Em formação

12.8: Dinâmica do Citoesqueleto - Biologia


No desenvolvimento inicial dos animais, há uma grande quantidade de rearranjo e migração celular conforme a bolha de células aproximadamente esférica chamada de blástula começa a se diferenciar e formar células e tecidos com funções especializadas. Essas células precisam se mover de seu ponto de nascimento para suas posições finais no animal totalmente desenvolvido. Algumas células, como os neurônios, têm um tipo adicional de motilidade celular - elas estendem processos longos (axônios) para fora do corpo celular até seu alvo de inervação. Tanto na extensão da neurite quanto na motilidade da célula inteira, a célula precisa primeiro mover seus pontos de fixação e depois a maior parte da célula de um ponto a outro. Isso é feito gradualmente e usa o citoesqueleto para tornar o processo mais eficiente. Os principais elementos da motilidade celular estão mudando o ponto de adesão para a frente, limpando o espaço interno pelo rearranjo dos microfilamentos de actina alimentado por miosina e o subsequente preenchimento desse espaço com microtúbulos.

Para que a força seja transmitida, a membrana deve ser fixada ao citoesqueleto. Na verdade, a sinalização de receptores na membrana pode, às vezes, induzir diretamente a rearranjos ou movimentos do citoesqueleto por meio de proteínas adaptadoras que conectam a actina (ou outros elementos do citoesqueleto) às proteínas transmembrana, como os receptores de integrina. Um dos primeiros sistemas experimentais para estudos da interação citoesqueleto-membrana foi o eritrócito (glóbulo vermelho).

As ilustrações acima (Figura ( PageIndex {15} )) mostram algumas das interações de uma extensa rede de microfilamentos de actina com proteínas transmembrana. A anquirina e a espectrina são proteínas de ligação importantes entre as proteínas transmembrana e os microfilamentos. Esta ideia de construir um complexo de proteínas em torno do lado citoplasmático de uma proteína transmembrana é onipresente, e as proteínas de arcabouço (ligação) são usadas não apenas para conectar o substrato extracelular (via proteína transmembrana) ao citoesqueleto, mas também para conectar moléculas de sinalização fisicamente e assim, aumente a velocidade e a eficiência da transdução de sinal.

Proteínas acessórias aos filamentos e microtúbulos foram brevemente mencionadas anteriormente. Entre outras funções, eles podem controlar a polimerização e despolimerização, formar feixes, organizar redes e fazer a ponte entre as diferentes redes do citoesqueleto. Para a actina, as proteínas primárias de controle da polimerização são a profilina, que promove a polimerização e a timosina β4, que sequestra a g-actina. As proteínas de terminação negativa do complexo Arp 2/3 e tropomodulina, e as proteínas de terminação negativa CapZ, severina e gelsolina podem estabilizar as extremidades da f-actina. Finalmente, a cofilina pode aumentar a despolimerização da extremidade (-).

Profilin tem duas atividades que promovem a polimerização. Primeiro, é um fator de troca de nucleotídeos que remove o ATP ligado à g-actina e o substitui por ADP. Isso parece contra-intuitivo, mas continue lendo até o próximo parágrafo. Em segundo lugar, quando ligado a uma g-actina, aumenta a taxa de adição aos microfilamentos de actina. Ele faz isso ligando-se à extremidade oposta ao local de ligação do ATP, deixando esse local e esse lado abertos para a ligação do ATP e da extremidade (+) de um microfilamento. A profilina pode ser encontrada no citoplasma em geral e associada a fosfolipídios (PIP2) e proteínas de membrana, para controlar processos como a remodelação de vanguarda das estruturas do citoesqueleto de f-actina.

Timosina β4 regula a montagem do microfilamento controlando o pool disponível de g-actina. Já afirmamos que maiores concentrações de g-actina podem aumentar as taxas de polimerização. No entanto, devido à natureza altamente dinâmica do citoesqueleto de actina, as restrições de tempo de degradação e produção de nova actina impediriam o controle de resposta rápida necessário. Portanto, o mecanismo ideal é manter um grande pool de monômeros de g-actina, mas regular sua disponibilidade ligando-o a uma proteína sequestrante - timosina β4. Timosina β4 tem uma afinidade 50x maior para g-actina-ATP do que para g-actina-ADP, então é aqui que a profilina volta à cena. Profilin troca o ATP de um Tβ4Complexo -g-actina-ATP para um ADP. O resultado é que o Tβ4 libera o g-actina-ADP, permitindo que ele entre no reservatório geral para formação de filamentos.

A despolimerização aumentada e o abrandamento ou cessação da polimerização podem degradar gradualmente as estruturas de f-actina, mas e se houver necessidade de uma decomposição rápida? Duas das proteínas de cobertura mencionadas anteriormente, gelsolina e severina, têm um modo alternativo de ação que pode separar os microfilamentos de actina em qualquer ponto, ligando-se ao lado de um filamento de actina e alterando a conformação da subunidade à qual está ligado. A mudança conformacional força a interação actina-actina a quebrar, e a gelsolina ou severina então permanece no lugar como uma proteína de terminação (+).

A gelsolina é inibida pelo fosfolipídio PIP2. Fosfolipase C, que decompõe PIP2 também pode aumentar o Ca citosólico2+, que é um ativador da gelsolina. Assim, é possível regular positivamente a atividade da gelsolina pela sinalização de PLC.

No lado dos microtúbulos, devido à instabilidade dinâmica, pode-se pensar que uma enzima de corte não é necessária, mas, na verdade, espastina e katanina são proteínas de corte de microtúbulos encontradas em uma variedade de tipos de células, particularmente neurônios. Há também um Tβ4proteína semelhante à tubulina: Op18, ou stathmin, que se liga a dímeros de tubulina (não monômeros), agindo para sequestrá-los e diminuir a concentração de trabalho. É regulado por fosforilação (que desativa a ligação à tubulina).

Mutações em spastin estão ligadas a 40% das paraplegias espásticas que se distinguem pela degeneração de axônios muito longos. A capacidade de corte da espastina parece ser necessária para a remodelação do citoesqueleto em resposta ao dano neuronal.

As proteínas associadas aos microtúbulos MAP1, MAP2 e tau (t) trabalham cada uma para promover a montagem dos microtúbulos, bem como outras funções. O MAP1 é o mais geralmente distribuído dos três, com a tau sendo encontrada principalmente nos neurônios, e o MAP2 ainda mais restrito aos dendritos neuronais. Estes e alguns outros MAPs também atuam para estabilizar os microtúbulos contra a catástrofe, ligando-se ao lado do microtúbulo e reforçando as interações tubulina-tubulina.

Tau tem uma história biomédica complicada. Sua função normal é clara - montar, estabilizar e ligar os microtúbulos. No entanto, também é encontrado em emaranhados neurofibrilares hiperfosforilados que estão associados à doença de Alzheimer. A causa da doença de Alzheimer ainda não é conhecida, então ainda não está claro se os emaranhados da proteína tau desempenham um papel importante em qualquer um dos sintomas.

