Em formação

Ensaios de ligação de ligante: IC50, EC50 e Kd


Estou revisando vários preditores de afinidade de ligação de peptídeo MHC treinados em dados IEDB. Os registros quantitativos para alótipos MHC classe I vêm de vários ensaios diferentes e, por extensão, têm diferentes tipos de medição. Aqui estão as descrições de tipo de medição mais comuns (não as alterei de forma alguma):

  1. constante de dissociação KD (~ IC50)
  2. constante de dissociação KD (~ EC50)
  3. metade da concentração inibitória máxima (IC50)
  4. constante de dissociação KD
  5. metade da concentração efetiva máxima (EC50)

Todos os preditores que analisei até agora consideram esses tipos de medição intercambiáveis, o que acho extremamente estranho. Embora IC50 e EC50 possam de fato ser semelhantes em certas circunstâncias experimentais, acho difícil acreditar que qualquer um deles possa ser aproximadamente igual a Kd (este site já tem uma postagem sobre o assunto). Entrei em contato com vários autores e curadores de banco de dados, e todos eles me garantiram que esses valores podem de fato ser considerados mais ou menos intercambiáveis, mas não consigo encontrar nenhuma referência para apoiar essas afirmações.


Um guia para ensaios de ligação simples e informativos

O objetivo dos ensaios de ligação é medir as interações entre duas moléculas, como uma proteína que se liga a outra proteína, uma pequena molécula ou um ácido nucleico. É necessário muito trabalho para preparar os reagentes, mas as falhas no projeto de muitos experimentos de ligação limitam as informações obtidas. Em particular, muitos experimentos falham em medir a afinidade dos reagentes entre si. Este ensaio descreve métodos simples para obter o máximo de reagentes valiosos em experimentos de ligação.


Resumo

Uma nova ferramenta de servidor da web estima Keu valores determinados experimentalmente IC50 valores para inibidores de enzimas e de reações de ligação entre macromoléculas (por exemplo, proteínas, ácidos polinucleicos) e ligantes. Esse conversor foi desenvolvido para permitir que os usuários finais ajudem a avaliar a qualidade das suposições subjacentes usadas nesses cálculos, que dependem do tipo de mecanismo de ação do inibidor e das concentrações das espécies moleculares em interação. Cálculos adicionais são realizados para inibidores não clássicos, fortemente ligados de enzima-substrato ou de sistemas macromolécula-ligante nos quais são necessárias concentrações livres, em vez de concentrações totais das espécies reagentes. Os valores de entrada definidos pelo usuário necessários incluem a enzima total (ou outra molécula alvo) e as concentrações de substrato (ou ligante), o Km do substrato de enzima (ou o Kd reação do ligante-alvo), e o IC50 valor. Suposições e advertências para esses cálculos são discutidas junto com exemplos retirados da literatura. O banco de dados do host para este conversor contém constantes cinéticas e outros dados para inibidores das neurotoxinas clostridiais proteolíticas (http://botdb.abcc.ncifcrf.gov/toxin/kiConverter.jsp).


Análise de regressão não linear

A complexidade dos sistemas biológicos resulta em uma relação dose-resposta não linear que requer consideração de vários parâmetros durante a análise. A análise de dose-resposta é um tipo de análise de ajuste de curva que usa regressão não linear e modelo matemático iterativo que se ajusta aos seus dados e considera esses parâmetros para caracterizar com precisão a relação dose-resposta.

A regressão não linear pode determinar a potência do fármaco e rsquos (EC50 ou IC50), encontrar os valores de melhor ajuste, comparar os resultados de diferentes experimentos e interpolar desconhecidos de uma curva padrão. Por exemplo, você pode estudar o efeito do tratamento de células com um agonista na presença e ausência de um antagonista (um inibidor), conforme mostrado abaixo.

No entanto, esta análise tem várias suposições e limitações.

Suposições de regressão não linear

O valor exato de X é conhecido. Os valores Y são os únicos valores que apresentam erros (dispersão).

