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Artigos onde a oligomerização de proteínas foi projetada para longe

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Eu tenho uma proteína que atua como um monômero, mas parece ter uma autoafinidade relativamente alta in vivo (medida usando a transfecção transitória de um plasmídeo que codifica a proteína), o que é irritante porque estou tentando criar uma autoassociação condicional como com FRB-FKBP com rapamicina. Houve algum artigo em que a auto-aglutinação de uma proteína foi projetada para longe?

Minha abordagem atual é usar threading para identificar uma estrutura de proteína e um programa de docking para identificar locais de auto-interação e transformar esses locais em mutação.


Oligomerização do receptor acoplado à proteína G e seu potencial para descoberta de drogas

O genoma humano codifica mais de 1.000 receptores acoplados à proteína G (GPCRs), tornando essas proteínas a maior classe de alvos de drogas, e estima-se que 50% de todas as drogas modernas modulam a atividade de GPCR. Apesar da recente descoberta de que esses receptores formam complexos homo-oligoméricos e hetero-oligoméricos, virtualmente todas as terapêuticas direcionadas a GPCRs foram projetadas usando ensaios que presumem que esses receptores são monoméricos, e este aspecto importante da biologia de GPCR permanece amplamente não incorporado em esquemas de busca por novas terapêuticas.

Embora não seja conhecido o quão grandes são os oligômeros GPCR ou se os receptores podem existir em vários estados oligoméricos, a montagem de oligômeros formados corretamente parece ser um requisito para o transporte celular adequado para a superfície celular. A oligomerização de um receptor com formas mutantes ou variantes de si mesmo pode resultar na atenuação da expressão do receptor e pode, portanto, representar um mecanismo de doença potencial ou um meio de modulação autorregulatória celular da função do receptor.

Tradicionalmente, pensa-se que a amplificação do sinal ocorre apenas no nível da proteína G ou do efetor, e não no nível do receptor. No entanto, tanto a homo quanto a hetero-oligomerização podem fornecer um meio para a amplificação do sinal por meio da ativação de muitos receptores pela ação de uma única molécula de ligante.

A hetero-oligomerização de GPCR pode resultar na formação de complexos de receptores que têm propriedades de ligação ao ligante e sinalização distintas de seus receptores constituintes. Ele representa um novo aspecto da biologia GPCR que tem um potencial estimulante para gerar novos alvos de drogas. As interações heteroméricas também podem mascarar as propriedades individuais de um dos receptores constituintes.

Níveis alterados de hetero-oligomerização de GPCR podem representar a base molecular de alguns distúrbios clínicos.

Pouco se sabe sobre a dinâmica e a regulação da formação do oligômero GPCR, isto é, se os ligantes promovem a associação ou dissociação de oligômeros, ou se eles se ligam a oligômeros pré-formados e alteram a conformação do receptor oligomérico. No entanto, os ensaios de transferência de energia de ressonância em células vivas indicaram que a oligomerização induzida por agonista pode ocorrer.

Há evidências de que a natureza oligomérica dos GPCRs pode ser explorada para melhorar as drogas por meio do desenvolvimento de ligantes diméricos. Vários ligantes diméricos mostraram ter afinidade aumentada e potência alterada em comparação com seus ligantes constituintes, potencialmente porque os ligantes diméricos podem induzir ou estabilizar mais prontamente a conformação dimérica dos receptores, o que de alguma maneira aumenta a eficácia da transdução de sinal.

A descoberta contemporânea de drogas para GPCRs tem sido amplamente baseada no uso de um único GPCR de interesse expresso em uma linha de células recombinantes. Para a futura identificação do composto principal, o entendimento atual da oligomerização GPCR determina que os receptores hetero-oligoméricos devem ser considerados como novos alvos na triagem de compostos como candidatos a drogas. As drogas que podem aumentar ou interromper a formação do oligômero GPCR como um meio para regular as funções dependentes da oligomerização também terão que ser exploradas.

Dado o que se sabe sobre a oligomerização GPCR até agora, é plausível que o desenvolvimento de 'novas' terapias possa ser tão simples quanto criar novos regimes com drogas 'antigas'.

A consideração da estrutura quaternária do GPCR demorou a penetrar no pensamento da corrente principal da descoberta de drogas, apesar do potencial de explorá-la para terapias aprimoradas.


Introdução

A formação de oligômeros transportadores tem sido estudada por uma variedade de métodos, incluindo transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) [1], reticulação [2], pull-downs [3] e co-imunoprecipitação [4], bem como caracterização biofísica usando, por exemplo, cromatografia de exclusão de tamanho - espalhamento de luz multiangular (SEC-MALS) [5]. Embora tais abordagens tenham mostrado efetivamente a formação de oligômeros transportadores, investigações mais recentes usando mutantes dominantes e estudos estruturais de alta resolução começaram a revelar insights sobre os papéis precisos da oligomerização para o tráfego do transportador, função e regulação da função. Esta revisão usa muitos transportadores e famílias de transportadores particularmente bem estudados para fornecer uma breve visão geral da compreensão atual dos papéis da oligomerização do transportador. Existem exemplos adicionais onde as estruturas de alta resolução revelaram que a interface entre os protômeros do transportador em um arranjo oligomérico forma o local de ligação ao substrato e o canal de translocação. Os exemplos incluem o pequeno transportador multifármaco, EmrE [6] e transportadores ABC [7,8]. Nestes casos, a oligomerização é responsável por gerar a arquitetura correta para a ligação e transporte do substrato. Esses transportadores não são incluídos nesta revisão. Além disso, não incluímos transportadores onde o único propósito de oligomerização parece ser para a estabilidade.


Resultados e discussão

A dimerização quebra as correlações de ruído de longa data no circuito autógeno

Para avaliar os efeitos dinâmicos da ligação proteína-proteína em circuitos de genes de autoregulação positiva, construímos vários modelos alternativos de circuitos autógenos positivos. Cada modelo enfatiza uma combinação diferente de possíveis mecanismos de feedback, e as topologias de rede consideradas podem ser agrupadas nas duas classes de circuitos apenas de monômero (MO) e dímero-permitido (DA), de acordo com a disponibilidade de um estado de proteína-dímero ( codificação de cores na Fig. 1). Além disso, agrupamos os circuitos DA em três variações, DA1 a DA3, dependendo de qual forma da proteína é o fator de transcrição funcional (TF) e onde ocorre a dimerização. Para DA1, apenas permitimos que o dímero se ligue à sequência do operador de DNA (fator de transcrição dimérico, DTF), enquanto para DA2 a dimerização ocorre por meio da ligação sequencial de monômeros no DNA. Em DA3, a cinética de ligação proteína-DNA é a mesma que no circuito MO, portanto, fator de transcrição monomérico (MTF), com a adição de um estado de dímero de proteína citosólica. Embora apresentaremos apenas resultados para DA1 neste artigo, não há diferença significativa para DA2 e DA3 [Arquivo adicional 1].

Esquema do modelo de circuito gênico de autorregulação. O estado de ligação ao DNA é indicado por Dxy, onde x corresponde à região do operador (vazio = 0, monômero = 1, dímero = 2) ey à região do promotor (vazio = 0, RNA polimerase ligado = 1). C representa o complexo aberto da holoenzima DNA-RNAp com a sequência promotora recém-eliminada do RNAp e está sujeito ao alongamento da transcrição. Finalmente, M, P1 e P2 correspondem a mRNA, monômero de proteína e dímero, respectivamente. As topologias de rede podem ser agrupadas em duas classes, circuitos somente monômero (MO) ou circuitos permitidos por dímero (DA). Estudamos DA1 (linhas vermelhas), que só permite que o dímero se ligue à sequência do operador de DNA, DA2 (verde) com ligação sequencial de monômeros no DNA e DA3 (azul), que compartilha cinética de ligação de proteína-DNA com MO enquanto permite a dimerização no citosol. Observe que para a topologia DA2, escolhemos K31 = K30 (veja o texto para detalhes) Assumimos que as células estão na fase de crescimento exponencial e o número de constante RNAp (R).

Observe que o ciclo de feedback não é explícito na Fig. 1, mas implicitamente incluído através da dependência do equilíbrio de ligação do promotor RNAp no estado de ligação do par TF-operador. O sinal (positivo ou negativo) e a força do controle de feedback são determinados pela magnitude relativa das constantes de dissociação entre o RNAp e o DNA, que é livre ou ligado ao TF. Por exemplo, a topologia DA1 tem controle de feedback positivo se K30 = k30/ q30 & gt K32 = k32/ q32, e K30 corresponde ao nível de transcrição constitutiva (iniciação da transcrição na ausência de fator de transcrição ligado). Para cada topologia, estudamos a dependência das características de ruído nas taxas cinéticas, variando o tempo de vida do dímero, a afinidade de ligação e as taxas de associação / dissociação individuais (ver Tabela e Fig. 1). Embora apenas discutamos o controle de feedback positivo do circuito autógeno neste artigo, obtivemos resultados correspondentes para o controle de feedback negativo [Arquivo adicional 1].

A Fig. 2 mostra uma amostra de dez cursos de tempo representativos para a abundância de proteínas. O efeito das flutuações estocásticas é marcado no circuito MO. No entanto, em todos os circuitos DA onde a proteína pode formar um dímero citosólico, observamos um nível de ruído significativamente reduzido na abundância do monômero. A supressão das flutuações persiste em toda a gama de parâmetros cinéticos que (até agora) são conhecidos por serem fisiologicamente relevantes (ver Tabela 1).

Dez cursos de tempo independentes da abundância de monômeros de proteína no circuito autoregulatório (positivo). A disponibilidade de um estado de dímero citosólico (vermelho, usando topologia de circuito DA1) reduz significativamente as flutuações do número de cópias do monômero em comparação com o circuito apenas de monômero (MO) (azul). Todos os parâmetros MO e DA1 correspondentes têm os mesmos valores. Nas simulações que se seguem, as condições iniciais são escolhidas para ser a solução de estado estacionário da equação de taxa determinística correspondente, de modo que o comportamento transiente deve ser minimizado.

Calculando a distribuição de estado estacionário para as abundâncias de monômero e dímero (Fig. 3), observamos uma tendência clara de que o fator de Fano do monômero (razão variância para média) é reduzido conforme o equilíbrio de ligação é deslocado em direção ao dímero. Esta tendência é conservada para todas as topologias DA investigadas (ver Informação suplementar) Enquanto a dimerização é permitida no citosol, o equilíbrio de ligação rápida absorve flutuações de longo tempo decorrentes da síntese de burst ou decadência do monômero. Quando uma flutuação aleatória ocasiona uma mudança repentina no número de cópias do monômero, a dimerização fornece um pool de buffer que absorve a mudança repentina. Caso contrário, explosões aleatórias na abundância de monômero irão se propagar para a atividade transcricional do promotor, levando ao controle errático da expressão da proteína. Deve ser enfatizado que isto não tem nada a ver com o sinal de regulamento e está de acordo com as observações da Ref. [21] para autorregulação negativa. Surpreendentemente, a magnitude da redução de ruído no circuito autorregulatório positivo é quase a mesma que para a autorregulação negativa, que é tipicamente considerada uma construção altamente estável [Arquivo adicional 1].