Finalmente, no que diz respeito às proteínas acessórias do microfilamento e dos microtúbulos, existem os ligantes. Alguns dos MAPs acima mencionados podem reticular microtúbulos em arranjos paralelos ou em malha, assim como algumas cinesinas e dineínas, embora sejam convencionalmente consideradas proteínas motoras. No lado do microfilamento, existem muitas proteínas conhecidas que reticulam a f-actina, muitas das quais estão na superfamília do domínio de homologia da calponina, incluindo fimbrina, α-actinina, β-espectrina, distrofina e filamina. Embora todos possam se ligar à actina, a forma da proteína dita diferentes tipos de interação: por exemplo, a fimbrina principalmente agrupa a f-actina em paralelo para formar feixes, enquanto a filamina agrupa os filamentos de actina perpendicularmente para formar redes de malha.

A síndrome FG é uma doença geneticamente ligada caracterizada por retardo mental, cabeça aumentada, hipotonia congênita, ânus imperfurado e agenesia parcial do corpo caloso. Tem sido associada a mutações em vários genes do cromossomo X, incluindo filamina A (FLNA, FLN1, localizado Xq28).

Mutações na distrofina, que é uma proteína muscular importante da superfamília do domínio CD, podem resultar em Distrofia Muscular de Duchenne ou na Distrofia Muscular de Becker relacionada, mas menos grave. A característica mais marcante é uma degeneração muscular proximal progressiva e pseudo-hipertrofia dos músculos da panturrilha. O início da DMD geralmente é reconhecido antes dos 3 anos de idade e é letal aos 20 anos. No entanto, os sintomas da DMD podem não se manifestar até os 20 anos, com boa probabilidade de sobrevida em longo prazo. Embora seja principalmente uma doença que causa perda de massa muscular, a distrofina está presente em outros tipos de células, incluindo neurônios, o que pode explicar uma ligação ao retardo mental leve em alguns pacientes com DMD. Como o FLNA, o gene da distrofina também está localizado no cromossomo X (Xp21.2).


12.8: Dinâmica do Citoesqueleto - Biologia

Apesar de não haver falta de atenção de biólogos celulares, geneticistas e até mesmo teóricos, a citocinese de células animais & mdash durante a qual a célula realmente se aperta em duas após a segregação cromossômica & mdash permanece um mistério não resolvido. É amplamente aceito que o progresso do sulco de divisão é baseado na contração de um feixe de filamentos de actina alinhados e miosinas, o anel contrátil, que é uma característica notavelmente conservada das células animais em divisão. Além disso, experimentos clássicos mostram que as células animais estabelecem a região do sulco em relação à posição e orientação do aparato mitótico baseado em microtúbulos: células de vários tipos corrigidas para deslocamento experimental do fuso metafásico devido à centrifugação, deformação ou micromanipulação, controlando ainda para clivar de forma que o sulco separe um conjunto de cromossomos e o pólo do fuso do outro conjunto.

Actina (azul) e microtúbulos (laranja) no final da citocinese em um zigoto de ouriço verde.

O que é não está claro como a informação espacial imanente dentro do aparato mitótico baseado em microtúbulos, nas profundezas da célula, se coordena com o córtex celular para direcionar a formação do anel contrátil e o início do sulco no local apropriado (ver figura abaixo). Por causa da uniformidade do anel contrátil, muitos biólogos parecem ter assumido que todas as células animais compartilham um mecanismo comum para o posicionamento do sulco e montagem do anel contrátil. No entanto, as células animais são diversas em tamanho, forma e outras propriedades. Experimentos clássicos envolvem os microtúbulos astrais, mas trabalhos mais recentes apontam para o "fuso central" e até mesmo para fatores localizados nos cromossomos. Este aparente conflito entre os resultados clássicos e recentes diz que as células animais seguem regras amplamente diferentes para a especificação do sulco (não é improvável), ou que as células fazem algo mais sutil do que simplesmente ler uma pista espacial dominante (também não improvável).

A natureza do estímulo transmitido do aparelho mitótico para o córtex permaneceu obscura até recentemente. Trabalhos recentes em vários laboratórios, incluindo o nosso, identificam o pequeno GTPase Rho como um elo chave. Rho, que tem papéis bem caracterizados na ativação da miosina e montagem de actina, é necessário para a citocinese em virtualmente todas as células animais onde foi testado. Muitos reguladores de Rho foram descobertos em testes genéticos para defeitos de citocinese. Nós mostramos, usando uma sonda para atividade Rho em células vivas, que Rho ativo se acumula em uma zona equatorial estreitamente definida imediatamente antes do início do sulco. Esta molécula de sinalização tornou-se a principal candidata para o sinal fisiológico ligando a geometria dos microtúbulos à montagem da proteína contrátil no córtex celular durante a citocinese.

Embora possa ser que a maioria das células animais use muitos dos mesmos componentes moleculares para realizar a divisão, nem todas podem usar esse mecanismo do mesmo jeito. Embora muitos dos estudos descritivos e experimentais clássicos sobre a indução de sulcos tenham sido realizados em embriões de ouriços-do-mar e outros invertebrados marinhos, a maior parte da biologia molecular recente da citocinese vem de estudos sobre Drosófila e C. elegans ou em células de mamíferos em cultura. No entanto, as hipóteses sobre a citocinese continuam a ser dominadas por observações que pré-datam as sondas moleculares e a microscopia confocal. Um dos nossos principais projetos de pesquisa é, portanto, reexaminar a citocinese em embriões equinodermos usando microscopia de ponta e sondas moleculares, para descobrir como reconciliar as observações clássicas com o conhecimento emergente dos detalhes moleculares da mecânica celular. Nossos esforços atuais se concentram na dinâmica do citoesqueleto durante a citocinese e no mecanismo de ativação de Rho no sulco de clivagem.

Dinâmica citoesquelética durante a primeira clivagem em ouriços

No passado, muitos estudos sobre citocinese eram interpretados no contexto de um debate entre os modelos de "relaxamento polar" e "estimulação equatorial" para o estímulo sulcador. Os principais pontos de debate foram: quando os microtúbulos atingem regiões diferentes do córtex celular e o que eles fazem quando chegam lá? Eles relaxam o córtex ou promovem a contratilidade? Isso ainda não foi resolvido porque os microscopistas constatam que os microtúbulos astrais alcançam o córtex polar primeiro e em maior número, enquanto muitos experimentos indicam que os microtúbulos promovem a contratilidade cortical.

Zigotos de dólar de areia durante a primeira mitose, fixados e corados para microtúbulos e cromossomos (seções confocais simples). Linha superior: metáfase, anáfase inicial, anáfase final, linha inferior: estágios sucessivos de sulco. Uma variedade de experimentos implica que os microtúbulos estimulam a contratilidade cortical no equador celular, mas também muitos experimentos pretendem mostrar que os microtúbulos são dispensáveis ​​após a anáfase média (quadro mais à direita na linha superior). Em um ovo de ouriço como este, os microtúbulos atingiram os pólos celulares neste estágio, mas não o equador. Eles só alcançam o equador após o início do sulco (quadro esquerdo, linha inferior). Como isso pode ser?