A variabilidade dos valores de Y em X segue a distribuição em forma de sino gaussiana.

Variância uniforme: a quantidade de dispersão (desvio padrão) é a mesma ao longo da curva. Experimente as ferramentas de ponderação no Prism para resolver a variância não uniforme.

Todas as observações (valores de Y) são independentes (3).

Limitações

Os sistemas biológicos são muito complexos e a análise de regressão não linear pode não caracterizar totalmente a relação dose-resposta. Por exemplo, EC50 pode ser determinado tanto pela afinidade quanto pela eficácia do medicamento. O Prism oferece várias ferramentas para determinar a afinidade e eficácia.

- A afinidade é o quão bem o medicamento se liga ao receptor.

o A eficácia é a capacidade do medicamento de provocar uma resposta uma vez ligado. A eficácia pode variar amplamente.

Os resultados podem variar dependendo da faixa de concentração e tipo de célula / tecido sendo usado.

Os valores iniciais dos parâmetros usados ​​também afetam a análise e podem precisar de restrição para aumentar a qualidade da análise.


O que é uma afinidade de ligação & # 8220good & # 8221 para um medicamento?

Se você passou algum tempo olhando apresentações de empresas de biotecnologia, provavelmente terá encontrado um slide como o abaixo, dos desenvolvedores de medicamentos contra o câncer Mirati, que resumem muito bem a atividade, potência e seletividade de seu inibidor KRAS MRTX-849 [1] .

O objetivo deste post é revisar os conceitos representados no slide Mirati acima (afinidade de ligação e como ela se relaciona com a potência e seletividade) e fornecer alguma intuição sobre como & # 8220good parece & # 8221 para esses parâmetros. Eu & # 8217d também gostaria de reunir uma referência para pessoas sem um sólido conhecimento em farmacologia que, no entanto, desejam compreender apresentações de dados como esta.

Para aqueles que desejam apenas um resumo rápido: uma afinidade de ligação de menos de 10 nm (em termos de Kd / Ki / EC50 / IC50) é geralmente considerada & # 8220bom & # 8221, mas por trás desse valor está um ato de equilíbrio complicado que envolve a otimização de muitos outros atributos de um medicamento, como seletividade, solubilidade e peso molecular, para garantir que os pacientes sejam capazes de se beneficiar de um medicamento que seja eficaz, minimamente tóxico e sem requisitos de dosagem excessivamente onerosos.

O que é afinidade de ligação?

A afinidade de ligação é uma medida da força de uma interação entre uma molécula de ligante (ou seja, um fármaco) e o alvo ao qual ela se liga (muitas vezes um receptor de proteína, enzima, citocina, etc.).

No modelo simplista & # 8220lock and key & # 8221, a afinidade de ligação reflete o quão bem um medicamento & # 8220key & # 8221 se encaixa em seu destino & # 8220lock & # 8221. Intuitivamente, de acordo com o modelo, a encadernação rígida resulta de uma correspondência próxima das formas & # 8220lock & # 8221 e & # 8220key & # 8221, pois os complexos confortáveis ​​são mais energeticamente favoráveis ​​do que os menos vinculados. Na realidade, as proteínas e outras moléculas biológicas grandes são estruturas flexíveis e dinâmicas sem & # 8220locks & # 8221 rígidos, mas a analogia é útil independentemente.

Geralmente, a afinidade de ligação é medida em termos da constante de dissociação (Kd) e é expressa em concentração molar. A constante de dissociação é uma medida da proporção de ligantes não ligados (dissociados) para ligantes ligados em equilíbrio. Quanto mais baixo for o valor de Kd, mais forte será a afinidade de ligação. Você também pode ver essa relação conhecida como constante de inibição (Ki) no contexto de uma droga inibidora, que é essencialmente a mesma coisa que a constante de dissociação. Para obter uma visão geral dos métodos de medição de Kd, consulte o artigo da Wikipedia sobre ensaios de ligação de ligantes.