Distribuição de estado estacionário da abundância de proteínas monômero (preto) e dímero (laranja) nos circuitos autógenos positivos. A coluna esquerda (direita) corresponde a uma razão das taxas de decaimento de dímero e monômero de γ2/γ1 = 1/10 (γ2/γ1 = 1/2). Os números de cópias moleculares são coletados em um intervalo de tempo fixo (5 · 10 3 segundos) após o estado estacionário ter sido alcançado. Aqui K1q1/k1 é a constante de dissociação do dímero de proteína. À medida que o equilíbrio de ligação é deslocado para o estado de dímero (diminuindo K1), o nível de ruído é reduzido monotonicamente (consulte a Tabela 2). Observe que a vida útil prolongada da proteína devido à formação do complexo (coluna à esquerda) afeta o nível de ruído.

Uma explicação heurística pode ser encontrada na análise Jacobiana de um sistema dinâmico determinístico, que é justificada para pequenas perturbações em torno de um estado estacionário. Quando uma flutuação aleatória desloca o número de cópias do monômero de seu valor de estado estacionário, o declínio em direção ao estado estacionário pode ser descrito pelo sistema Jacobiano. A disparidade na magnitude dos autovalores (negativos) da matriz Jacobiana para o MO versus os circuitos DA significa que o estado perturbado é tamponado pela resolução rápida do equilíbrio monômero-dímero. Esse buffer ocorre antes que a flutuação aleatória possa se acumular, possivelmente com efeitos fisiológicos catastróficos, explicando os padrões grosseiros de longa duração observados no modelo MO em contraste com os circuitos DA (Fig. 2).

Clareamento seletivo de frequência de ruído browniano

O próprio processo de dimerização gera flutuações estocásticas em uma escala de tempo curta. No entanto, uma vez que esta escala de tempo é essencialmente separada daquela da síntese e decadência do monômero (ordens de magnitude mais rápidas), a dimerização efetivamente mitiga as flutuações no nível do monômero. O conteúdo de frequência das flutuações é melhor estudado por uma análise da densidade espectral de potência (PSD), que é definida como a transformada de Fourier da função de autocorrelação [27], originalmente introduzida para processamento de sinal. A Fig. 4 mostra os espectros de potência de ruído de DA1, e a distinção entre o circuito MO e a topologia DA é imediatamente evidente. Em particular, observamos os dois recursos a seguir. (i) Um decaimento da lei de potência com o aumento da frequência e (ii) um platô horizontal para os circuitos DA. A característica da lei de potência é explicada pela natureza do "passeio aleatório" da síntese e decadência de proteínas: o expoente da lei de potência é aproximadamente 2, que é uma reminiscência do movimento browniano (um processo de Wiener) no limite de grandes números de cópias moleculares. Em comparação com outros sinais comumente observados, como ruído branco (não correlacionado) ou 1 /f ruído, síntese / decadência de proteínas tem um tempo de correlação mais longo. Se a função de autocorrelação de um curso de tempo é caracterizada por um único decaimento exponencial, como é o caso do ruído browniano, o PSD é dado por um perfil Lorentziano e, portanto, bem aproximado por uma lei do inverso do quadrado no regime de baixa frequência . Não observamos um valor de saturação para o circuito MO, e provavelmente não está na janela de frequência de interesse fisiológico. Isso pode ser especialmente o caso de circuitos onde os tempos de correlação são longos.

Densidade espectral de potência (PSD) de flutuações na abundância de proteínas. O PSD do circuito MO exibe claramente um comportamento de lei de potência. Todos os outros sistemas de modelo com um estado de dímero de proteína citosólica disponível (DA1 mostrado aqui) desenvolvem um platô na região de frequência média, independentemente dos detalhes do modelo (consulte Informação suplementar) À medida que a afinidade de ligação do dímero aumenta, o nível de ruído é ainda mais reduzido. Incluímos o resultado do MO no painel do dímero (à direita) para referência. Conjuntos de dados com símbolos sólidos (vazios) correspondem a γ2/γ1 = 1/10 (γ2/γ1 = 1/2).

A redução de ruído está no regime de baixa frequência fisiologicamente relevante e, na Fig. 4, indicamos os valores típicos para um ciclo celular e tempo de vida do mRNA. Embora as flutuações estocásticas imponham um limite fundamental no processamento da informação celular, múltiplas fontes de ruído podem afetar a fisiologia celular de forma não aditiva. Para uma célula viva, as flutuações são especialmente relevantes quando seu tempo de correlação é comparável ou maior que o do ciclo celular. Ao mesmo tempo, as flutuações de escala de curto prazo (em relação ao ciclo celular) são mais facilmente atenuadas ou não se propagam [28]. Além disso, a região plana observada no PSD dos circuitos DA implica que, no que diz respeito às flutuações de frequência de faixa média, podemos aproximá-las com segurança como um ruído branco. Este insight pode lançar luz sobre a confiabilidade dos esquemas de aproximação para dinâmica estocástica eficaz em modelos apenas de proteína.

O aumento da vida útil do dímero desempenha um papel importante

A virtude do estado do dímero citosólico também está diretamente relacionada ao tempo de vida prolongado das proteínas quando em um complexo. Exceto para a marcação de degradação para proteólise ativa, um turnover muito mais lento de oligômeros de proteína é a norma. Isso é parcialmente explicado pela observação comum de que os monômeros têm estruturas amplamente desdobradas, que são propensas a ser alvo de proteólise [29]. Também foi apontado que o tempo de vida prolongado da forma oligomérica é um fator crítico para aumentar as faixas de parâmetros viáveis ​​dos circuitos gênicos [30]. Como pode ser visto na Fig. 3 (também na Tabela 2), a mudança de dobra da redução de ruído, embora ainda significativa, não é tão forte para o caso (hipotético) de vida do dímero sendo a mesma que a do monômero (γ2/γ1 = 1/2). No entanto, os espectros de potência de baixa frequência ainda exibem quase uma ordem de magnitude menor potência de ruído do que no circuito MO com os mesmos parâmetros de taxa (Fig. 4). Conseqüentemente, a capacidade de redução de ruído se mantém, desde que a vida útil do dímero seja mantida suficientemente longa em comparação com a transição monômero-dímero.

Efeitos da homodimerização na chave seletora genética

A lisogenia excepcionalmente estável do fago λ, para a qual a taxa de perda espontânea é de ≲ 10 -7 por célula por geração [31, 32], motivou a síntese de uma chave seletora genética [15]. A chave seletora é construída a partir de um par de genes, que denotaremos como gene UMA e B, que reprimem transcricionalmente a expressão um do outro. Essa regulação negativa mútua pode ser considerada um loop de feedback positivo eficaz e fornece a base para os vários estados estacionários. A existência de multiestabilidade, por sua vez, pode ser explorada como dispositivo de memória epigenética ou de tomada de decisão [33].

Como os atributos gerais de feedback positivo com cooperatividade sugerem, uma chave seletora genética responde a sinais externos de uma forma ultrassensível: quando a força de um sinal se aproxima de um valor limite, o estado de expressão do gene pode ser invertido por uma pequena mudança no sinal. Por exemplo, a concentração de proteína UMA (B) pode mudar rapidamente de alto para baixo e vice-versa. No entanto, estudos anteriores de uma chave seletora sintética mostraram que a comutação de estado induzida por ruído é um evento raro [15, 34, 35]. Na análise que se segue, pretendemos delinear a origem desta estabilidade excepcional.

Em um modelo simples, a alternância apenas de monômero (MO), as proteínas regulatórias só existem na forma monomérica.Embora um sinal externo não esteja explicitamente incluído, flutuações aleatórias na abundância dos componentes moleculares do circuito irão ocasionalmente mudar o estado de alternância para as duas espécies de proteínas. Com base nos resultados de nossa análise de circuitos de genes autorregulatórios positivos, levantamos a hipótese de que a dimerização nas proteínas regulatórias da chave seletora servirá para estabilizar seu desempenho contra ruído. Permitimos que os produtos proteicos de cada gene formem um homodímero, sendo AA ou BB, que é semelhante ao sistema cI-cro em fago λ [36]. A constante de dissociação para os dímeros é definida como K1 = q1/k1, Onde k1 é a taxa de dois monômeros formando um complexo, e q1 a taxa de decomposição do complexo em seus dois constituintes.

Avaliamos o efeito da dinâmica rápida de ligação-desacoplamento de proteínas no desempenho da chave seletora usando (i) os monômeros ou (ii) os homodímeros como a forma funcional do repressor. A Fig. 5 mostra, para valores selecionados da constante de dissociação K1, séries temporais representativas das abundâncias de monômero de proteína (esquerda) e dímero (direita) para o caso de fatores de transcrição (a) monoméricos ou (b) diméricos, respectivamente. Uma análise cuidadosa do espaço de fase (na presença de ruído) para nosso conjunto de parâmetros escolhido confirma que os sistemas de chave seletora estudados estão na região biestável [37].

Amostra de série temporal de números de cópia de monômero e dímero em chave seletora genética. (a) circuito MTF, onde o monômero é a forma funcional do repressor. (b) circuito DTF, onde dímero é a forma funcional do repressor. A coluna da esquerda (direita) mostra o número das duas moléculas de monômero UMA e B (dímeros AA e BB), e o estado inicial é sempre com espécies UMA (vermelho) em alta abundância. Observe que a frequência de comutação depende da afinidade de ligação do dímero de proteína.

Quando o monômero é a forma funcional da molécula repressora (Fig. 5 (a)) e K1 é grande (limite de baixa afinidade de dímero), as populações de proteínas são dominadas por monômeros. Conseqüentemente, o circuito efetivamente se comporta como uma alternância de MO. Como K1 diminui, vemos que o nível de comutação aleatória é suprimido: Analogamente ao circuito autógeno, o pool de dímeros estabiliza a população de monômeros de proteína. No entanto, a supressão de ruído não é monotônica com o aumento da afinidade de ligação do dímero. Na verdade, para afinidades de ligação muito grandes (pequeno K1), o número de eventos de comutação aleatórios é aumentado, uma vez que o monômero está disponível apenas em números baixos de cópias. Consequentemente, neste limite, torna-se mais provável que uma pequena flutuação na abundância do monômero possa causar uma mudança dramática no perfil geral de expressão do gene. O efeito de estabilização de ruído da dimerização também é refletido nos PSDs correspondentes [Arquivo adicional 1]. Por exemplo, observamos uma supressão marcada de flutuações de baixa frequência na abundância de monômero com o aumento K1.

Na Fig. 5 (b), mostramos as séries temporais de amostra correspondentes para o caso de um repressor dimérico, todas as outras propriedades sendo as mesmas que em (a). Embora as tendências gerais sejam semelhantes, notamos a seguinte diferença. Ao contrário do caso do repressor monomérico, há muito poucos eventos de alternância no limite de ligação forte: uma vez que as moléculas de sinalização (dímeros) do gene dominante (o gene "ligado") tendem a existir em grandes números de cópias, uma flutuação significativa é necessário mudar o estado da chave seletora. No caso de repressão monomérica, a molécula sinalizadora existe em baixa abundância neste limite. Assim, a espécie de proteína dominante no sistema repressor dimérico é capaz de manter um controle muito melhor sobre o estado da chave seletora.