Este debate parece ignorar duas possibilidades importantes: primeiro, talvez os microtúbulos façam muitas coisas ao mesmo tempo, segundo, talvez nem todos os microtúbulos sejam equivalentes. Em qualquer caso, nem o relaxamento polar nem a estimulação equatorial constituem uma explicação satisfatória e abrangente para muitas variantes de citocinese ou processos semelhantes a citocinese, como brotamento somático em moscas, clivagem desigual em equinoide e outros embriões, formação de lobo polar em moluscos e anelídeos, etc. Novamente, talvez as células tenham mais de um truque em seu saco quando se trata de um processo tão fundamentalmente importante como a divisão.

Em trabalhos anteriores sobre sincicial Drosófila embriões, que não sofrem citocinese, descrevemos 1) uma rede de actina citoplasmática que vem e vai com cada ciclo mitótico durante a migração nuclear, e 2) evidências para reorganização ativa de actina e miosina por microtúbulos astrais. Descobrimos uma rede muito semelhante de feixes de filamentos de actina em embriões de ouriço-do-mar (entre outras espécies), que aparecem e desaparecem em fase com a mitose e cuja distribuição não uniforme é de alguma forma dependente de microtúbulos astrais.

Filamentos de actina (à esquerda) e microtúbulos (à direita) em um zigoto de dólar de areia de anáfase tardia, seção confocal de 0,5 mícron. Para ver um panorama de toda a pilha, escolha uma versão pequena [Filme QuickTime v6.2 ou posterior, 3,3 MB] ou uma versão um pouco maior [QuickTime, 7,7 MB].

Atualmente, estamos trabalhando para visualizar a actina e os microtúbulos em embriões vivos para descobrir se o transporte, ou seja, ao longo dos microtúbulos, traz material contrátil para o equador. Os resultados preliminares são que isso faz não Pertencente às células embrionárias de ouriço, a actina no sulco de clivagem parece aparecer no lugar, implicando montagem local, não transporte. Também estamos investigando o recrutamento de miosina II para a região do sulco por meio da coloração de embriões com anticorpos específicos para a cadeia leve reguladora da miosina II fosforilada com serina-19 (miosina "ativada"). Durante a divisão celular normal, a miosina fosforilada está presente em todo o córtex na interfase até a metáfase, mas deixa o córtex no início da anáfase, apenas para retornar especificamente ao equador no final da anáfase. Isso também parece mais consistente com o recrutamento local do que com o transporte de material contrátil pré-existente: simplesmente não há miosina II ativa no córtex imediatamente antes de o sulco aparecer.

Zigotos de ouriço roxo durante a primeira mitose, fixados e corados para DNA (verde) e miosina II fosforilada (seções confocais simples magenta). Linha superior: interfase, metáfase, anáfase. Linha inferior: telófase inicial, intermediária e tardia.

No decorrer desses estudos, também descobrimos que os microtúbulos podem estar envolvidos por um período mais longo na clivagem do que os relatórios anteriores sugerem. Antigamente, acreditava-se amplamente, com base em experimentos usando venenos de microtúbulos como o nocodazol, que os microtúbulos se tornavam dispensáveis ​​para sulcamento logo após a transição metáfase / anáfase, mesmo que o sulco não comece a entrar até que a anáfase esteja completa. Esta conclusão, entretanto, não está de acordo com muitos experimentos que mostram que o sulco pode "corrigir" ou mesmo se reformar inteiramente se o aparelho mitótico se mover após o início do sulco.

A resolução para este conflito particular é simples e profunda: nem todos os microtúbulos astrais são iguais. Descobrimos que o tratamento com altas doses de nocodazol elimina todos os microtúbulos astrais muito rapidamente na interfase, prófase e metáfase, mas não anáfase ou telófase. Durante a anáfase e a telófase, alguns microtúbulos astrais são resistentes à desmontagem induzida por nocodazol e, em três espécies de zigoto equinóide, esses microtúbulos astrais estáveis ​​apontam predominantemente para a região do sulco. Na verdade, as extremidades dos microtúbulos estáveis ​​se correlacionam bem com os pontos iniciais de recrutamento da miosina II para a zona do sulco. Como esses microtúbulos estáveis ​​se formam, e se eles são de fato necessários para a indução do sulco, é um dos focos atuais de nossa pesquisa.

Zigotos de ouriço roxo durante a primeira mitose, fixados e corados para microtúbulos (branco) e miosina II fosforilada (seções confocais simples magenta). Linha superior: metáfase, anáfase, telófase e sulcos concluídos, em células não tratadas. Linha inferior: zigotos de estágios equivalentes, mas tratados cinco minutos antes da fixação com nocodazol. Na metáfase, apenas as fibras do cinetocoro sobrevivem ao tratamento com nocodazol, os microtúbulos astrais desaparecem. Na anáfase, entretanto, alguns microtúbulos astrais permanecem e, durante a telófase, é aparente que a maioria deles aponta para o equador (terceiro painel, linha inferior).

Enquanto isso, o resto dos microtúbulos astrais - os dinâmicos, que desaparecem rapidamente após o tratamento com nocodazol - também têm um papel na definição da zona do sulco.Em células tratadas com nocodazol após o início da anáfase, a zona de miosina equatorial é mais larga do que o normal em células tratadas logo após a transição metáfase / anáfase, a zona de recrutamento de miosina até se expande para cobrir toda a célula. Assim, os microtúbulos astrais dinâmicos, durante a anáfase, delimitam a região do córtex onde ocorre o recrutamento da miosina.

Dez minutos após o tratamento com nocodazol na anáfase tardia, a zona de miosina equatorial e o próprio sulco são muito mais amplos do que o normal, refletindo um papel contínuo dos microtúbulos dinâmicos na formação do domínio de recrutamento de proteínas contráteis durante a telófase.

Nossa hipótese de trabalho atual é que microtúbulos estáveis ​​e microtúbulos dinâmicos têm efeitos opostos na entrega ao córtex de reguladores Rho (veja abaixo). Os microtúbulos estáveis, em virtude de sua persistência, deveriam formar estradas melhores do que os microtúbulos dinâmicos, que podem despolimerizar por baixo de cargas movidas a motor em trânsito. No entanto, como os microtúbulos dinâmicos ainda se ligariam aos motores disponíveis, eles absorveriam os reguladores Rho associados aos motores disponíveis, evitando que fossem entregues ao córtex. Estamos usando uma simulação de computador desenvolvida recentemente para testar se este é um mecanismo plausível e robusto para posicionar o sulco de clivagem.

MKLP1, Rho e GAP / GEFs em ovo de ouriço (Garrett Odell & Victoria Foe)

Motores MKLP1 em microtúbulos em ovo de ouriço (Garrett Odell & Victoria Foe)

Atividade Rho no sulco citocinético

Descobrimos que a pequena GTPase Rho é ativada em uma zona estreita que imediatamente prefigura a formação de sulco nos blastômeros de embrião de ouriço e rã. Nosso trabalho segue descobertas recentes envolvendo Rho e seus reguladores na estimulação ou manutenção de sulcos citocinéticos em diversos tipos de células, incluindo células de cultura de mamíferos, Drosófila células embrionárias e cultivadas, e C. elegans embriões. Mabuchi e colegas (Zygote 1: 325-331) mostraram há mais de uma década que a injeção da exoenzima C3, uma toxina bacteriana que inativa a Rho, em ovos de dólar de areia os impede de se clivar, sem interferir na mitose. Clique na figura abaixo para ver um filme lapso de tempo de ovos de dólar-areia injetados com C3:

Dois ovos de dólar de areia injetados com exoenzima C3 para inativar Rho. Superior esquerdo: um único núcleo zigoto é visível em cada ovo. Canto superior direito: a célula esquerda está terminando a 2ª mitose e presumivelmente tem quatro núcleos, dois dos quais estão em foco, enquanto a célula direita tem dois núcleos que estão prestes a sofrer a 2ª mitose. As partes inferior esquerda e direita mostram que o número de núcleos continua aumentando. Nunca há qualquer sinal de contratilidade cortical, muito menos sulco, durante muitas rodadas de mitose sincicial.