Uma equação para uma reação química reversível geral em equilíbrio envolvendo duas moléculas, A e B, e um complexo das duas, AB pode ser expressa como:

A constante de dissociação é então calculada medindo as concentrações das várias moléculas em equilíbrio e conectando os valores na fórmula abaixo

Para nossos propósitos, A poderia representar uma droga, B seu receptor-alvo e AB o complexo droga-receptor ligado. Os colchetes significam a concentração. xey representam o número de moléculas de A e B envolvidas em cada instância da reação, respectivamente. Quanto menor o Kd, mais moléculas da droga (A) são ligadas ao seu alvo (B) e, portanto, mais forte é a ligação. Ao medir Kd, é importante que a reação tenha tempo suficiente para se equilibrar adequadamente antes de medir as concentrações, ou o Kd pode ser superestimado [2].

Quando x = 1 ey = 1 (como é frequentemente o caso em biologia e farmacologia, por exemplo, quando uma única molécula de uma droga se liga a um único local de receptor), Kd é igual à concentração de A na qual A ligou metade das moléculas de B até o complexo AB em equilíbrio (ou seja, a concentração de B é igual à concentração de AB). De acordo com o cálculo abaixo:

Outra maneira de calcular Kd é tomando a razão da constante de taxa para a reação direta (ligação) (kon) dividida pela constante de taxa da reação reversa (dissociação) (koff).

No entanto, os valores de kon e koff raramente são determinados na prática e você não pode tirar conclusões firmes sobre a duração da ligação apenas de Kd [3]. Embora, em geral, uma afinidade de ligação mais alta resulte no fármaco passar uma proporção maior de tempo ligado ao alvo do que não.

A afinidade de ligação também está relacionada à & # 8220 ocupação fracionária & # 8221 de uma droga, ou seja, a porcentagem de um alvo ligado por uma droga, calculada com a seguinte equação:

A ocupação fracionada é útil porque a atividade biológica de uma droga geralmente depende de sua capacidade de se ligar a uma grande porcentagem dos alvos disponíveis. A partir da equação, você pode ver que o Kd é particularmente importante em baixas concentrações de um medicamento ([A]). Um medicamento com um Kd muito baixo pode ter alta ocupação fracionária, mesmo em baixas concentrações.

Embora a afinidade de ligação diga a você com que força uma droga se liga ao seu alvo, não é a mesma coisa que & # 8220potência & # 8221 ou & # 8220atividade & # 8221 biológica. Esses conceitos são normalmente expressos usando as seguintes medidas, que são mais amplamente usadas na prática para rastrear compostos de drogas do que Kd ou Ki:

  • A metade da concentração inibitória máxima (IC50), que é a concentração de uma droga na qual a atividade de seu alvo (por exemplo, uma enzima) é reduzida a 50% de sua atividade máxima. Os medicamentos que inibem a atividade de seu alvo são chamados de & # 8220antagonistas & # 8221
  • A metade da concentração efetiva máxima (EC50), que é a concentração de um medicamento que induz uma resposta em seu alvo que é 50% da resposta máxima possível. A resposta é uma medida da atividade biológica do alvo, como a taxa de uma reação enzimática. As drogas que ativam seus alvos são chamadas de & # 8220agonistas & # 8221. Agonistas inversos são drogas que causam uma resposta biológica oposta ao que um agonista causaria

Embora EC50 e IC50 não sejam medidas formalmente de afinidade de ligação, você pode vê-los informalmente referidos como & # 8211 e é verdade que um EC50 / IC50 mais baixo implica um Kd / Ki mais baixo, todo o resto sendo igual.

Os valores de EC50 / IC50 são geralmente mais elevados do que os valores de Kd / Ki, mas podem ser os mesmos em certas condições (por exemplo, ligação não competitiva). Para leitores inclinados à matemática, este artigo é uma boa visão geral de como o Ki se relaciona matematicamente com o IC50 sob várias condições

Para ilustrar aproximadamente a relação, eu & # 8217ve traçou Ki vs. IC50 para um subconjunto de compostos semelhantes a drogas de moléculas pequenas em BindingDB abaixo & # 8211 claramente não há nenhuma conversão linear simples de um para o outro:

Embora o gráfico acima tenha alguns exemplos de drogas com um valor de Ki maior do que IC50, teoricamente, os valores de Kd / Ki não deveriam ser menores do que EC50 / IC50 devido a uma relação matemática conhecida como relação de Cheng-Prusoff. No entanto, na prática, o IC50 pode às vezes ser menor do que Ki no caso de reações em estado não estacionário [4] ou erro experimental.