Na Fig. 6, mostramos a distribuição (N UMA- N B), a diferença na abundância de moléculas para as duas espécies de proteínas no caso do fator de transcrição monomérico (esquerda) e dimérico (direita). A assimetria em relação ao eixo zero é causada pela nossa escolha das condições iniciais (espécie de proteína UMA em alta concentração e espécies B em baixa concentração), bem como o comprimento finito da série temporal. Para a transcrição monomérica, a presença de dímeros com afinidade de ligação moderada aumenta a distribuição da abundância do monômero enquanto acentua seu caráter bimodal. Isso está de acordo com a observação qualitativa da Fig. 5 sobre estabilidade de chaveamento. Para a transcrição dimérica, observamos claramente que a simetria do sistema é quebrada para pequenos valores de K1, indicando que o estado da chave seletora é extremamente estável e, portanto, provavelmente determinado pela escolha das condições iniciais.

Distribuição das diferenças de abundância de monômeros entre as espécies de proteínas UMA e B. A assimetria em relação ao eixo zero deve-se à escolha do estado inicial (espécie UMA alto) e o intervalo de tempo finito das simulações.

Para quantificar sistematicamente nossas observações sobre a interação entre a afinidade de ligação do dímero e a estabilidade funcional da chave seletora, geramos longas séries de tempo (≈3 · 10 7 segundos) para medir a taxa média de comutação espontânea. Na Fig. 7, mostramos a frequência de alternância média em relação à alternância de MO para as afinidades de ligação K1/ nM = <2, 20, 100, 1000>, e a taxa média de comutação de MO é 7,5 × 10 -6 / hora. Como esperado, descobrimos que os valores intermediários de K1 são capazes de estabilizar a chave seletora. A Fig. 7 também destaca o aumento da estabilidade do interruptor de alternância para um fator de transcrição dimérico versus monomérico, as taxas de troca dimérico sempre sendo mais baixas e se aproximando de zero para forte ligação de dímero.

Taxas de troca aleatória de interruptores genéticos. A ordenada é a proporção das taxas de comutação aleatória de vários interruptores de alternância para o circuito apenas de monômero (MO), 7,5 × 10 -6 / hora. MTF, fator de transcrição monomérico DTF, fator de transcrição dimérico Het-MTF, fator de transcrição monomérico com estado de heterodímero desativado.

Heterodimerização em chave seletora genética

Também consideramos o caso de heterodimerização na chave seletora, uma vez que o ruído e a estabilização funcional da chave podem ser diretamente afetados pela composição e fonte dos dímeros. Observe que a atividade de regulação gênica é conferida pelas duas proteínas monoméricas UMA e B e não o heterodímero AB. No entanto, descobrimos que a presença de heterodímeros (inativos) dá origem a efeitos de estabilização de ruído muito semelhantes aos dos homodímeros (Fig. 7). Na verdade, a existência do estado de heterodímero permite que a espécie de proteína dominante suprima efetivamente os monômeros (ativos) das espécies minoritárias. Assim, o circuito de heterodímero mostra estabilidade funcional dramaticamente melhorada em comparação com o caso de repressores homodiméricos, não compartilhando a vulnerabilidade discutida do circuito MO ao ruído intrínseco. Embora, ao nosso conhecimento, este seja um projeto de chave seletora puramente hipotético, ele fornece uma estratégia geral para controle de ruído em circuitos de genes sintéticos, juntamente com a abordagem proposta anteriormente de domínios regulatórios upstream sobrepostos [38].


Estados de Oligomerização de FL_RAGE

SEC-MALS

A fim de manter FL_RAGE em solução, aplicamos um ambiente de detergente capaz de imitar o ambiente de lipídio nativo no qual a região TM está normalmente inserida. Portanto, FL_RAGE foi purificado e caracterizado na presença do detergente não iônico n-Dodecil β-D-maltosídeo (DDM). A análise SEC-MALS de FL_RAGE na presença de DDM revelou um pico bem definido (Fig. 3a). No caso do complexo proteína-detergente, entretanto, a interpretação das massas correspondentes não é direta. A quantidade de detergente ligado à proteína pode diferir dependendo da estrutura da proteína e da natureza do detergente. Portanto, a proporção de massa entre a proteína e o detergente na micela pode variar dramaticamente. Uma abordagem dedicada é necessária na etapa de análise dos dados, que considera a presença do detergente 25. O módulo “conjugado de proteína” do software ASTRA (Wyatt Technologies) permite o cálculo do peso molecular de todo o complexo, bem como de seu componente proteico e da massa micelar detergente associada à proteína.

Análise de SEC-MALS e AUC de RAGE completo. (uma) SEC-MALS de FL_RAGE. Os cromatogramas mostram as leituras do detector dos detectores LS e UV em vermelho e preto, respectivamente. As escalas para detectores LS e UV são mostradas na escala do eixo esquerdo, enquanto o eixo direito representa a massa molecular. As linhas verdes, azuis e ciano nos picos indicam massas moleculares calculadas do complexo proteína / detergente (verde), a proteína (azul) e a micela de detergente anexada (ciano). (b) Experiência de velocidade de sedimentação de FL_RAGE solubilizado em DDM (absorção a 280 nm em vermelho e interferência em verde). O traço preto representa os dados de interferência do buffer, incluindo micelas DDM. (c) Exemplo de análise do conjunto de dados de FL_RAGE (painel b) usando o módulo de cálculo de proteína de membrana GUSSI tipo f / fo GUSSI. As linhas vermelhas, verdes e azuis representam os limites alto, ótimo e baixo de f / fo para a fração de proteína / micela, respectivamente (ver texto). As imagens mostram a análise do pico de 5,8S e indicam a presença de um dímero. Os picos 4.4S e 7.4S representam monômeros e trímeros, respectivamente (ver Fig. S5 em Informações suplementares).

O cromatograma SEC-MALS de FL_RAGE (Fig. 3a) mostrou um pico de proteína principal eluindo em

13 ml. A massa molar do complexo, estimada por ASTRA, era heterogênea ao longo do pico, abrangendo a faixa de massas do complexo de micela de detergente-proteína (

120-140 kDa). A massa molar calculada da proteína também era heterogênea (

47-75 kDa), indicando uma fração não monomérica substancial nas amostras de FL_RAGE (a massa molecular esperada de FL_RAGE é 41,8 kDa).

A velocidade de sedimentação de FL_RAGE (Fig. 3b) foi investigada monitorando os dados de absorbância e interferência. A absorbância a 280 nm exibiu um sinal amplo entre 3,5S e 8,0S, com o máximo em torno de 4,4S e uma quantidade vestigial de espécies de alto peso molecular. Ao mesmo tempo, a interferência, caracterizada por uma melhor resolução espacial em comparação com a absorção, apresentou três picos bem definidos (4,4S, 5,8S e 7,4S) localizados na mesma faixa de 3,5–8,0S. O pico adicional em 3.2S correspondeu claramente ao limite de interferência observado para o buffer. Este pico não foi detectado quando o tampão sozinho foi investigado com absorbância (dados não mostrados) indicando a presença de DDM livre. Sinal semelhante também foi observado por outros autores 26. A interpretação dessas descobertas em termos do status de oligomerização de FL_RAGE exigiu uma análise mais detalhada. Para isso, usamos f / fo procedimento de análise descrito no pacote GUSSI Membrane Protein Module da Brautigam 27. Em seguida, os resultados indicaram que os picos 4.4S, 5.8S e 7.4S corresponderam a monômero, dímero e trímero, respectivamente, pois apenas neste caso o f / fo os valores estavam dentro do intervalo permitido de 1,2-1,7. A suposição de outro grau de oligomerização levou a f / fo valores desviados do intervalo permitido: & gt1.9 e & lt1 para oligômeros de ordem superior e menores, respectivamente, o que não é possível. A Figura 2c ilustra esse tipo de análise com base no pico número 2 (5,8S). Esses resultados do experimento AUC revelaram a presença de uma mistura de monômeros, dímeros, trímeros e até mesmo uma pequena fração de oligômeros de ordem superior, o que está de acordo com o resultado SEC-MALS. Obviamente, uma troca rápida entre as espécies monoméricas e diméricas resultou em um pico amplo a 280 nm.

MS nativo

Para análise de MS nativo, FL_RAGE foi solubilizado em DDM ou em Triton X-100 a uma concentração de duas vezes a concentração micelar crítica (CMC). Apesar da estabilidade de FL_RAGE na presença de DDM durante a purificação da proteína, a troca do tampão por uma solução de acetato de amônio (AmAc) compatível com MS, que também continha 2x CMC de DDM, levou à precipitação da proteína, mesmo em uma concentração bastante alta de AmAc (1M). A precipitação de FL_RAGE não foi observada quando Triton X-100 (2x CMC) foi usado em vez de DDM. Em seguida, o espectro de MS nativo adquirido em AmAc 600 mM revelou sinais monoméricos, diméricos, triméricos e até tetraméricos (Fig. 4a). Ambas as espécies monoméricas e diméricas estão perto do equilíbrio e foram responsáveis ​​pela grande maioria do sinal. Curiosamente, a purificação de FL_RAGE usando SEC em vez de cromatografia de troca iônica permitiu uma melhor preservação de oligômeros de ordem superior, por exemplo, trímeros e tetrâmeros (Fig. S3), porém com algumas impurezas (contaminantes não identificados) e uma liberação de proteína de membrana mais desafiadora na fase gasosa (resolução pobre). A adição de 0,1% de ácido fórmico e 50% de acetonitrila a FL_RAGE levou ao desaparecimento de sinais provenientes de espécies oligoméricas (Fig. 4b), indicando um caráter não covalente da oligomerização. Como a MS nativa de proteínas de membrana depende de uma liberação ativada por colisão da proteína do aglomerado de micelas de detergente, exigimos um mínimo de (15 V) energia de colisão de 30 V junto com uma ativação de 200 V no cone de amostragem para observar (monomérico) espécies oligoméricas de FL-RAGE no espectro.

Espectro de massa de FL_RAGE sob o nativo (uma) e (b) condições de desnaturação. Os picos são marcados por pontos coloridos e o estado de carga correspondente para monômeros e multímeros de FL_RAGE em conformidade.


Discussão

A oligomerização GPCR é agora bem reconhecida, com potencial para impacto funcional e regulatório significativo (Cvejic e Devi 1997 Pascal e Milligan 2005 Rocheville et al. 2000a). A análise mais extensa da oligomerização GPCR foi realizada nos receptores da Família A, e esta subfamília de receptores também é a mais bem caracterizada em relação à estrutura (Milligan 2007). Os GPCRs da Família B também formam complexos homo-oligoméricos (Harikumar et al. 2006b Lisenbee e Miller 2006 Seck et al. 2003) e complexos hetero-oligoméricos (Harikumar et al. 2006b). A estrutura dos receptores nesta família foi prevista para ser distinta daquela da Família A (Dong et al. 2007 Salom et al. 2006), com diferentes sequências de assinatura e até mesmo diferenças previstas no feixe helicoidal.