Usamos uma sonda para RhoA ativa desenvolvida no laboratório de Bement. Esta sonda funde eGFP ao domínio de ligação Rho do rhotekin. O RBD de rhotekin liga-se especificamente ao Rho ativo, ligado ao GTP, e é a base dos ensaios de atividade de Rho disponíveis comercialmente. A sonda é sintetizada a partir do mRNA injetado e, quando não ligada ao Rho ativo, difunde-se por todo o citoplasma. No entanto, os locais onde o Rho ativo está concentrado acumulam a sonda por aprisionamento de difusão. Descobrimos que imediatamente antes do sulco, o RhoA ativo aparece em uma estreita faixa equatorial.

Projeções de 18 seções consecutivas de 1 mícron através de um embrião vivo de ouriço roxo de oito células expressando GFP fundido ao domínio de ligação Rho rhotekin. Eles foram desconvolvidos do primeiro filme na galeria abaixo.

RhoA é ativo durante todo o sulco e desaparece quando o sulco é totalmente penetrado. A zona de atividade Rho corresponde superficialmente à zona de recrutamento de miosina e, uma vez que todo o recrutamento de miosina cortical é abolido nas células injetadas com C3, Rho está causalmente a montante da montagem do anel contrátil. Também descobrimos que a largura da zona Rho permanece aproximadamente constante ao longo do ingresso do sulco, mas escala linearmente com o diâmetro da célula. Para obter detalhes, consulte Bement, Benink e von Dassow (2005) JCB 170: 91-101. Os filmes aqui acompanham esse jornal.

Rho ativo em embrião de ouriço roxo. (George von Dassow e amp Bill Bement)

Rho ativo em embrião de ouriço verde. (George von Dassow e amp Bill Bement)

Rho ativo em embrião de rã. (George von Dassow e amp Bill Bement)

Formação de micrômeros em embrião de ouriço-do-mar verde. (George von Dassow e amp Bill Bement)

Formação do corpo polar em embrião de rã. (George von Dassow e amp Bill Bement)

Descobrimos, além disso, que a formação da zona de atividade RhoA equatorial é independente da montagem de actina, ou seja, não é consequência de sulcos. Além disso, notamos um fenômeno curioso em células tratadas com citocalasina. À medida que o córtex perde sua rigidez, delgadas invaginações tubulares da membrana plasmática invadem os pólos do fuso de uma forma dependente dos microtúbulos. Este "relâmpago" bizarro pode refletir uma remoção dependente de microtúbulos de Rho ativo do córtex, uma possibilidade que exploraremos no futuro.

A zona Rho forma-se na citocalasina. (George von Dassow e amp Bill Bement)

Rho "relâmpago" em citocalasina. (George von Dassow e amp Bill Bement)

Usando a manipulação física das células, mostramos que a zona Rho é formada pela proximidade do aparelho mitótico ao córtex e responde rapidamente às mudanças na posição da zona intermediária do fuso.

Eixo empurrado para o lado. (George von Dassow e amp Bill Bement)

Fuso empurrado ao longo de seu eixo. (George von Dassow e amp Bill Bement)

Corte do fuso em anáfase. (George von Dassow e amp Bill Bement)

Em suma, a sinalização Rho está no centro do mecanismo fisiológico pelo qual a geometria dos microtúbulos é acoplada à formação do anel contrátil ato-miosina. Especificamente, acreditamos, com base em sua função conhecida em outras células e em experimentos que estamos atualmente conduzindo, que a ativação de Rho no equador é baseada na entrega de reguladores Rho por microtúbulos astrais que o aumento da disponibilidade de Rho ativo leva ao recrutamento de miosina II e que o sulco é mantido ativamente durante a clivagem pela liberação de reguladores Rho, tanto positivos quanto negativos.

Regras para indução de sulco em embriões de C. elegans

Como mencionamos acima, a maioria dos experimentos clássicos que definem como o sulco se forma em resposta ao aparelho mitótico foi realizada em ovos de ouriço. A principal conclusão, decorrente principalmente do trabalho de Rappaport e Hiramoto, foi que a justaposição de duas matrizes de microtúbulos astrais é suficiente para induzir o sulco e que nem o fuso em si nem os cromossomos são essenciais para a formação do sulco. A demonstração mais conhecida dessa conclusão é a criação de Rappaport de um ovo toroidal de dólar de areia. Na primeira clivagem, a célula toroidal desenvolve um sulco completo em um lado, dividindo o aparato mitótico para produzir uma célula binucleada em forma de U. Na segunda clivagem, sulcos cruzam cada um dos dois fusos mitóticos, mas outro sulco "secundário" cruza os dois fusos, onde não há cromossomos ou fibras do fuso, dividindo assim a célula em forma de U em quatro.

Um zigoto dólar de areia toroidal conduzindo as duas primeiras divisões de clivagem, é uma repetição do famoso experimento de Rappaport. Linha superior: na primeira clivagem a célula faz um sulco cruzando o único fuso. Linha inferior: na segunda clivagem, a célula forma sulcos em ambos os fusos (painel esquerdo) e, em seguida, um sulco "secundário" se forma entre os dois fusos (painel do meio). Clique aqui para ver o filme (12,8 MB).

No entanto, não está claro até que ponto essas conclusões se aplicam a outras células. Muitos dos trabalhos recentes sobre organismos modelo geneticamente tratáveis ​​implicam proteínas associadas ao fuso central ou aos cromossomos na indução do sulco, na manutenção do sulco ou na citocinese. Além disso, em um teste direto para saber se as conclusões de Rappaport são gerais, Cao e Wang mostraram que em células de mamíferos cultivadas, o sulco se forma perto do fuso central, não no local onde os microtúbulos astrais estão justapostos, e eles concluíram que o fuso central é o locus de indução de sulco em células em cultura. No entanto, há fortes evidências em C. elegans embriões cujos microtúbulos astrais influenciam a posição do sulco, mesmo que o fuso central também desempenhe um papel importante.

Decidimos descobrir se C. elegans embriões na verdade se comportam da mesma forma que ovos de ouriço, usando experimentos diretamente análogos a várias das manipulações clássicas de ouriço. Ao perfurar zigotos ou uma das duas células, mostramos que sulcos se formam tanto onde os aster se sobrepõem quanto onde o fuso central se aproxima do córtex. No entanto, apenas os sulcos que cruzam o fuso central têm probabilidade de se completar.