Por que os valores de EC50 / IC50 são geralmente maiores do que a afinidade de ligação?

Mencionei anteriormente que os valores de EC50 / IC50 são geralmente maiores do que os valores de Kd / Ki. Portanto, a afinidade de ligação não é o mesmo que a atividade biológica. Isso pode ocorrer por alguns motivos potenciais:

  • Nos casos em que um medicamento está competindo por um local de ligação com outras moléculas (como o ligante natural de um receptor), os valores de EC50 / IC50 variam dependendo da concentração das outras moléculas. Isso ocorre porque um excesso da droga é necessário para vencer outras moléculas para o local de ligação [5]
  • O local de ligação só pode se tornar acessível sob um estado raro ou transitório do alvo, e uma alta concentração de droga pode ser necessária para que haja droga suficiente & # 8220 ready & # 8221 para efetivamente ligar e modular a atividade do alvo em breves períodos quando é possível fazê-lo [5]
  • Nem toda ligação é convertida em atividade biológica

Vale a pena expandir esse último ponto, enquanto os agonistas completos ativam ao máximo seu alvo, os agonistas parciais apenas provocam uma resposta submáxima, independentemente de sua concentração. Abaixo está um gráfico simples do artigo da Wikipedia sobre ligantes que ilustra bem esse conceito.

Os agonistas parciais podem ser desejáveis ​​nos casos em que a ativação máxima do alvo está associada à toxicidade ou levaria à dessensibilização do receptor [6].

Os inibidores se ligam diretamente aos locais ativos de seus alvos e bloqueiam a ligação dos ligantes naturais (inibição competitiva) ou se ligam em outro lugar no alvo e inibem a atividade indiretamente através da indução de uma mudança na conformação do alvo ou estabilização de uma conformação particular (alostérica ou inibição não competitiva). Os inibidores alostéricos ou não competitivos podem exibir inibição parcial apesar de uma elevada afinidade de ligação, reduzindo a eficácia do seu alvo sem eliminar totalmente a atividade.

Que tipo de afinidade os desenvolvedores de medicamentos buscam?

Ao embarcar em um programa de descoberta de drogas, as empresas farão a triagem de bibliotecas de compostos [7] usando um ensaio específico e medirão a afinidade / potência de ligação para cada um, progredindo na potência mais alta & # 8220hits & # 8221 para desenvolvimento posterior. Os ensaios para medir a potência têm uma variedade de projetos potenciais, dependendo da função biológica do alvo. No exemplo Mirati no início deste post, eles mediram a atividade (IC50) determinando o nível de MRTX-849 necessário para inibir pela metade a proliferação de linhas de células cancerosas que carregam a mutação alvo (KRAS G12C).

Como uma heurística geral, os desenvolvedores de drogas de moléculas pequenas desejam atingir uma afinidade de menos de 10 nM para suas drogas. O limite específico é um tanto arbitrário, mas o intervalo abaixo de 10 nM Kd / Ki / EC50 / IC50 é historicamente onde muitos compostos de drogas eficazes acabaram e é baixo o suficiente para que os desenvolvedores de drogas tenham certeza de que estão engajando suficientemente o alvo desejado . Para citar Derek Lowe: [8]

Quanto mais baixo [o IC50], melhor, sendo as demais coisas iguais. A maioria das drogas está na faixa nanomolar - abaixo disso estão as faixas ulta-potentes picomolar e femtomolar, onde poucos compostos se aventuram. E acima disso, uma vez que você chega a 1000 nanomolar, é micromolar, e então 1000 micromolar é um milimolar. Pelos padrões tradicionais de química médica:

  • Nanomolar de um dígito = bom
  • Nanomolar de dois dígitos = nada mal
  • Nanomolar de três dígitos ou micromolar baixo = ponto de partida para fazer algo melhor
  • Alto micromolar = ignorar
  • Milimolar = pode fazer melhor com coisas da sola do seu sapato

Isso é bem demonstrado pelo slide abaixo da apresentação da Mirati & # 8217s no AACR em outubro de 2019 [9], onde eles descrevem as modificações feitas em seu composto inicial para aumentar a potência e chegar ao seu composto líder eventual, MRTX849:

No entanto, em comparação com moléculas pequenas, as chamadas modalidades terapêuticas & # 8220 biológicas & # 8221 podem ter afinidades de ligação extremamente fortes na extremidade superior do que é viável com moléculas pequenas & # 8211, uma característica que ajudou a tornar esta classe de drogas tão eficaz e geralmente seguro. Por exemplo:

    Os anticorpos monoclonais normalmente têm afinidades de ligação na faixa picomolar baixa, com uma mediana relatada em torno de 70pM [10]. Por exemplo, o anticorpo monoclonal anti-TNF megablockbuster Humira tem um Kd medido em 8,6pM [11] Kd para um alvo perfeitamente correspondente é

Portanto, embora 10 nM possam ser suficientes para uma molécula pequena, os desenvolvedores de drogas de anticorpos podem esperar um pouco mais de seus candidatos principais antes de progredir para o desenvolvimento clínico.

Quais outras métricas relacionadas são potencialmente importantes além de afinidade, atividade e potência?

Ir do acerto inicial para um medicamento final muitas vezes envolve fazer concessões nos vários atributos de uma molécula, otimizando a afinidade de ligação sobre tudo o mais, podendo resultar em um medicamento geral abaixo do ideal. Para citar um artigo de J. Singh: [15]

Um grande desafio na descoberta de drogas é alcançar alta potência e seletividade em um composto sem aumentar sua massa molecular a ponto de as propriedades farmacêuticas benéficas serem prejudicadas

Eu & # 8217 escolhi algumas métricas adicionais para cobrir nesta pós-seletividade, eficiência do ligante e ligação covalente.

Seletividade:

Seletividade, a propensão de uma droga de se ligar a um alvo em detrimento de outro, é um atributo crítico de uma droga para controlar. Drogas que são & # 8220altamente seletivas & # 8221 têm uma alta afinidade de ligação com o alvo primário e baixa afinidade de ligação com o alvo indesejável, e isso é o que Mirati está ilustrando no lado direito de seu slide no início do post. Pode ser desejável que os compostos se liguem a vários alvos se houver várias vias que contribuem para uma doença. Muitos medicamentos aprovados ligam-se a várias proteínas relacionadas, como os inibidores de JAK e outros inibidores de pan-quinase.

Aumentar a afinidade de ligação para o alvo primário tão alto quanto possível também pode aumentar sua propensão para se ligar a & # 8220 fora do alvo & # 8221, resultando em toxicidade. Como tal, pode haver uma espécie de & # 8220Goldilocks zone & # 8221 para a afinidade de ligação que é influenciada pelo contexto biológico no qual o medicamento se destina a ser usado. Uma forma chave pela qual os desenvolvedores de drogas testarão seus candidatos a drogas é por contra-rastreio contra uma biblioteca de alvos associados à toxicidade, e. hERG (& # 8220antitargets & # 8221) para verificar se o medicamento não se liga muito bem a esses & # 8220antitargets & # 8221.

Eficiência do ligando:

Outra métrica que desenvolvedores de drogas provavelmente irão observar é a eficiência do ligante, uma medida da afinidade de ligação alcançada para o peso molecular do composto. Pesos moleculares mais baixos são geralmente preferíveis, pois drogas maiores são menos solúveis e mais difíceis de entrar nas células-alvo. Lipinski & # 8217s famosa & # 8220Rule of five & # 8221 heuristic pede um peso molecular de menos de 500 daltons, embora ultimamente mais e mais drogas orais grandes tenham chegado ao mercado & # 8211 semaglutide oral sendo um exemplo particularmente bom.