Os GPCRs da família B têm uma longa região da cauda extracelular amino-terminal que inclui seis resíduos de cisteína conservados que estão envolvidos em três ligações dissulfeto conservadas (Lisenbee et al. 2005). Esta região é importante para a ligação do ligante peptídico natural (Dong e Miller 2002). Esta região, no entanto, não é importante para a oligomerização do receptor de secretina (Lisenbee e Miller 2006). A cauda do terminal carboxila intracelular do receptor de secretina também pode ser truncada sem efeito em sua oligomerização (Lisenbee e Miller 2006). Em um estudo recente, o principal determinante para a homo-oligomerização do receptor de secretina foi a face exposta a lipídios do quarto segmento transmembrana (Harikumar et al. 2007).

No trabalho atual, exploramos sistematicamente a capacidade de uma ampla variedade de GPCRs da Família B de formar complexos hetero-oligoméricos com o receptor de secretina. Já sabíamos que os GPCRs da Família A selecionados não formavam tais complexos (Harikumar et al. 2006a) e que os GPCRs da Família B mais intimamente relacionados, os receptores VPAC1 e VPAC2, eram capazes de formar oligômeros (Harikumar et al. 2006b). Nestes estudos, estendemos esta pesquisa a uma ampla gama de receptores de hormônios peptídicos da Família B. Digno de nota, cada um desses receptores, exceto o receptor de calcitonina, foi capaz de formar hetero-oligômeros com o receptor de secretina, indicando que o potencial para hetero-oligomerização é provavelmente extenso entre os receptores da Família B. Ao avaliar o quarto segmento transmembrana desses receptores, é interessante que o receptor de calcitonina humano inclua dois resíduos neste segmento que não estão presentes em nenhum outro receptor desta série. Estes são Arg em posição equivalente a Tyr 233 do receptor de secretina e Thr em posição equivalente a Ala 250 do receptor de secretina. Prevê-se que estes resíduos estejam em qualquer das extremidades do segmento transmembranar, voltado para a bicamada lipídica. Um (ou ambos) desses resíduos podem contribuir para o comportamento distinto de hetero-oligomerização exibido pelo receptor de calcitonina na atual série de experimentos. No entanto, não está claro se o mesmo determinante de sequência responsável pela homo-oligomerização é também a sequência primária envolvida na hetero-oligomerização. Trabalhos futuros abordarão o significado fisiológico da interação heteróloga entre os receptores da Família B.


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Resultados

Marcação específica do local de monomérico purificado & # x003b22AR e reconstituição em vesículas lipídicas

O objetivo de nossos estudos era monitorar a autoassociação de & # x003b22AR após reconstituição em vesículas lipídicas e para obter informações sobre a orientação relativa dos protômeros em oligômeros. FRET usando sondas fluorescentes de baixo peso molecular é uma ferramenta ideal para esses estudos porque fornece informações de distância relativa, mas requer quantidades relativamente pequenas de proteína (Mansoor et al, 2006). Para obter a rotulagem específica do site do & # x003b22AR, geramos receptores modificados com cisteínas reativas simples que podem ser modificados quimicamente com fluoróforos reativos a sulfidrila. Os mutantes foram feitos em um fundo de cisteína mínimo no qual as cinco cisteínas quimicamente reativas, de 13, foram mutadas (consulte a seção Materiais e métodos). Estas mutações não têm efeito na ligação ao ligante ou no acoplamento da proteína G. As três cisteínas restantes que não são palmitoiladas ou fazem parte de ligações dissulfeto não são reativas devido à sua localização no núcleo hidrofóbico (Figura 1A). Inicialmente, construímos 18 mutantes de cisteína única nos domínios citoplasmáticos do receptor. Três foram escolhidos com base em suas propriedades funcionais, reatividade química e sua distribuição (Figura 1B): & # x003945-T66C (intracelular loop-1, ICL1), & # x003945-A265C (transmembrane domain-6, TM6) e & # x003945 -R333C (hélice-8, H8) (Cherezov et al, 2007 Rasmussen et al, Rosenbaum 2007 et al, 2007).Esta distribuição espacial dos locais de rotulagem foi projetada para fornecer informações sobre a orientação dos protômeros em relação uns aos outros.

& # x003b22Construções AR de cisteína única e par doador FRET & # x02013acceptor. (UMA) Três construtos de cisteína reativa única foram gerados em um fundo de cisteína mínimo (& # x003945 - & # x003b22AR). Os locais de rotulagem foram colocados no primeiro ICL, & # x003945 - & # x003b22AR-T66C, na extremidade citoplasmática do sexto segmento transmembranar, & # x003945 - & # x003b22AR-A265C e hélice oito, & # x003945 - & # x003b22AR-R333C. (B) Vista 3D intracelular da distribuição de regiões escolhidas para mutantes de cisteína única, carbonos & # x003b1 são representados. (C) Doador FRET (& # x003bbex= 549 nm & # x003bbem= 570 nm) e par aceitador (& # x003bbex= 650 nm e # x003bbem= 670 nm).

Os receptores modificados foram expressos em células Sf9 usando baculovírus recombinante e purificados usando anticorpo sequencial e cromatografia de afinidade com alprenolol. Mostramos anteriormente que este protocolo de purificação produz monomérico, solubilizado em detergente & # x003b22AR (Whorton et al, 2007). Purificado, solubilizado em detergente & # x003b22AR foi rotulado com Cy3 ou Cy5 maleimida. Esses fluoróforos foram escolhidos para estudos FRET porque possuem um R0 valor (F & # x000f6rster distância crítica onde 50 & # x00025 de transferência de energia ocorre) na faixa de 37 a 56 & # x000c5 dependendo do sistema experimental (Mansoor et al, 2006 Massey et al, 2006). Isso é ideal para estudar as interações do receptor & # x02013receptor, pois um monômero tem dimensões aproximadas de 30 & # x000c5 & # x000d7 40 & # x000c5 & # x000d7 70 & # x000c5. & # x003b22Os ARs foram marcados com quantidades estequiométricas de Cy3 ou Cy5, e a eficiência da marcação foi determinada por espectroscopia de absorção (Tabela Suplementar I). Com a etiqueta & # x003b22AR foi reconstituído em uma mistura de lípidos 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) e hemisuccinato de colesterol (CHS). Três amostras foram geradas para cada experimento: (1) reconstituído com etiqueta Cy3 & # x003b22AR (2) rotulado com Cy5 reconstituído & # x003b22AR e (3) etiquetados com Cy3 & # x003b22AR misturado com Cy5-marcado & # x003b22AR e depois reconstituído. A razão molar final de lipídio para receptor (mol para mol) foi de 1000: 1, a menos que indicado de outra forma. As mesmas amostras foram preparadas para os controles, mas foram mantidas em 0,1 & # x00025 DM e não reconstituídas em vesículas.

Orientação de & # x003b22AR em vesículas lipídicas

Saber a orientação de & # x003b22AR em nossas vesículas lipídicas é essencial para interpretar as medições FRET. A orientação aleatória geraria potenciais oligômeros não fisiológicos (antiparalelos). Embora a orientação aleatória possa ser esperada, estudos anteriores mostraram que a rodopsina se orienta predominantemente em uma direção após a reconstituição (Niu et al, 2002). Usamos várias estratégias complementares para determinar a orientação de & # x003b22AR em vesículas fosfolipídicas (Figura 2A). Fator Xa é uma protease que cliva seletivamente o & # x003b22AR no terceiro ICL (ICL3). Receptores orientados de dentro para fora (ICL3 fora da vesícula lipídica) serão suscetíveis ao Fator Xa, enquanto aqueles orientados de fora para fora não (Figura 2A). Aproximadamente 90 & # x00025 de & # x003b2 reconstituído2AR foi resistente ao Fator Xa, enquanto todo o receptor foi clivado na presença de 0,1 & # x00025 DM (Figura 2B), uma concentração de detergente que permeia as vesículas. Esses resultados são consistentes com uma orientação predominantemente de fora para fora. PNGase F é uma enzima que cliva os oligossacarídeos ligados à asparagina no N-terminal extracelular (Figura 2A). O tratamento do receptor reconstituído com PNGase F levou a uma mudança de mobilidade que era indistinguível daquela observada na presença de 0,1 & # x00025 DM, consistente com orientação predominantemente de fora para fora (Figura 2C). A orientação foi posteriormente confirmada usando NHS-PEO4-biotina para modificar quimicamente o terminal N (Figura 2A). Não se espera que este composto polar atravesse a bicamada lipídica. A modificação química do epítopo FLAG N-terminal resulta em perda de reatividade para o tratamento com anticorpo M1 de vesículas após a reconstituição resultou na perda de reatividade M1 por mais de 90 & # x00025 de & # x003b2 reconstituído2AR (Figura 2D e E). Finalmente, rotulamos A265C no lado citoplasmático do & # x003b22AR com monobromobimane (mBBr) e examinou a capacidade do triptofano em solução para extinguir a fluorescência de bimane. Não observamos extinção de reconstituído, marcado com bimane & # x003b22AR com triptofano 1 mM. No entanto, a solubilização de vesículas usando 0,2 & # x00025 DM resultou em extinção significativa (Figura 1 suplementar). Juntos, esses estudos mostram que o & # x003b22AR é predominantemente orientado com os domínios extracelulares do lado externo da vesícula.

& # x003b22Os ARs são predominantemente orientados de fora para fora nas bicamadas lipídicas. (UMA) Estratégias para determinar a orientação de & # x003b22AR em bicamadas lipídicas. (B) Os receptores purificados foram reconstituídos conforme descrito em Materiais e métodos e, em seguida, submetidos a tratamento com Fator Xa e resolvidos por 10 & # x00025 SDS & # x02013PAGE e transferidos para nitrocelulose. A presença de & # x003b22AR foi determinado por sondagem com um anticorpo M1 conjugado com Alexa-680. (C) As amostras submetidas a PNGase F foram preparadas e fotografadas como no painel A. (D, E) As amostras reconstituídas foram tratadas com o reagente alquilante NHS-PEO hidrofílico, reativo a amina4-biotina que interrompe a ligação do anticorpo monoclonal M1 ao epítopo FLAG. As amostras foram avaliadas quanto à reatividade ao anticorpo M1 (D) e a um anticorpo que reconhece a marca de seis histidinas C-terminal (E). Todos os dados são representativos de três experimentos independentes.

Distribuição de & # x003b22AR em vesículas lipídicas

Ao estudar a oligomerização, é importante evitar forçar as proteínas juntas por reconstituição não homogênea, ou seja, aprisionar a maioria das moléculas receptoras em uma pequena população de vesículas lipídicas. Por exemplo, foi demonstrado anteriormente que 90 & # x00025 de moléculas de rodopsina foram incorporadas em apenas 10 & # x00025 de vesículas (Mansoor et al, 2006). Usamos a centrifugação de densidade isopícnica para avaliar a distribuição de & # x003b22ARs em vesículas lipídicas, conforme descrito anteriormente para rodopsina (Mansoor et al, 2006). Rotulado por Cy5 & # x003b22Os ARs foram reconstituídos em uma proporção de lipídio para receptor de 1000: 1 em lipídios contendo NBD & # x02013fosfocolina (em um final de 0,4 & # x00025 do conteúdo total de lipídios). Isso nos permitiu analisar amostras submetidas a um gradiente descontínuo de densidade de sacarose seguindo a fluorescência Cy5 (para a presença de & # x003b22AR) e fluorescência NBD (para a presença de vesículas lipídicas). Nossos resultados mostram uma correlação quase perfeita entre a fluorescência Cy5 e a fluorescência NBD em cada fração analisada, sugerindo que & # x003b22As moléculas de AR são distribuídas uniformemente nessas vesículas (Figura 3A). Resultados semelhantes foram obtidos com & # x003b22AR reconstituído em uma proporção de lípido-receptor de 10 000: 1 (Figura 2 suplementar).