Embrião de verme perfurado em DIC. (Jalal Baruni e amp George von Dassow)

Zigotos de verme perfurados com NMY-2 :: GFP. (Jalal Baruni e amp George von Dassow)

Célula AB de verme perfurada com NMY-2 :: GFP. (Jalal Baruni e amp George von Dassow)

Rappaport sulcos em um zigoto de verme. (Jalal Baruni e amp George von Dassow)

Também descobrimos que podíamos fundir células com um laser UV, criando assim células binucleadas. Em mais da metade dessas células, os dois núcleos migram juntos e um fuso tetrapolar se forma. Mas se os dois núcleos permanecem separados, eles desenvolvem dois fusos independentes que são orientados paralelamente um ao outro. Sulcos se formam não apenas entre esses fusos, mas também entre eles.

Fusão e clivagem celular com DIC. (George von Dassow e Jalal Baruni)

Células fundidas com tubulina GFP e miosina. (George von Dassow e Jalal Baruni)

Em seguida, descobrimos que poderíamos fazer células anucleadas, contendo centrossoma, separando um pólo do fuso na metáfase. As células anucleadas ocorrem quando o sulco não consegue passar entre os dois conjuntos de cromossomos irmãos após a anáfase. Invariavelmente, o centrossoma cortado em uma célula anucleada se duplica, incha quando a "célula" entra na fase M e os dois centrossomas filhos assumem posições opostas na célula, mesmo girando para a posição na linhagem posterior, como o fuso normalmente faria. Também invariavelmente, sulcos de penetração profunda aparecem entre os dois centrossomas nas células anucleadas. A maioria não é concluída, mas regride em torno do momento em que a abscisão normalmente ocorreria. As células anucleadas passam por várias rodadas de replicação do centrossoma e tentativa de clivagem.

A célula anucleada tenta se clivar. (George von Dassow e Jalal Baruni)

Anucleado AB com histona GFP e & gama-tubulina. (George von Dassow e Jalal Baruni)

Anucleado P1 com histona GFP e & gama-tubulina. (George von Dassow e Jalal Baruni)

Esses resultados são quase isomórficos aos resultados clássicos em ouriços-do-mar, exceto que nos vermes parece que os sulcos precisam cruzar o fuso central para se completar. Mas o que o fuso central tem a ver com a progressão do sulco? Observamos o comportamento de células perfuradas deficientes em Spd-1, sem as quais as células não possuem um fuso central. Ficamos surpresos ao descobrir que as células deficientes em Spd-1 parecem ser menos seletivas do que as células do tipo selvagem sobre as quais o sulco sobreviverá: sulcos induzidos por aster penetram mais profundamente e podem até mesmo se completar em células deficientes em Spd-1 perfuradas.

Nenhum fuso central nos zigotos depletados de Spd-1. (George von Dassow e Jalal Baruni)

Dois sulcos se completam no zigoto perfurado com deficiência de Spd-1. (Jalal Baruni e amp George von Dassow)

Célula AB perfurada com deficiência de Spd-1. (Jalal Baruni e amp George von Dassow)

Célula EMS perfurada, deficiente em Spd-1. (Jalal Baruni e amp George von Dassow)

Isso nos leva a sugerir que talvez o fuso central, como o maior grupo de microtúbulos antiparalelos agrupados, acumule algum fator que normalmente é necessário para a progressão do sulco (provavelmente o complexo do fuso central), e que sulcos que são direcionados ao fuso central têm acesso a esse tesouro, ao passo que os sulcos voltados para outros lugares não. Assim, com efeito, o fuso central "ratifica" os sulcos que são apontados corretamente. Este trabalho é descrito em Baruni, Munro e von Dassow (2008) J Cell Science 121: 306-16

Orientação do fuso e citocinese desigual na 4ª clivagem em ouriços

Na quarta clivagem, os embriões equinoides sofrem uma divisão altamente desigual nas células vegetais. As filhas das quatro células vegetais no embrião de oito células diferem em aproximadamente 30 vezes em volume, de modo que o embrião de 16 células consiste em oito células de pólo animal de tamanhos iguais (os mesômeros), quatro grandes macrômeros no vegetal metade do embrião e quatro minúsculos micrômeros no pólo vegetal. A clivagem desigual é baseada no posicionamento excêntrico do fuso mitótico e na estimulação subsequente de sulcos em torno de apenas um pequeno botão que se torna o micrômero.

Esquerda: embrião de ouriço verde de 16 células, pólo animal para cima e pólo vegetal para baixo Meio: seção confocal única de um embrião dólar de areia de 8 células iniciando a quarta clivagem, corado para tubulina (verde) e actina (vermelho). Direita: projeção de Z confocal -série através de um embrião de ouriço roxo de 8 células em metáfase, corado para tubulina (amarelo) e actina (azul), pólo animal para cima e pólo vegetal para baixo. Clique no painel direito para visualizá-lo como um filme 3D [QuickTime, 397 K].

Estamos interessados ​​neste processo porque apresenta uma oportunidade para investigar a orientação do fuso e as interações microtúbulo / córtex, e também porque o sulco assimétrico desafia a fácil exaplanação por relaxamento polar ou estimulação equatorial. Se o anel contrátil formado apenas como consequência do relaxamento do córtex pelos microtúbulos astrais, por que o aster associado ao futuro córtex do micrômero não estimularia o capeamento de actina e miosina cortical na extremidade oposta da célula? Em vez disso, o sulco se sobrepõe às pontas distais dos microtúbulos do áster vegetal. É igualmente difícil imaginar que o sulco exige que os microtúbulos dos ásteres adjacentes se encontrem no equador, porque o outro pólo do fuso está localizado quase no centro da célula, e os microtúbulos astrais desse pólo mal alcançam o córtex em qualquer lugar até a telófase.

Outros "experimentos naturais" em citocinese

A embriologia de invertebrados oferece uma grande variedade de variações sobre o tema da citocinese. Estamos interessados ​​em explorar alguns desses experimentos naturais para descobrir como as células adaptam o mecanismo de clivagem a diferentes tarefas e propriedades celulares. Alguns dos fenômenos mais interessantes são a quarta clivagem desigual em ouriços (discutida acima), clivagem unilateral em águas-vivas, formação de lobo polar em alguns moluscos e anelídeos, bem como sulcos de pseudoclivagem em embriões de insetos. Embora o último processo seja familiar e bem estudado, para muitos desses casos houve muito pouco trabalho descritivo básico sobre a configuração do citoesqueleto durante a clivagem: por exemplo, em embriões de água-viva que se clivam de um lado da célula apenas, é o anel contrátil está completo? E em caso afirmativo, por que a superfície da célula não se sulca de um lado, há algo no caminho? Ou, se o anel não estiver completo, como ele dirige o sulco? Alguém deveria dar uma olhada.

Esquerda: a água-viva Aequorea na metade da primeira clivagem. Meio: o escafópode Pulsellum no estágio "trifólio". Direita: a vespa Nasonia no estágio de blastoderme sincicial. Veja um filme de lapso de tempo mostrando a clivagem inicial em uma variedade de embriões diferentes [QuickTime, 28,5 MB].


