos, com cada ciclo geralmente consistindo de duas a três etapas discretas de temperatura, geralmente três. As temperaturas usadas e o tempo de aplicação em cada ciclo dependem de diversos parâmetros. Isso inclui a enzima usada para a síntese de DNA, a concentração de íons divalentes e dNTPs na reação e a temperatura de fusão (Tm) dos primers.