& # x003b22Os ARs são distribuídos homogeneamente nas vesículas lipídicas. (UMA) Para determinar a distribuição de & # x003b22ARs em vesículas lipídicas, gradientes de densidade de sacarose de amostras contendo 0,4 & # x00025 NBD & # x02013fosfocolina e Cy5 & # x02013 & # x003b22Os ARs reconstituídos em uma proporção de lipídio para receptor de 1000: 1 foram realizados conforme descrito nos dados suplementares. A detecção de frações lipídicas foi realizada seguindo a fluorescência NBD (& # x003bbex= 460 nm) e frações do receptor seguindo a fluorescência Cy5 (& # x003bbex= 649 nm). (B) Reconstituído & # x003b22ARs foram fotografados usando um protocolo de coloração negativa, conforme descrito nos dados suplementares para determinar a distribuição de tamanho das vesículas e o número de receptores por vesícula. O comprimento da barra de escala representa 200 nm. Os dados são representativos de três experimentos independentes.

Para avaliar a densidade de & # x003b22ARs nas vesículas lipídicas, usamos microscopia eletrônica para determinar o diâmetro médio de nosso & # x003b22Preparações de vesículas lipídicas contendo AR. Usando um protocolo de coloração negativa, determinamos que o diâmetro médio de nossas preparações de vesículas em uma proporção de lipídio para receptor de 1000: 1 foi de 83 nm e # x000b112 nm (Figura 3B). Usando os cálculos detalhados na seção Materiais e métodos suplementares, concluímos que existem 50 & # x0201360 & # x003b22ARs por vesícula lipídica, sendo a maioria orientada de forma externa.

Caracterização funcional de & # x003b22AR em vesículas lipídicas

Realizamos a ligação de saturação no receptor reconstituído purificado para determinar a afinidade de todos os três mutantes de cisteína única para o antagonista [3H] -diidroalprenolol (DHA). Não observamos diferença significativa entre os três & # x003b2 modificados2ARs e tipo selvagem & # x003b22ARs (Tabela I e Figura Suplementar 3). Estudos de ligação de competição com [3H] -DHA foram usados ​​para determinar o Keu valores para o agonista isoproterenol (Iso) e o agonista inverso ICI 118.551 (ICI). Conforme mostrado na Tabela I e Figura 4, os valores para os mutantes de cisteína única são comparáveis ​​aos obtidos para o tipo selvagem & # x003b22AR, sugerindo que a introdução das cisteínas reativas simples e reconstituição de & # x003b2 purificado2O AR em vesículas lipídicas não altera a farmacologia do receptor.

Mutantes de cisteína reativos simples são totalmente funcionais. A afinidade do agonista isoproterenol (UMA) e o agonista inverso ICI 118.551 (B) foi medido para todos os três mutantes de cisteína única (& # x003945-T66C, & # x003945-A265C e & # x003945-R333C) e receptor de tipo selvagem por ligação competitiva de [3H] -DHA. Os resultados são expressos como porcentagem de radio-ligante ligado na ausência de competidor. (C) A funcionalidade dos três mutantes de cisteína única, não marcados ou marcados com Cy5 e receptor de tipo selvagem, foi determinada pela ligação de GTP & # x003b3S conforme descrito nos dados suplementares. A ligação específica de [35 S] -GTP & # x003b3S induzida por 10 & # x003bc M isoproterenol (resposta agonista) ou por 10 & # x003bc M ICI 118,551 (resposta agonista inversa) é mostrada como vezes sobre o basal. Todos os dados funcionais representam a média & # x000b1s.e.m. de três experiências independentes realizadas em triplicado.

Tabela 1

Propriedades de ligação de agonista, antagonista e agonista inverso para os receptores de cisteína reativos simples a

& # x003b22ARKeu [s.e. intervalo] (n M)Kd& # x000b1s.e.m.
Mutante(& # x02212) -IsoproterenolICI 118.551[3 H-DHA]
Tipo selvagem355 [203 & # x02013620]1,17 [0,77 & # x020131,77]1.3 e # x000b10.16
& # x003945-T66C388 [319 & # x02013473]2,09 [1,86 e # x020132,35]1.8 e # x000b10.21
& # x003945-A265C298 [255 e # x02013348]1,84 [1,45 e # x020132,33]2,5 e # x000b10.23
& # x003945-R333C214 [168 e # x02013273]1,90 [1,59 & # x020132,27]2.4 e # x000b10.24
a A saturação e a ligação de competição foram realizadas conforme descrito em Materiais e métodos. Os dados representam a média & # x000b1s.e.m. de pelo menos três experimentos independentes.

A funcionalidade para o acoplamento da proteína G dos três mutantes de cisteína única foi abordada pela ligação de [35 S] -GTP & # x003b3S. Este ensaio envolve a reconstituição de & # x003b2 purificado2AR com Tet-G purificado& # x003b1s como descrito anteriormente (Swaminath et al, 2005 Granier et al, 2007). Ligação do agonista a todos os três & # x003b22Os mutantes de cisteína única de AR levaram à estimulação significativa do acoplamento da proteína G que era semelhante ao receptor de tipo selvagem (Figura 4C). O tratamento de amostras com o agonista inverso ICI levou a diminuições na atividade basal semelhante à observada para o receptor de tipo selvagem (Figura 4C). A modificação das cisteínas únicas com fluoróforo Cy5 & # x02013maleimida não teve efeito significativo no acoplamento da proteína G (Figura 4C P& # x0003e0.05).

Análise FRET de fluoróforo marcado & # x003b22ARs em bicamadas lipídicas

Primeiro determinamos o FRET entre os receptores marcados na mesma posição. & # x003945-A265C marcado com Cy3 foi reconstituído com uma quantidade equivalente de & # x003945-A265C marcado com Cy5 para monitorar as interações TM6 / TM6. Isso foi repetido para & # x003945-T66C e & # x003945-R333C, como repórteres para as interações ICL1 / ICL1 e H8 / H8, respectivamente. A Figura 5A mostra um exemplo de um experimento típico realizado em & # x003945-T66C. FRET entre os receptores marcados com Cy3 e Cy5 (30.3 & # x000b11.2 & # x00025) só é observado após a reconstituição do receptor em uma bicamada lipídica, mas não quando os receptores permanecem solubilizados em detergente (Figura 5A e Tabela II). Observações semelhantes foram feitas para Cy3- e Cy5-marcado & # x003945-A265C (16,7 & # x000b11.3 & # x00025) e para Cy3- e Cy5-marcado & # x003945-R333C (26,9 & # x000b10.8 & # x00025 Tabela II )

FRET intermolecular entre Cy3- e Cy5-marcado & # x003b22AR é independente de outras proteínas celulares e é específico. (UMA) A proteína receptora purificada e solubilizada em detergente foi marcada com Cy3 ou Cy5 maleimida e o fluoróforo que não reagiu foi extinto com cisteína e separado da proteína por filtração em gel, conforme descrito em Materiais e métodos. Amostras de proteínas marcadas com Cy3 e Cy5 foram misturadas a uma razão molar de 1: 1 e reconstituídas em bicamadas de fosfolipídios ou mantidas em detergente. A subtração dos controles apropriados e a normalização dos traços brutos são descritos nos Dados suplementares. Com a etiqueta & # x003b22Os ARs foram reconstituídos em uma proporção de lipídio-receptor 10 vezes maior (10.000: 1) e a eficiência de FRET foi medida para ICL1 / ICL1 (B), TM6 / TM6 (C) e H8 / H8 (D) interações. Os dados são representativos de pelo menos três experimentos independentes (A) ou representam a média & # x000b1s.e.m. de pelo menos três experimentos independentes (B & # x02013D).

Mesa 2

Eficiências FRET na ausência de ligante e após a ligação do agonista, antagonista neutro ou agonista inverso a

& # x003b22Região ARNenhum ligante & # x000b1s.e.m.& # x0002bIsoproterenol & # x000b1s.e.m.P-valor& # x0002bAlprenolol & # x000b1s.e.m.P-valor& # x0002bICI 118.551 & # x000b1s.e.m.P-valor
ICL-1 / ICL-130,26 e # x000b11.231,43 e # x000b10.40.4529,72 e # x000b14.10.8634,86 e # x000b11.40,043 e # x0002a
TM-6 / TM-616,73 e # x000b11.317,71 e # x000b12.10.6421,48 e # x000b10.80.2327.67 & # x000b12.00,005 e # x0002a e # x0002a
H-8 / H-826,85 e # x000b10.829,56 e # x000b11.10.0631,40 e # x000b13,50.0728,33 e # x000b11.80.418
ICL-1 / TM-624,58 e # x000b12.322,26 e # x000b10.40.5627.82 & # x000b16.10.5430,00 e # x000b14.60.269
ICL-1 / H-824.08 e # x000b11.623,71 e # x000b10.70.9126,87 e # x000b14,80.4935,33 e # x000b12.40,006 e # x0002a e # x0002a
TM-6 / H-830,98 e # x000b10.735,27 e # x000b11.50,01 e # x0002a 33,63 e # x000b10.20,05 e # x0002a 25,33 e # x000b12.00,005 e # x0002a e # x0002a
a As eficiências do FRET foram calculadas conforme descrito em Materiais e métodos. Os dados representam a média & # x000b1s.e.m. de pelo menos três experimentos independentes. Os valores de P referem-se a comparações estatísticas entre nenhum ligante e três ligantes diferentes: isoproterenol, alprenolol e ICI 118.551.
& # x0002a P& # x0003c0.05 & # x0002a & # x0002a P& # x0003c0.005.

Para fornecer informações adicionais sobre a orientação relativa de & # x003b22Protômeros de AR, investigamos FRET entre diferentes sites de rotulagem. Por exemplo, & # x003945-T66C marcado com Cy3 foi reconstituído com uma quantidade equivalente de & # x003945-A265C marcado com Cy5 para examinar as interações ICL1 / TM6. A mesma abordagem foi seguida para as outras combinações possíveis, ICL1 / H8 e TM6 / H8 (Tabela II). A observação de diferentes eficiências FRET para diferentes pares de marcação sugere um arranjo específico de receptores nas bicamadas lipídicas, em vez de agregação não específica. Para descartar ainda mais a possibilidade de que o FRET observado nesses estudos seja simplesmente devido à aglomeração de receptores marcados na bicamada lipídica, uma concentração molar 10 vezes maior de lipídios (uma proporção final de lipídio para receptor de 10.000: 1) foi usado a fim de reduzir o número de receptores por unidade de área da bicamada lipídica. As eficiências FRET observadas em uma proporção de lipídio para receptor de 10.000: 1 não foram significativamente diferentes daquelas obtidas em uma proporção de 1000: 1 (Figura 5B & # x02013D P& # x0003e0.05).