Regulação da dinâmica do citoesqueleto de actina por GTPases da família Arf

As pequenas GTPases da família Arf são mais conhecidas por seu papel no transporte vesicular, em que nucleam a montagem de proteínas de revestimento em locais de formação de vesículas transportadoras. No entanto, evidências acumuladas indicam que os Arfs também são reguladores importantes da dinâmica do citoesqueleto de actina e estão envolvidos em uma variedade de processos baseados em actina, incluindo adesão celular, migração e crescimento de neuritos. Os mecanismos dessa regulação são notavelmente diversos, variando da integração do transporte vesicular com a montagem do citoesqueleto até a regulação direta da função GTPase da família Rho. Aqui, revisamos o progresso recente em nossa compreensão de como Arfs e suas proteínas de interação funcionam para integrar a dinâmica da membrana e do citoesqueleto.

Figuras

Regulamentação da montagem de actina por ...

Regulamento de montagem de actina por Arf1. (uma) Arf1 atua tanto a montante como a jusante ...

Indução de lamelipódios por ativação ...

Indução de lamelipódios por ativação de Arf na periferia celular. Células MDCK…

Modelos para a regulamentação de ...

Modelos para a regulação da atividade Rac por Arf6. (uma) Recrutamento do GEF. O…


MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais

Todos os materiais para cultura de células foram obtidos da Life Technologies (Gaithersburg, MD), com exceção do soro fetal de vitela, que foi obtido da Atlanta Biologicals (Norcross, GA). Salvo indicação em contrário, todos os outros produtos químicos foram obtidos da Sigma (St. Louis, MO).

Ensaios de cultura celular e crescimento celular

PtK2 e células LLCPK-1α foram cultivadas em meio essencial mínimo suplementado com piruvato de sódio 1 mM, soro fetal de vitela a 10% e antibióticos, em uma atmosfera de 5% de CO2, a 37 ° C. Para observação, as células foram semeadas em lamínulas gravadas (Bellco Glass, Vineland, NJ) 1–2 d antes do uso. Para determinar o índice mitótico, as células foram semeadas em lamelas, fixadas em metanol e coradas com anticorpos anti-tubulina (DM1-a Sigma) e células de iodeto de propídio (0,5 μm) em prometáfase até anáfase tardia foram contadas a partir de campos selecionados aleatoriamente, pelo menos 200 células foram contadas para cada experiência. Para determinar o tempo de proliferação, as células foram plaqueadas em placas de múltiplos poços em baixa densidade e deixadas crescer por 1 a 2 dias antes que uma contagem inicial de células fosse feita. Contagens subsequentes de poços em triplicado foram feitas em vários intervalos após a contagem inicial.

Microinjeção

As células foram microinjetadas com tubulina fluorescente exatamente como descrito anteriormente (Yvon e Wadsworth, 1997). Para injeção de DNA de plasmídeo, a microinjeção foi realizada no citoplasma ou no núcleo (Wadsworth, 1998). O DNA do plasmídeo foi purificado usando um kit QIAfilter Plasmid Maxi (Qiagen, Valencia, CA), ressuspenso em água destilada desionizada e injetado em uma concentração de 250-750 μg / ml.

Immunoblotting

Extratos celulares de células parentais e transfectadas foram preparados colhendo células, lavando em solução salina tamponada com fosfato e lisando as células em um tampão que consiste em: 0,5% de NP-40 em HEPES 50 mM, pH 7,5 com Pefablock, aprotinina e protease de leupeptina inibidores. O lisado celular foi centrifugado a 14.000 rpm durante 30 min e o sobrenadante foi recuperado, fervido em tampão de amostra SDS e executado num gel de poliacrilamida a 10%. Todas as soluções de gel estavam de acordo com as formulações de Laemmli (1970).As proteínas foram transferidas para membrana de difluoreto de polivinilideno (Hybond-P Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), usando uma célula de transferência eletroforética Mini-transblot, bloqueada por 1 h em 5% de leite em pó desnatado e corada com um anticorpo para tubulina ( clone DM1a Sigma) a uma diluição de 1: 2000 durante 1 h a 37 ° C. O blot foi lavado com solução salina tamponada com Tris-Tween (Tris 25 mM, pH 7,6 NaCl 137 mM 3 mM KCl 0,01% Tween) e incubado com um anticorpo secundário marcado com fosfatase alcalina, diluído 1: 10.000 por 1 h à temperatura ambiente, com agitação. A membrana foi lavada novamente e incubada com reagente ECF (Amersham Pharmacia Biotech) e digitalizada usando um Storm Phosphorimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

Microscopia de baixo nível de luz e aquisição de imagens

Para a análise da dinâmica dos microtúbulos em células em interfase, foi utilizado um microscópio invertido Nikon Eclipse TE 300 equipado com uma lente objetiva de abertura numérica de 100 × 1,3. As imagens foram adquiridas usando uma câmera de dispositivo acoplado a carga refrigerada por transferência interlinha Micromax (Roper Scientific, Trenton, NJ) e software Metamorph (Universal Imaging, Brandywine, PA). A exposição à epiiluminação era controlada por um obturador eletrônico (Ludl Electrical Products, Hawthorne, NY), também acionado pela Metamorph. Cubos de filtro padrão G-1B e B-2E / C foram usados ​​para aquisição dos sinais de rodamina e GFP, respectivamente. Para a imagem, as células cultivadas em lamínulas foram colocadas em câmaras Rose (Rose et al., 1958) em não-CO2 DMEM sem corante indicador e contendo 0,3 U / ml de sistema de eliminação de oxigênio Oxyrase (EC Oxyrase Oxyrase, Mansfield, OH). As sequências de lapso de tempo foram coletadas em intervalos de 2 s usando um tempo de exposição de 0,3-0,7 s por 2 min. Sob essas condições de imagem, pouco ou nenhum fotodegradação ou fotodano foi observado, mesmo quando a oxirase foi omitida da mídia. No entanto, a oxirase foi rotineiramente incluída como medida de precaução para limitar qualquer fotobranqueamento ou fotodano que pudesse ocorrer. Para examinar o comportamento dos microtúbulos em células mitóticas, foram utilizadas microscopia de fluorescência de campo amplo, como descrito anteriormente, e microscopia de fluorescência confocal. Seqüências adquiridas usando microscopia de fluorescência de campo amplo foram usadas para rastrear as extremidades dos microtúbulos porque todas essas imagens foram adquiridas em intervalos de 2 se a 35–37 ° C. A microscopia confocal foi realizada usando um CSU-10, unidade de varredura confocal de visão direta e varredura de disco (Perkin Elmer-Cetus Scientific, Gaithersburg, MD) conectada ao Eclipse Nikon entre a porta lateral e a câmera. Alternativamente, o CSU-10 foi usado com um microscópio Leica equipado com uma lente objetiva de 100 × e uma câmera de dispositivo de carga acoplada Orca 1 (Hammamatsu, Hammamatsu City, Japão). Finalmente, algumas observações foram feitas usando uma cabeça de varredura confocal Bio-Rad 600 acoplada a uma Nikon Optiphot. As imagens foram adquiridas com uma lente objetiva 60 × 1,3NA, com o orifício definido em 1/3 das médias abertas de Kalman, ou uma varredura única e lenta , foram coletados.