Ligação covalente

A maioria das drogas se liga reversivelmente ao seu alvo. MRTX-849 é na verdade um inibidor covalente direcionado, o que significa que ele forma ligações químicas (potencialmente irreversíveis) com seu alvo. Os desenvolvedores de drogas eram historicamente relutantes em buscar drogas covalentes sistematicamente devido a preocupações com toxicidade e reatividade fora do alvo, mas tem havido algo de um ressurgimento recentemente estimulado pelo sucesso de drogas como o ibrutinibe. Para citar J. Singh novamente: [15]

Os inibidores que dependem da ligação covalente favorecem dramaticamente a forma ligada, o que leva a potências e eficiências de ligantes que são excepcionalmente altas ou, para interações covalentes irreversíveis, mesmo essencialmente infinitas. A ligação covalente, portanto, permite que alta potência seja rotineiramente alcançada em compostos de baixa massa molecular, juntamente com todas as propriedades farmacêuticas benéficas que estão associadas ao tamanho pequeno

O cálculo da afinidade para os inibidores covalentes é abordado de forma diferente para os inibidores não covalentes, uma vez que as reações não são reversíveis. O IC50 é teoricamente de valor limitado devido à influência do tempo de reação no valor & # 8211, no entanto, Mirati ainda optou por relatá-lo.

Outras considerações

Ao projetar uma droga que se ligará competitivamente, também é importante considerar a afinidade relativa do ligante natural para o alvo versus a droga & # 8217s, uma vez que ligantes naturais de ligação forte serão mais difíceis de deslocar e podem exigir afinidades de ligação especialmente altas.

Outros fatores que podem ser importantes incluem a forma e inclinação da curva de dose-resposta (relacionada à largura da janela terapêutica), variabilidade de célula a célula em uma amostra de ensaio de triagem [16], cinética de reação e termodinâmica de ligação de ligante [17].


Fornecemos caracterização bioquímica e biofísica completa das interações ligante-alvo até mesmo para os projetos de descoberta de drogas mais desafiadores por meio da aplicação das tecnologias RIGHT e dos ensaios RIGHT.

A plataforma de triagem Proteros permite uma visão sobre vários modos de inibições:

  • Triagem de inibidor alostérico
  • Inibidores e potencializadores da interação proteína-proteína
  • Afinidade de ligação de alto rendimento e quantificação do tempo de residência
  • Deconvolução da contribuição de ligação não covalente e covalente

Proteros abre caminhos para candidatos a drogas cineticamente otimizados com maior eficácia e seletividade.


HSPMdb: um repositório computacional de moduladores de proteínas de choque térmico

As proteínas de choque térmico (Hsp) estão entre as proteínas altamente conservadas em todos os domínios da vida. Embora originalmente descobertas como uma resposta celular ao estresse, essas proteínas também estão envolvidas em uma ampla gama de funções celulares, como redobramento de proteínas, tráfego de proteínas e sinalização celular. Um grande número de moduladores de Hsp potenciais estão em testes clínicos contra várias doenças humanas. Como o número de moduladores direcionados ao Hsps está crescendo, é necessário desenvolver um repositório de conhecimento abrangente dessas descobertas, que está amplamente disperso. Assim, desenvolvemos um banco de dados acessível pela web, HSPMdb, que é o primeiro de seu tipo, um repositório com curadoria manual de moduladores de Hsp validados experimentalmente (ativadores e inibidores). Os dados foram coletados de 176 artigos de pesquisa e a versão atual do HSPMdb contém 10 223 entradas de compostos que são conhecidos por modular atividades de cinco Hsps principais (Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60 e Hsp40) originados de 15 organismos diferentes (ou seja, humanos, levedura , bactéria, vírus, camundongo, rato, bovino, suíno, canino, frango, Trypanosoma brucei e Plasmodium falciparum). O HSPMdb fornece informações abrangentes sobre as atividades biológicas, bem como as propriedades químicas dos moduladores Hsp. As atividades biológicas dos moduladores são apresentadas como atividade enzimática e atividade celular. No campo da atividade enzimática, parâmetros como IC50, EC50, DC50, Ki e KD foram fornecidos. No campo da atividade celular, foram fornecidas informações completas sobre as atividades celulares (porcentagem de inibição do crescimento celular, EC50 e GI50), tipo de ensaios de viabilidade celular e linha celular utilizada. Um dos recursos importantes do HSPMdb é que ele permite que os usuários filtrem se o composto de interesse tem ou não qualquer semelhança com os moduladores Hsp conhecidos anteriormente. Prevemos que o HSPMdb se tornaria um recurso valioso para a comunidade científica mais ampla que trabalha na área de biologia de acompanhantes e doenças de dobramento incorreto de proteínas. O HSPMdb pode ser acessado gratuitamente em http://bioinfo.imtech.res.in/bvs/hspmdb/index.php.