Saturação FRET de fluoróforo marcado & # x003b22Oligômeros AR

Para investigar ainda mais a especificidade da oligomerização observada, bem como a estequiometria dos oligômeros, realizamos experimentos de saturação FRET onde a razão de fluoróforo aceitador (marcado com Cy5 & # x003b22AR) para fluoróforo doador (marcado com Cy3 & # x003b22AR) é aumentado, enquanto mantém a concentração geral do receptor e a razão lipídio / receptor constante. Se a transferência de energia for devido a interações específicas do receptor & # x02013receptor, a eficiência do FRET saturará conforme a proporção Cy5 / Cy3 é aumentada. Em contraste, as colisões aleatórias devem produzir uma relação quase linear (Mercier et al, 2002 James et al, 2006 Harikumar et al, 2008). Observamos a saturação FRET para todos os três & # x003b22Sites de rotulagem de AR (Figura 6A e # x02013C), demonstrando a natureza específica das interações.

Especificidade de & # x003b22Oligomerização AR avaliada pela saturação FRET. A saturação de FRET envolveu a variação da proporção de Cy5- para Cy3 marcado & # x003b22ARs em um intervalo de 1: 1 a 10: 1 (Cy5: Cy3), enquanto o & # x003b2 geral2A concentração de AR foi mantida constante. FRET saturável é observado para ICL1 / ICL1 (UMA), TM6 / TM6 (B) e H8 / H8 (C) As medições FRET foram realizadas e calculadas conforme descrito nos dados suplementares. Os dados representam a média & # x000b1s.e.m. de pelo menos três experimentos independentes. (D) Os dados de saturação de FRET de todos os três construtos (A & # x02013C acima) foram normalizados para a eficiência máxima de FRET e, em seguida, calculados e plotados juntamente com curvas teóricas (linhas tracejadas) para dímero, trímero, tetrâmero e oligômero de ordem superior que foram gerados usando a equação ( 1) nos dados suplementares.

Além disso, a saturação FRET pode fornecer informações sobre o número de protômeros por oligômero. Nossos resultados de saturação FRET foram comparados com um modelo matemático bem descrito (Veatch e Stryer, 1977 Mercier et al, 2002 James et al, 2006 Harikumar et al, 2008 Harding et al, 2009) que tem sido usado para prever a transferência máxima de energia esperada em experimentos de saturação de transferência de energia (FRET ou BRET) para dímeros, trímeros, tetrâmeros, etc.Segue-se que a saturação ocorrerá em uma razão aceitador / doador mais baixa para oligômeros de ordem superior do que para dímeros simples. Normalizamos nossos dados de saturação FRET para todos os três construtos e os comparamos com modelos para dímeros, trímeros, tetrâmeros e oligômeros de ordem superior (oito protômeros) e descobrimos que nossos dados são sobrepostos na curva teórica para tetrâmeros (Figura 6D).

O efeito da eficácia do ligante em & # x003b22Oligomerização AR

Examinamos os efeitos de três classes de drogas GPCR: um agonista completo (isoproterenol), um antagonista neutro (alprenolol) e um agonista inverso (ICI) na eficiência de FRET entre diferentes locais de marcação. Após o tratamento com quantidades saturantes (10 & # x003bcM) do agonista completo isoproterenol, um pequeno, mas significativo, aumento em FRET foi observado entre TM6 e H8 (Figura 7A e Tabela II P& # x0003c0.05). Em concentrações de saturação (500 nM), o alprenolol produziu um resultado semelhante entre TM6 e H8 (Figura 7A e Tabela II P& # x0003c0.05). Não é possível dizer se essas pequenas mudanças são devidas a mudanças sutis no arranjo relativo dos protômeros ou a pequenas mudanças conformacionais no receptor.

& # x003b22Os oligômeros AR são regulados por agonistas inversos. (UMA) Tratamento de amostras FRET com quantidades saturantes do agonista inverso ICI 118.551, agonista isoproterenol e antagonista neutro alprenolol. (B) Saturação de FRET na presença de ligantes. Isoproterenol e alprenolol não levaram a nenhuma diferença observável da curva de saturação FRET não ligada, enquanto ICI 118.551 rendeu a uma curva que é mais consistente com oligômeros de ordem superior. (C) Cross-linking de Cy5 reconstituído e # x003b22As amostras de AR na presença ou ausência de isoproterenol ou ICI 118.551 foram realizadas conforme descrito nos dados suplementares. (D) Saturação de FRET na presença dos agonistas inversos carvedilol (vermelho) e carazolol (verde). Todos os dados são relatados como média & # x000b1s.e.m. (A, B, D) ou são representativos de pelo menos três experimentos independentes (C). & # x0002a (P& # x0003c0.05) e & # x0002a & # x0002a (P& # x0003c0.005).

Em contraste com as pequenas alterações observadas com o agonista e o antagonista neutro, alterações muito maiores foram observadas após a exposição ao agonista inverso ICI (Figura 7A e Tabela II). Os agonistas inversos incluem muitos compostos que foram originalmente classificados como antagonistas, ligantes que ocupam o sítio de ligação ortostérico, mas não alteram a função do receptor. Em vez disso, os agonistas inversos inibem a atividade independente do agonista basal exibida por muitos GPCRs, incluindo o & # x003b22AR (Galandrin e Bouvier, 2006). Curiosamente, a uma concentração de saturação (500 nM) de ICI, alterações significativas na eficiência de FRET foram observadas para quatro dos seis pares de marcação (Figura 7A e Tabela II). As alterações induzidas por ICI em FRET atingem um máximo em 10 min (Figura Suplementar 4).

As mudanças no FRET observadas com o ICI podem refletir mudanças na orientação dos protômeros ou no número de protômeros no complexo oligomérico. No entanto, essas mudanças também podem ser devido a mudanças induzidas por ligantes na conformação dos receptores que influenciam a mobilidade do fluoróforo ou a polaridade de seu ambiente. Portanto, examinamos o efeito do isoproterenol e do ICI na intensidade da fluorescência e na anisotropia dos fluoróforos em receptores marcados. Para ambos os rótulos Cy3- e Cy5 & # x003b22AR reconstituído individualmente, o tratamento com isoproterenol ou ICI não induziu mudanças significativas na intensidade da fluorescência (dados não mostrados) ou anisotropia dos fluoróforos, sugerindo que a mudança nas eficiências FRET observadas no tratamento com ICI não são resultado de mudanças conformacionais em protômeros (Figura Suplementar 5).

As mudanças induzidas por ICI na eficiência de FRET podem ser atribuídas a vários fatores adicionais: reorientação de protômeros nos oligômeros, um empacotamento mais apertado dos protômeros, um aumento na estabilidade temporal dos oligômeros (assumindo que há um equilíbrio entre monômeros e oligômeros) , e um aumento na estequiometria do estado oligomérico (por exemplo, passando de dímeros ou tetrâmeros para oligômeros de ordem superior). Para distinguir entre essas possibilidades, realizamos a saturação de FRET na presença e ausência de ICI, alprenolol ou isoproterenol. As amostras foram incubadas com ligantes por 30 min em temperatura ambiente e as medições foram feitas. Os resultados mostram que na presença de ICI a curva de saturação é mais semelhante a um modelo para oligômeros de ordem superior, enquanto o alprenolol e o isoproterenol parecem não ter efeito sobre o estado oligomérico aparente do receptor (Figura 7B). Oligomerização de ordem superior também foi observada para os agonistas inversos carazolol e carvedilol (Figura 7D).

A reticulação foi usada para abordar ainda mais o estado de montagem multimérica do & # x003b22AR. Nós costumavamos Bis(NHS) PEO5, um reticulador homobifuncional com um comprimento de espaçador de 21,7 & # x000c5 que modifica covalentemente & # x0025b-aminas de resíduos de lisina e grupos & # x003b1-amina nos terminais N, efetivamente prendendo os receptores que vêm dentro de distâncias de interação. Embora preocupações tenham sido levantadas sobre o potencial dos reticuladores para capturar proteínas que interagem transitoriamente (Brett e Findlay, 1979 Downer, 1985 Medina et al, 2004), é evidente que a pré-incubação de amostras com ICI leva a reticulação e captura mais extensa de oligômeros de ordem superior de & # x003b2 reconstituído2AR quando comparado com as amostras não ligadas, as amostras tratadas com agonista e antagonista (Figura 7C e Figura 6 suplementar). Juntos, esses resultados sugerem que o & # x003b22AR forma oligômeros de ordem superior na presença dos agonistas inversos ICI, carazolol e carvedilol.

Para investigar o efeito do ICI na estabilidade das interações entre os protômeros, monitoramos o FRET após a adição de 0,2 & # x00025 DDM, uma concentração de detergente que solubiliza as vesículas. Descobrimos que o declínio em FRET após a adição de detergente foi mais lento e menos completo em amostras pré-incubadas com ICI em comparação com amostras não ligadas (Figura Suplementar 7, P& # x0003c0.05), fornecendo evidências de que o ICI também estabiliza as interações entre os protômeros.

O efeito do Gs sobre & # x003b22Oligomerização AR

Para investigar o efeito do acoplamento da proteína G na oligomerização, realizamos experimentos de saturação FRET reconstituindo & # x003b22AR com um excesso molar de três vezes de heterotrímero Gs purificado (Figura 8). Esta concentração de proteína G foi escolhida para garantir que proteína G suficiente seria incorporada nas vesículas, tendo um efeito mínimo na reconstituição. A inclusão de Gs não alterou a orientação do & # x003b22AR conforme determinado pela suscetibilidade a PNGase F (Figura 8A). Observamos uma significância estatística (P& # x0003c0.008) diminuição da saturação FRET na presença de Gs em comparação com reconstituições na ausência de Gs (Figura 8B) para Cy5 / Cy3 de 0,25, 0,5 e 1. Para determinar se o efeito de Gs na saturação de FRET foi devido a efeitos inespecíficos de reconstituição com outra proteína associada à membrana, realizamos a saturação FRET de & # x003b22AR na presença de Gs e GTP & # x003b3S, que desacopla & # x003b22AR e Gs. Conforme mostrado na Figura 8C, a presença de GTP & # x003b3S aumenta, de maneira estatisticamente significativa (P& # x0003c0.04), saturação FRET para os valores observados para & # x003b22AR sozinho. Para estimar a fração de & # x003b22AR que se acopla a Gs sob essas condições de reconstituição, rotulamos C265 na extremidade citoplasmática de TM6 com mBBr, uma sonda fluorescente ambientalmente sensível. Mostramos anteriormente que o acoplamento máximo de Gs a & # x003b22AR reconstituído em partículas de HDL resulta em uma diminuição na intensidade de fluorescência e um deslocamento de 18 nm no comprimento de onda de emissão máximo (& # x003bbMAX) de mBBr & # x02013 & # x003b22AR (mBBr & # x02013 & # x003b22AR Yao et al, 2009). Conforme mostrado na Figura 8D, sob condições de reconstituição usadas para experimentos de saturação FRET, Gs induziu uma diminuição na intensidade e um deslocamento de 4 nm em & # x003bbMAX de mBBr & # x02013 & # x003b22AR em relação à mesma reconstituição na presença de GTP & # x003b3S. Com base na mudança de & # x003bbMAX estimamos que aproximadamente 20 & # x00025 do reconstituído & # x003b22AR é acoplado a Gs.