Rastreamento de microtúbulos

O comportamento dos microtúbulos individuais foi determinado rastreando a posição da extremidade do microtúbulo usando a função “pontos de rastreamento” do Metamorph, vinculado a uma planilha do Excel. Um gráfico da história de vida de cada microtúbulo foi gerado usando o Excel, e as fases de crescimento, encurtamento e pausa foram determinadas a olho nu conforme descrito anteriormente (Dhamodharan et al., 1995). Apenas mudanças & gt0,5 μm foram consideradas eventos de crescimento ou encurtamento. A duração, distância e velocidade dos eventos de crescimento e encurtamento foram determinados para as fases selecionadas usando o Excel. A frequência da catástrofe foi determinada dividindo a soma do número de transições de crescimento para encurtamento e pausa para encurtamento pela soma da duração de crescimento e pausa. A frequência do resgate foi determinada dividindo-se a soma do número de transições do encurtamento para o crescimento e do encurtamento para a pausa pelo tempo gasto no encurtamento. A dinâmica foi calculada dividindo a soma do comprimento total crescido e encurtado pelo tempo de vida do microtúbulo. Para células LLCPK-1α, todos os parâmetros foram determinados para cada microtúbulo, com exceção da porcentagem de tempo em uma fase, que foi determinada para a população de microtúbulos. Para PtK transitoriamente transfectado2 células, todos os parâmetros foram determinados para cada microtúbulo, com exceção das frequências de catástrofe e resgate e porcentagem de tempo em uma fase, que foram determinados para a população de microtúbulos. A análise estatística foi realizada com o MINITAB para Windows (versão 12).

Transfecção

Para a transfecção, as células foram plaqueadas em lamínulas, deixadas crescer até ∼60% de confluência e transfectadas usando Lipofectamine (Life Technologies), de acordo com as especificações do fabricante. O plasmídeo GFP-α-tubulina foi obtido de Clontech (Palo Alto, CA). Para gerar linhas celulares estáveis, as células transfectadas foram selecionadas com geneticina (G418) e as colônias fluorescentes foram isoladas usando anéis de clonagem (Bellco Glass). Para medição da dinâmica de microtúbulos em PtK transfectado transitoriamente2 células, as células foram observadas 24-48 h após a transfecção. As células com arranjos de microtúbulos que pareciam morfologicamente normais e não continham feixes de microtúbulos ou outras estruturas fluorescentes foram usadas para análise da dinâmica dos microtúbulos.


Conferências e Encontros de Biologia

Como uma conferência anual realizada com sucesso em Pequim, Xangai, Qingdao, Hangzhou, Macau e online nos últimos 6 anos, a 7ª Conferência Internacional sobre Ciências Agrárias e Biológicas (ABS 2021) será uma plataforma valiosa e importante para inspirar o intercâmbio internacional e interdisciplinar na vanguarda das ciências agrícolas e biológicas. A série de discursos plenários, apresentações orais e em pôsteres, workshops, discussões e eventos de networking manterão os participantes engajados em aprender e fazer novas conexões no ABS 2021.

Considerando a situação atual do COVID-19, um modo híbrido de apresentações online e no local será conduzido para o ABS 2021. Para participantes que não podem participar fisicamente, apresentações online via Microsoft TEAMS estarão disponíveis e serão bem-vindas.

O ABS 2021 reunirá acadêmicos, cientistas, engenheiros e tecnólogos etc. de todo o mundo, e esperamos que você aproveite esta oportunidade para se juntar a nós para um intercâmbio acadêmico.

As submissões de trabalhos de pesquisa originais e resumos para o programa principal e o consórcio de doutorado em todas as áreas de ABS em aspectos agrícolas, biológicos, alimentares e ambientais incluem, mas não se limitam a:

Ciências Animais e Plantas Ciência do Solo e Meio Ambiente Outros campos em Ciências Agrárias


Dinâmica da actina em células vivas de mamíferos

O citoesqueleto de actina mantém a arquitetura celular e medeia os movimentos celulares. Para explorar a dinâmica do citoesqueleto da actina, a proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP) foi fundida à β-actina humana. A proteína de fusão foi incorporada em fibras de actina que se tornaram despolimerizadas após o tratamento com citocalasina B. Este construto EGFP-actina funcional permitiu a observação do citoesqueleto de actina em células vivas por microscopia de fluorescência de lapso de tempo. A expressão estável da construção foi obtida em linhas de células de mamíferos de diferentes origens de tecido. Em células estacionárias, foram observadas "nuvens de actina" ricas em actina, estruturadas em forma de anel, além de fibras de estresse. Essas estruturas semelhantes a babados estão envolvidas na reorganização do citoesqueleto de actina. Em células migratórias, EGFP-actina foi encontrada no avanço do lamelipódio. Manchas imóveis de actina desenvolvidas nas fibras lamelipódicas e finas de actina formadas paralelamente ao bordo de ataque. Assim, EGFP-actina expressa em células vivas, estruturas reveladas envolvidas na dinâmica do citoesqueleto de actina.


Um circuito co-regulador Cas-BCAR3 controla a dinâmica dos lamelipódios

Os complexos de adesão da integrina regulam a dinâmica do citoesqueleto durante a migração celular. A adesão ativa a fosforilação de proteínas de sinalização associadas à integrina, incluindo Cas (p130Cas, BCAR1), por quinases da família Src. Cas regula a protusão e migração de ponta em cooperação com seu parceiro de ligação, BCAR3. No entanto, não está claro como Cas e BCAR3 cooperam. Aqui, usando células epiteliais normais, descobrimos que a localização de BCAR3 para aderências de integrina requer Cas. Em contrapartida, a fosforilação de Cas, bem como a dinâmica dos lamelipódios e a migração celular, requer BCAR3. Essas funções requerem o domínio BCAR3 SH2 e um local de fosforilação específico, Tyr 117, que também é necessário para a regulação negativa de BCAR3 pelo sistema ubiquitina-proteassoma. Essas descobertas colocam BCAR3 em um circuito de feedback positivo co-regulador com Cas, com BCAR3 exigindo Cas para localização e Cas exigindo BCAR3 para ativação e sinalização a jusante. O uso de um único local de fosforilação em BCAR3 para ativação e degradação garante feedback negativo confiável pelo sistema ubiquitina-proteassoma.