© The Author (s) 2020. Publicado por Oxford University Press.

Figuras

Representação esquemática da página de navegação ...

Representação esquemática da página de navegação do HSPMdb.

Número total de entradas em ...

Número total de entradas em HSPMdb com base na origem de Hsps ( UMA…

Diferentes andaimes / classes de moduladores visando ...

Diferentes andaimes / classes de moduladores visando Hsp70 ( UMA ), Hsp90 ( B ),…


Explicação

Se os médicos ainda não começaram a encontrar Ki na literatura e bulas de medicamentos, eles provavelmente os encontrarão no futuro.1-3 O Ki, em parte, torna-se importante para ajudar a prever interações medicamentosas clinicamente relevantes.1, 3 Em termos simples, a constante inibitória (Ki) e a metade da concentração inibitória máxima (IC50) de uma droga que é conhecida por causar a inibição de uma enzima do citocromo P450 (CYP) têm a ver com a concentração necessária para reduzir a atividade dessa enzima Pela metade. Mais especificamente, o Ki é reflexo da afinidade de ligação e o IC50 é mais reflexo da força funcional do inibidor, mas ambos influenciam a concentração do fármaco presente para inibir a atividade da enzima. Digno de nota, para os medicamentos que são inibidores não competitivos das enzimas CYP, o Ki de um medicamento é essencialmente o mesmo valor numérico do IC50, enquanto que para a inibição competitiva e não competitiva o Ki é cerca de metade do IC50.3 Portanto , quanto menor o Ki, menor a quantidade de medicamento necessária para inibir a atividade dessa enzima.

Se o Ki for muito maior do que as concentrações plasmáticas máximas do fármaco a que um paciente é exposto na dosagem típica, então esse fármaco provavelmente não inibirá a atividade dessa enzima. Este efeito também pode ser refletido na razão [I] / Ki.1 Um exemplo clinicamente relevante disso pode ser visto avaliando o Ki para inibidores da bomba de prótons (PPIs) na enzima 3A4 do citocromo P-450 (CYP ).4 Neste por exemplo, os Ki são significativamente maiores para a maioria dos PPIs (42 a 51 mM) do que suas respectivas concentrações máximas (1 a 5,2 mM) em pacientes que são metabolizadores extensos ou metabolizadores fracos de 2C219.4-9 porque os Ki para PPIs são tão muito maiores do que as concentrações máximas do fármaco observadas com a dosagem típica, a maioria dos PPIs provavelmente não inibirá a atividade do CYP3A4.