Efeito da proteína G Gs na saturação FRET de Cy5- e Cy3-marcado & # x003b22AR. A saturação de FRET foi realizada variando a proporção de Cy5- para Cy3-marcado & # x003b22AR-R333C em um intervalo de 1: 4 a 4: 1 (Cy5: Cy3), enquanto o & # x003b2 geral2A concentração de AR foi mantida constante. Heterotrímero Gs purificado foi adicionado a uma razão molar de 3 Gs: 1 & # x003b22AR antes da reconstituição. (UMA) A inclusão de Gs na reconstituição não alterou a orientação de & # x003b22AR em vesículas, conforme determinado pela suscetibilidade de reconstituídos & # x003b22AR para PNGase F (consulte a Figura 3C). A saturação de FRET foi significativamente menor na presença de Gs em comparação com & # x003b22AR sozinho (B) ou & # x003b22AR e Gs com 10 & # x003bc M GTP & # x003b3S (C). (D) & # x003b22AR foi rotulado em C265 na extremidade citoplasmática de TM6 com mBBr & # x02013 & # x003b22AR e reconstituído com Gs nas mesmas condições que foram usadas para experimentos de saturação FRET. Gs induziu uma diminuição na intensidade e um deslocamento de 4 nm em & # x003bbMAX de mBBr & # x02013 & # x003b22AR em relação à mesma reconstituição na presença de GTP & # x003b3S. Uma ANOVA de duas vias foi usada para comparar os valores FRET para & # x003b22AR, & # x003b22AR & # x0002bGs e & # x003b22AR & # x0002bGs & # x0002bGTP & # x003b3S nas diferentes relações Cy5: Cy3. A posteriori a análise estatística mostrou diminuição significativa no FRET entre & # x003b22AR e & # x003b22AR & # x0002bGs (P& # x0003c0.008), e um aumento significativo em FRET entre & # x003b22AR & # x0002bGs e & # x003b22AR & # x0002bGs & # x0002bGTP & # x003b3S (P& # x0003c0.04) para todas as relações Cy5: Cy3, exceto 2 e 4. Nenhuma diferença estatística foi encontrada entre & # x003b22AR e & # x003b22AR & # x0002bGs & # x0002bGTP & # x003b3S.


Discussão

O PI3K-Akt é um regulador chave na mediação da sobrevivência celular (Franke et al, 2003). Nós agora delineamos uma nova via que liga PI3K-Akt com uma proteína de domínio BRCT TopBP1 para o controle das atividades de E2F1 e Miz1. Através da via Akt-TopBP1, tanto a apoptose induzida por E2F1 quanto a parada do ciclo celular induzida por Miz1 podem ser controladas para garantir a progressão da proliferação normal. Além disso, um novo mecanismo de regulação da função TopBP1 através da oligomerização dependente de Akt também foi elucidado.

Via Akt-TopBP1 no controle da apoptose mediada por E2F1

Nós fornecemos evidências convincentes de que Akt fosforila TopBP1 em um único resíduo Ser 1159. Este evento de fosforilação é necessário para o TopBP1 reprimir as atividades transcricionais e pró-apoptóticas de E2F1 sob condições fisiológicas. Também demonstramos que a regulação de E2F1 por TopBP1 é independente de todas as proteínas de bolso. Tomados em conjunto, agora propomos uma via envolvendo Akt-TopBP1 em paralelo à via clássica Cdk-Rb (Figura 7F) para o controle da apoptose dependente de E2F1. Em resposta à estimulação do fator de crescimento, a ativação de Cdk leva à fosforilação de pRb e liberação de E2F livre para induzir a entrada na fase S. A ativação de PI3K-Akt é importante para controlar a atividade pró-apoptótica de E2F1 por meio da regulação de TopBP1 durante a transição G1 / S. Para garantir o controle adequado da apoptose, existem vários ciclos de feedback. TopBP1 na verdade é um alvo E2F e seus picos de nível nas fases G1 / S e S (Liu et al, 2004 Yoshida e Inoue, 2004). E2F também ativa Gab2 e regula positivamente a atividade Akt (Chaussepied e Ginsberg, 2004). Durante a fase S, a atividade E2F1 é inibida pela ciclina A / Cdk2 (Krek et al, 1994 Xu et al, 1994). Juntos, esses mecanismos fornecem uma regulação em várias camadas para controlar a apoptose mediada por E2F1 durante a proliferação celular.

A via Akt-TopBP1 também pode controlar E2F1 durante danos ao DNA. A interação entre TopBP1 e E2F1 é induzida após fosforilação de E2F1 em Ser 31 por ATM (Liu et al, 2003). TopBP1 pode ser fosforilado por ATM (Yamane et al, 2002) e o nível de proteína TopBP1 é induzido pelo agente radiomimético neocarzinostain (NCS) (Liu et al, 2003). A radiação ionizante ativa Akt (Contessa et al, 2002 Viniegra et al, 2005), que foi confirmado em nossas mãos pelo tratamento NCS (dados não mostrados). ATM medeia a fosforilação de Akt em Ser 473 e contribui para a ativação de Akt em resposta à radiação ionizante (Viniegra et al, 2005). A ativação de Akt durante o tratamento com adriamicina inibe a expressão de genes alvo de E2F1 por meio da ação de TopBP1 (Figura 3B). Portanto, em resposta à radiação ionizante, a ATM quinase pode ter como alvo a via Akt-TopBP1 para controlar a apoptose mediada por E2F1 e permitir que o reparo do DNA seja concluído.

Via Akt-TopBP1 no controle de HPV 16 E2 e Miz1

A interação entre TopBP1 e HPV16 E2 ou Miz1 requer o local de fosforilação Akt também. Esses resultados sugerem que Akt – TopBP1 também regula outros processos biológicos. HPV16 E2 é essencial para o ciclo de vida dos HPVs. Ele regula a transcrição do genoma viral. Ele também interage com o fator de replicação viral E1 e recruta E1 para origens de replicação para replicação viral. TopBP1 interage com HPV16 E2 e aumenta sua capacidade de ativar a transcrição e replicação (Boner et al, 2002). Durante a infecção por HPV, o HPV E7 tem como alvo os membros da família de proteínas de bolso, como pRb, para liberar E2Fs. Também ativa a Akt por meio de uma interação com PP2A, evitando a desfosforilação da Akt ativada (Pim et al, 2005). Assim, a ativação de Akt por E7 poderia regular TopBP1 e aumentar a ativação mediada por E2 da transcrição e replicação viral.

Miz1 é um fator de transcrição de dedo de zinco associado a Myc. Miz1 está envolvido na parada do ciclo celular através de sua atividade para transativar p15 INK4b e p21 Cip1 (Wanzel et al, 2003). Myc interage com Miz1 e reprime a ativação transcricional por Miz1, pelo menos em parte por meio da competição com p300 pela ligação a Miz1 (Staller et al, 2001). A interação com Miz1 desempenha um papel crucial na mediação da repressão transcricional por Myc. TopBP1 interage com Miz1 por meio de seus domínios BRCT7 e BRCT8 e reprime a atividade transcricional de Miz1 (Herold et al, 2002). Nossos dados sugerem ainda que a fosforilação por Akt é necessária para que TopBP1 se ligue e reprima Miz1. Além do controle de Miz1 por Akt-TopBP1, Akt também fosforila Miz1 diretamente, esta fosforilação leva à ligação de 14-3-3η ao domínio de ligação ao DNA de Miz1 e inibe a função de Miz1 (Wanzel et al, 2005). Portanto, Akt regula Miz1 para controlar a parada do ciclo celular diretamente por meio da fosforilação de Miz1, bem como indiretamente por meio da fosforilação de TopBP1 (Figura 7F). A inibição mediada por 14-3-3η e mediada por TopBP1 de Miz1 são provavelmente dois processos alternativos, uma vez que não há interação detectável entre TopBP1 e 14-3-3 para sugerir uma formação de complexo trimérico Miz1 / TopBP1 / 14-3-3 (Figura 6 complementar). A inibição da expressão de p21 durante o tratamento com adriamicina por ca-Akt é abolida por TopBP1 siRNA (Figura 3B), sugerindo que a regulação de Miz1 por Akt, pelo menos no controle de p21 durante o dano ao DNA, é principalmente mediada por TopBP1. Um papel de Miz1 para a prisão de G1 foi demonstrado no contexto de danos ao DNA (Seoane et al, 2002 Wanzel et al, 2005) e sinalização de TGFβ (Seoane et al, 2001). A regulação da atividade de Miz1 por Akt-TopBP1 sugere que Miz1 pode estar sob repressão constante por Akt-TopBP1 durante a proliferação normal, semelhante ao controle para apoptose mediada por E2F1. A hipótese é apoiada pelo fato de que Akt – TopBP1 é necessário para controlar a expressão de p21, um dos genes alvo de Miz1, durante o crescimento normal (Figuras 3A e 7E). Isso pode explicar a falta de efeito mensurável na expressão gênica em células não estressadas pela depleção de Miz1 (Wanzel et al, 2005 ).

A fosforilação de Akt regula a oligomerização da proteína TopBP1

Akt geralmente regula seus substratos alterando sua atividade enzimática ou aumentando a afinidade dos substratos para proteínas 14-3-3, retendo assim substratos fosforilados no citosol. A localização nuclear de TopBP1 não é regulada por Akt, nem podemos detectar a interação entre 14-3-3 e TopBP1 em células HEK293 em crescimento (Figura Suplementar 6). Apresentamos evidências de que a fosforilação de TopBP1 por Akt leva à autoassociação direta de domínios BRCT de TopBP1. Até onde sabemos, isso representa o primeiro exemplo de que a fosforilação por Akt induz a oligomerização de proteínas como mecanismo regulador. Considerando que o fosfopeptídeo BACH1 se liga às repetições BRCT de BRCA1 por meio de interações específicas com uma fenda de superfície na junção das duas repetições BRCT (Shiozaki et al, 2004), o domínio TopBP1 BRCT6 sozinho pode não ser suficiente para promover a interação estável entre TopBP1 e E2F1. A oligomerização de TopBP1 poderia trazer dois BRCT6 para a proximidade para estabilizar sua interação com E2F1. Não está claro neste momento se TopBP1 se forma como dímeros, trímeros, tetrâmeros ou multímeros de ordem superior dentro das células. Seria muito informativo analisar a estrutura multimérica do complexo TopBP1. A base estrutural para o papel do Ser 1159 fosforilado na autoassociação do TopBP1 também é uma questão muito interessante. A atividade de ligação de fosfopeptídeo de BRCT78 em relação a um pSer 1159 -peptídeo sugere um modelo em que a fosforilação de Ser 1159 cria um local de ligação para o BRCT78 de outras moléculas TopBP1 e induz a oligomerização.