Também é importante reconhecer, ao interpretar ou ao revisar o Ki de um medicamento específico, que alguns fatores são conhecidos por influenciar o valor obtido em um estudo. Esses fatores incluem a especificidade do substrato, os componentes de ligação no sistema de incubação e qualquer esgotamento de substrato ou inibidor.1 No que se refere ao sistema de incubação, dependendo do sistema biológico usado, o Ki pode flutuar resultando em uma faixa para o Ki. 4,10

Portanto, o uso do Ki é útil para designar a probabilidade de que um determinado medicamento iniba uma determinada enzima e resulte em uma interação medicamentosa clinicamente relevante com um substrato para a enzima. Em muitos casos, a avaliação do Ki em relação à concentração do inibidor presente no organismo já foi feita e é usada como base para programas ou determinadas fontes de informação de medicamentos para relatar um determinado medicamento como inibidor ou não. É igualmente importante que os médicos também reconheçam que todos os medicamentos podem ou não ter sido totalmente avaliados, dependendo de sua chegada ao mercado. Nesses casos ou situações, ao tentar discernir a probabilidade de ocorrência de interação medicamentosa entre medicamentos coadministrados, os médicos podem precisar recorrer a esse método de avaliação.


Ensaios de ligação de ligante: IC50, EC50 e Kd - Biologia

Fundo Uma barreira fundamental para a imunoterapia eficaz para o câncer é o microambiente tumoral imunossupressor (TME), caracterizado pela infiltração de células T reguladoras (Tregs) e células supressoras derivadas de mieloide (MDSC). Embora a depleção de células imunossupressoras seja uma estratégia promissora de imunoterapia contra o câncer, as abordagens atuais são ineficazes devido à falta de especificidade e questões de segurança. O receptor 2 do fator de necrose tumoral (TNFR2) está emergindo como um novo alvo seletivo para superar a imunossupressão em TME. A expressão do TNFR2 é geralmente restrita a populações de células altamente imunossupressoras no TME e a via do TNFR2-TNF-α desempenha um papel importante na geração e sobrevivência dessas células. O TNFR2 também é um oncogene regulado positivamente em certos tumores e pode aumentar a sobrevivência das células tumorais. Assim, direcionar o TNFR2 é uma abordagem terapêutica promissora com múltiplos mecanismos de ação potenciais.

Métodos Um painel diversificado de anticorpos para TNFR2 foi criado usando APXiMAB ™, a tecnologia de anticorpo monoclonal de coelho de propriedade da Apexigen. Uma avaliação robusta de mais de 100 candidatos a anticorpos para ligação de TNFR2, bloqueio de TNF-α e ensaios funcionais rendeu APX601, um anticorpo IgG1 humanizado, como o principal candidato terapêutico. A capacidade do APX601 de reverter a supressão imunológica foi avaliada em ensaios de supressão Treg e MDSC. Além disso, a capacidade de APX601 de esgotar células tumorais e Treg que expressam TNFR2 foi avaliada tanto in vitro quanto in vivo usando o modelo de xenoenxerto de camundongo Colo205.

Resultados APX601 liga-se especificamente ao TNFR2 humano com alta afinidade (Kd = 47 pM) e reconhece um epítopo único no domínio CRD1 do TNFR2. APX601 é um antagonista potente que bloqueia a interação TNFR2-TNF-α em ensaios de ligação de ligantes baseados em células (IC50 = 0,149 nM). APX601 é capaz de reverter a supressão imunológica por meio de dois mecanismos: 1) bloqueio significativo das funções imunossupressoras de Tregs e MDSCs, inibindo a ligação de TNFR2 ao seu ligante TNF-α e 2) depleção de Tregs, MDSC e células tumorais que expressam TNFR2 via citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) (EC50 = 1,14 nM) e funções efetoras ADCP (EC50 = 0,71 nM).

Conclusões APX601 é um potente anticorpo antagonista de TNFR2 que reverte a supressão imunológica ao direcionar Treg e MDSC que expressam TNFR2 e induz a morte de células tumorais. Nossos dados apóiam o desenvolvimento de APX601, um promissor anticorpo imunoterapêutico com múltiplos mecanismos potenciais de ação, para o tratamento de uma variedade de tumores sólidos.

Aprovação Ética Amostras de sangue humano saudáveis ​​foram obtidas no Stanford Blood Center (Palo Alto, CA) de doadores consentidos sob um protocolo aprovado.


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