Embora o TopBP1 esteja envolvido em vários aspectos do metabolismo do DNA, a oligomerização da proteína parece ser especificamente necessária para sua interação com fatores de transcrição. Dada a conservação de Ser 1159 e sua sequência circundante no metazoário TopBP1, a oligomerização dependente de Akt também é provavelmente conservada. O domínio de oligomerização de carboxila de TopBP1 não é encontrado em homólogos de levedura. Assim, parece que a oligomerização e a função de regulação da transcrição foram adquiridas no metazoário TopBP1 durante a evolução. É tentador especular que Akt pode regular seletivamente a função transcricional de TopBP1.Embora o sítio de fosforilação Akt não seja necessário para sua ligação a Rad9 ou topoisomerase IIβ, seria muito interessante testar se a oligomerização de TopBP1 está envolvida na ativação do ponto de verificação ou na replicação do DNA. É importante notar que a interação entre TopBP1 e Rad9 depende do quarto e quinto motivos BRCT, e não requer o domínio de oligomerização de carboxila. TopBP1 também demonstrou ser um ativador de ATR (Kumagai et al, 2006). Embora o domínio de ativação de ATR (resíduos 978-1286 do TopBP1 humano) contenha resíduo Ser 1159, ele contém apenas uma porção do sétimo motivo BRCT. Assim, é improvável que a oligomerização esteja envolvida neste processo. Se a fosforilação de Akt está envolvida na ativação de ATR justifica uma investigação mais aprofundada. A identificação de fosforilação de Akt e oligomerização de TopBP1 irá facilitar muito estudos futuros nas funções de TopBP1.

O papel da auto-associação TopBP1 no controle de E2F1 pode ter implicações terapêuticas. A maioria das células cancerosas abrigam atividades E2F1 excessivas devido à desregulação da via Rb. A regulação negativa de TopBP1 induz apoptose dependente de E2F1 (Liu et al, 2004), portanto, as células contendo níveis mais elevados de E2F1 seriam mais suscetíveis aos inibidores TopBP1. O domínio de oligomerização de TopBP1 pode ser considerado como um alvo terapêutico para reprimir a atividade de E2F1 e potencializar a apoptose mediada por E2F1 durante a quimioterapia.


Referências

Terrillon S e Bouvier M (2004) Roles of G-protein-coupled receptor dimerization. EMBO Rep 5: 30–34

Milligan G (2004) dimerização do receptor acoplado à proteína G: função e farmacologia do ligante. Mol Pharmacol 66: 1–7

Park PS et al. (2004) Oligomerização de receptores acoplados à proteína G: passado, presente e futuro. Bioquímica 43: 15643–15656

Rocheville M et al. (2000) Subtipos do receptor de somatostatina se reúnem como homo e heterodímeros funcionais. J Biol Chem 275: 7862–7869

Pfeiffer M et al. (2001) Homo- e heterodimerização de subtipos de receptor de somatostatina. Inativação da função do receptor SST (3) por heterodimerização com SST (2A). J Biol Chem 276: 14027–14036

Grant M et al. (2004) Dissociação dependente de agonista de dímeros do receptor 2 da somatostatina humana: um papel no tráfego do receptor. J Biol Chem 279: 36179–36183

Monnot C et al. (1996) Os resíduos polares nos domínios transmembranares do receptor da angiotensina II Tipo 1 são necessários para a ligação e o acoplamento. J Biol Chem 271: 1507–1513

Abdalla S et al. (2004) A transglutaminase do fator XIIIA reticula dímeros do receptor AT (1) de monócitos no início da aterosclerose. Célula 119: 343–354

Miura S et al. (2005) O receptor homo-oligomérico da angiotensina II tipo 2 constitutivamente ativo induz a sinalização celular independente da conformação do receptor e da estimulação do ligante. J Biol Chem 280: 18237–18244

Terrillon S et al. (2003) Os receptores de oxitocina e vasopressina V1a e V2 formam homo e heterodímeros constitutivos durante a biossíntese. Mol Endocrinol 17: 677–691

Zhu X e Wess J (1998) Truncated V2 vasopressin receptors as negative regulators of wild-type V2 receiver function. Bioquímica 37: 15773–15784

Kroeger KM et al. (2001) Homo-oligomerização constitutiva e dependente de agonista do receptor do hormônio liberador de tirotropina. Detecção em células vivas usando transferência de energia de ressonância de bioluminescência. J Biol Chem 276: 12736–12743

Song GJ et al. (2005) A dimerização regulada do receptor do hormônio liberador de tireotropina afeta o tráfego do receptor, mas não a sinalização. Mol Endocrinol 19: 2859–2870

Latif R et al. (2001) Oligomerização do receptor de tireotropina humana: hTSHR marcado com proteína fluorescente revela complexos pós-tradução. J Biol Chem 276: 45217–45224

Latif R et al. (2002) Inibição dependente de ligante da oligomerização no receptor de tireotropina humana. J Biol Chem 277: 45059–45067

Urizar E et al. (2005) Glycoprotein hormone receptors: link between receptor homodimerization and negative cooperativity. EMBO J 24: 1954–1964

Calebiro D et al. (2005) O aprisionamento intracelular do receptor de TSH de tipo selvagem por oligomerização com mutantes ligados à resistência dominante ao TSH. Hum Mol Genet 14: 2991–3002

Roess DA et al. (2000) Os receptores do hormônio luteinizante são autoassociados na membrana plasmática. Endocrinologia 141: 4518–4523

Horvat RD et al. (2001) Os receptores do hormônio luteinizante são autoassociados em complexos de difusão lenta durante a dessensibilização do receptor. Mol Endocrinol 15: 534–542

Osuga Y et al. (1997) A co-expressão de fragmentos defeituosos do receptor do hormônio luteinizante reconstitui parcialmente a geração de sinal induzida por ligante. J Biol Chem 272: 25006–25012

Ji I et al. (2002) Cis- e transativação de receptores de hormônio: o receptor de LH. Mol Endocrinol 16: 1299–1308

Tao YX et al. (2004) Auto-associação constitutiva e dependente de agonista do receptor de lutropina humana da superfície celular. J Biol Chem 279: 5904–5914

Ji I et al. (2004) A transativação de receptores mutantes do hormônio folículo-estimulante gera seletivamente apenas um dos dois sinais hormonais. Mol Endocrinol 18: 968–978

Fan QR et al. (2005) Estrutura do hormônio estimulador do folículo humano em complexo com seu receptor. Natureza 433: 269–277

Córnea A et al. (2001) Microagregação do receptor do hormônio liberador de gonadotropina. Taxa monitorada por transferência de energia de ressonância de fluorescência. J Biol Chem 276: 2153–2158

Horvat RD et al. (2001) A ligação do agonista, mas não do antagonista, leva à transferência de energia de ressonância de fluorescência entre os receptores do hormônio liberador de gonadotrofina intrinsecamente fluorescente. Mol Endocrinol 15: 695–703

Irmãos SP et al. (2004) Mutantes de receptor de GnRH de 'perda de função' humana retêm receptores de tipo selvagem no retículo endoplasmático: base molecular do efeito negativo dominante. Mol Endocrinol 18: 1787–1797

Berglund MM et al. (2003) Os homodímeros do receptor do neuropeptídeo Y Y4 se dissociam após a estimulação agonista. J Pharmacol Exp Ther 307: 1120–1126

Dinger MC et al. (2003) Homodimerização de receptores de neuropeptídeo Y investigados por transferência de energia de ressonância de fluorescência em células vivas. J Biol Chem 278: 10562–10571

Mandrika I et al. (2005) Os receptores de melanocortina formam homo e heterodímeros constitutivos. Biochem Biophys Res Commun 326: 349–354

Biebermann H et al. (2003) O modo autossômico dominante de herança de uma mutação do receptor de melanocortina-4 em um paciente com obesidade de início precoce grave é devido a um efeito negativo dominante causado pela dimerização do receptor. Diabetes 52: 2984–2988

Bai M et al. (1998) Dimerização do receptor extracelular de detecção de cálcio (CaR) na superfície celular de células HEK293 transfectadas com CaR. J Biol Chem 273: 23605–23610

Bai M et al. (1999) As interações intermoleculares entre monômeros de receptores sensíveis ao cálcio dimérico são importantes para sua função normal. Proc Natl Acad Sci USA 96: 2834–2839

Jensen AA et al. (2002) Probing intermolecular proteína-proteína interações no cálcio-sensing receptor homodímero usando bioluminescence ressonância energia transferência (BRET). Eur J Biochem 269: 5076–5087

Pin JP et al. (2005) Allosteric function of dimeric class C G-protein-coupled receptors. FEBS J 272: 2947–2955

Patel RC et al. (2002) A transferência de energia de ressonância de fluorescência de fotodegradação revela a formação de oligômero induzida por ligante de subtipos de receptores de somatostatina humanos. Métodos 27: 340–348

Rocheville M et al. (2000) Receptores para dopamina e somatostatina: formação de hetero-oligômeros com atividade funcional aumentada. Ciência 288: 154–157

Terrillon S et al. (2004) A heterodimerização dos receptores de vasopressina V1a e V2 determina a interação com β-arrestina e seus padrões de tráfico. Proc Natl Acad Sci USA 101: 1548–1553

Hanyaloglu AC et al. (2002) Homo e hetero-oligomerização de subtipos de receptor do hormônio liberador de tireotropina (TRH). Regulação diferencial de beta-arrestinas 1 e 2. J Biol Chem 277: 50422–50430

Saveanu A et al. (2002) Demonstração da potência aumentada de uma molécula quimérica de somatostatina-dopamina, BIM-23A387, na supressão do hormônio do crescimento e secreção de prolactina de células de adenoma somatotrófico pituitário humano. J Clin Endocrinol Metab 87: 5545–5552

Milligan G e Bouvier M (2005) Métodos para monitorar a estrutura quaternária de receptores acoplados à proteína G. FEBS J 272: 2914–2925

Eidne KA et al. (2002) Aplicações de novas técnicas de transferência de energia de ressonância para estudar interações dinâmicas de receptor de hormônio em células vivas. Trends Endocrinol Metab 13: 415–421

Förster T (1948) Migração de energia intermolecular e fluorescência. Ann Phys (Leipzig) 2: 55–75

Suhling K et al. (2005) Microscopia de fluorescência resolvida no tempo. Photochem Photobiol Sci 4: 13–22

Maurel D et al. (2004) Detecção de superfície celular de interação de proteína de membrana com tecnologia de transferência de energia de ressonância de fluorescência resolvida no tempo homogênea. Anal Biochem 329: 253–262

Xu Y et al. (1999) Um sistema de transferência de energia de ressonância de bioluminescência (BRET): aplicação a proteínas de relógio circadiano em interação. Proc Natl Acad Sci USA 96: 151–156

Ban T et al. (1992) Anticorpo específico para o receptor de tireotropina identifica múltiplas formas de receptor em membranas de células transfectadas com ácido desoxirribonucléico complementar de receptor de tipo selvagem: caracterização de sua relevância para a síntese, processamento, estrutura e função do receptor. Endocrinologia 131: 815–829

Grossman RF et al. (1995) A imunoprecipitação isola múltiplas formas de receptor de TSH do tecido tireoidiano humano. Tireoide 5: 101–105

Graves PN et al. (1996) Formação de complexo multimérico pelo receptor de tireotropina em membranas tireoidianas solubilizadas. Endocrinologia 137: 3915–3920

Alberti L et al. (2002) Mutações da linha germinal do gene do receptor de TSH como causa de hipotireoidismo subclínico não autoimune. J Clin Endocrinol Metab 87: 2549–2555

Refetoff S (2003) Resistance to thyrotropin. J Endocrinol Invest 26: 770–779

Persani L et al. (2004) Diferentes formas de resistência à ação da tireotropina (TSH). No Síndromes de resistência hormonal no eixo hipotálamo-hipófise-tireoide, 177-192 (Ed. Beck-Peccoz P) Norwell, MA: Kluwer Academic


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