Thapsigargin induz apoptose por prejudicar a dinâmica do citoesqueleto em células de adenocarcinoma de pulmão humano

O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da tapsigargina na apoptose, na dinâmica do citoesqueleto da actina e nas proteínas do citoesqueleto da actina em células de adenocarcinoma de pulmão humano. Thapsigargin é um inibidor irreversível específico de ER cálcio-ATPase, que pode promover estresse ER por depleção dos estoques de cálcio luminal e mostrar potencial para induzir a morte celular. Os efeitos da tapsigargina na apoptose em células A549 foram avaliados por coloração Hoechst. Além disso, a coloração com F-actina por rodamina-faloidina e anticorpo RhoA para organizações do citoesqueleto foi aplicada a células A549. Para confirmar o comprometimento da dinâmica do citoesqueleto tratado com tapsigargina, western blots foram aplicados para analisar os níveis de proteína de p-Cofilin-1 (Ser3), Cofilin-1 e pPaxilina (Tyr118), bem como RhoA e pS6 (S240 / 244 ) Os resultados sugerem que a tapsigargina pode induzir a morte celular em células A549 de maneira dependente do tempo e da dose. As fibras de F-actina e os sinais de RhoA também são reduzidos de maneira dependente do tempo e da dose pelo tratamento com tapsigargina. As formas de fosforilação de Cofilin-1 e paxilina são atenuadas em 1 µTratamento com M thapsigargin por 24 h. Essas alternâncias podem ser causadas pela inibição das atividades de mTORC1 (indicada por pS6 (Ser240 / 244)) e das vias RhoA após o tratamento com tapsigargina. As presentes descobertas destacam papéis importantes da entrada de cálcio na organização do citoesqueleto e apoptose em células de adenocarcinoma de pulmão humano e ajudarão a estabelecer um estágio para o tratamento clínico de metástases de células cancerosas.

1. Introdução

O citoesqueleto é necessário para muitos processos biológicos, como morfogênese embrionária, vigilância imunológica, reparo de tecidos e regeneração. A regulação aberrante da dinâmica do citoesqueleto conduz a progressão da invasão do câncer e metástase [1, 2]. A metástase de células cancerosas é um processo de múltiplos estágios que envolve invasão no tecido circundante, intravasamento, trânsito no sangue ou linfa, extravasamento e crescimento em um novo local. Muitas dessas etapas requerem motilidade celular, que é impulsionada por ciclos de polimerização e despolimerização de actina [3]. As redes de actina consistem em filamentos ramificados ou lineares e regulam muitos processos celulares essenciais. O citoesqueleto de actina atua na geração e manutenção da morfologia e polaridade celular e na endocitose, tráfego intracelular, contratilidade, motilidade e divisão celular. A montagem e desmontagem dos filamentos de actina, bem como suas organizações em redes funcionais de ordem superior, são regulados por várias proteínas de ligação à actina, muitas das quais são conservadas de levedura ao ser humano [4, 5].

As células cancerosas malignas utilizam sua capacidade migratória intrínseca para invadir tecidos adjacentes e a vasculatura e, finalmente, metastatizar. A motilidade das células tumorais é impulsionada pela polimerização de monômeros de actina em filamentos polarizados. Esses filamentos, denominados F-actina, estão em um estado de fluxo constante com novos monômeros sendo adicionados [6, 7]. Uma das proteínas identificadas na formação da F-actina é a Cofilina-1. A cofilina-1 é um fator de despolimerização da actina e regula a reorganização do citoesqueleto da actina. A fosforilação da Cofilina-1 na Serina-3 é conhecida por bloquear essas atividades, que são reguladas por RhoA GTPases através das vias mTORC1-RhoA-Limk-Cofilin-1 [8, 9]. Os resultados anteriores foram associados ao influxo de cálcio intracelular e à dinâmica do citoesqueleto em vitro e na Vivo. Por exemplo, o influxo de cálcio nos sinaptossomas do cérebro de rato causa a degradação da F-actina sob a membrana plasmática [10-12]. E a inibição da polimerização da actina tem um efeito bifásico dependente do tempo na entrada do cálcio, mostrando uma potenciação inicial seguida pela inibição da entrada do cálcio [13]. Além disso, a tapsigargina, um inibidor irreversível específico da ER cálcio-ATPase, tem sido usada para investigar o efeito de um distúrbio na homeostase do cálcio do retículo endoplasmático (ER) em diferentes processos celulares, incluindo a dinâmica do citoesqueleto. É interessante que a depleção induzida pela tapsigargina dos estoques de cálcio do RE inibe severamente o conteúdo de F-actina em células monocíticas humanas [14]. Assim, a tapsigargina pode ser uma ferramenta útil para investigar o influxo de cálcio e a dinâmica do citoesqueleto subjacente à apoptose celular.

Embora tenha havido progresso, ainda é amplamente desconhecido se o influxo de cálcio se acopla à dinâmica do citoesqueleto e afeta a apoptose celular, especialmente em células cancerosas. Para examinar o papel crítico entre a sinalização de cálcio, citoesqueleto e apoptose celular, nos concentramos no efeito da entrada ectópica do influxo de cálcio pela tapsigargina na apoptose do citoesqueleto de actina em linhas de células de adenocarcinoma de pulmão humano A549. Nossos achados demonstram que o tratamento com thapsigargina pode induzir a morte celular em células A549 de maneira dependente do tempo e da dose. Para a entrada ectópica do influxo de cálcio sendo induzida por thapsigargin, descobrimos que a dinâmica do citoesqueleto é prejudicada pelo tratamento com thapsigargin, indicado por coloração com F-actina e evidências bioquímicas. Os efeitos da tapsigargina na morte celular em células tumorais A549 podem ser mediados pela via mTORC1-RhoA-Cofilin-1, porque o tratamento com tapsigargina pode inibir dramaticamente a atividade de mTORC1 e o nível de proteína RhoA. Nosso trabalho ajudará a entender uma nova pista sobre a relação entre a sinalização de cálcio, citoesqueleto e apoptose celular em células tumorais A549.

2. Materiais e métodos

2.1. Produtos Químicos e Materiais

O inibidor de Tapsigargina ER cálcio-ATPase foi adquirido da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Meio essencial modificado de Dulbecco (DMEM), soro bovino fetal (FBS) e sondas de actina-F de rodamina Phalloidin R415 foram adquiridos da Gibco Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, EUA). O kit Hoechst era da Beyotime Biotechnology Co. (Haimen, Jiangsu, China). Os seguintes anticorpos, anti-p-Cofilin-1, anti-Cofilin-1 e anti-RhoA foram da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Os anticorpos p-Paxillin (Tyr118) e pS6 (Ser240 / 244) eram da Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA) e o anti-GAPDH era da Millipore (Billerica, MA, EUA). Outros produtos químicos eram da mais alta pureza disponível.

2.2. Ensaios de cultura celular

Uma linha de células de adenocarcinoma de pulmão humano A549 amplamente utilizada foi escolhida como em vitro sistema de experimentos, que foi obtido do Instituto de Biologia Celular de Xangai (introduzido da American Type Culture Collection). As células A549 foram derivadas de um adenocarcinoma de pulmão e amplamente utilizadas para estudar o processo de amplificação em tumores. No presente estudo, as células A549 foram semeadas em placas de 6 poços em

células / mL. As células foram incubadas em meio essencial modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) mais antibióticos por 24 h em 5% de CO2 a 37 ° C.

2.3. Manipulações Farmacológicas

Para o influxo de cálcio ectópico em células A549, as concentrações finais (1, 100 e 1000 nM) de tapsigargina foram aplicadas a essas células e, em seguida, incubadas de 6 h a 24 h. Nenhum aditivo foi usado como controle interno. Após a cultura, as células foram colhidas para colorações e imunomarcações Hoechst subsequentes. Para estudar mais a fundo o papel da tapsigargina nas moléculas do citoesqueleto em células A549, a tapsigargina de 1 µM por 6 h foi aplicado a células A549 para exames bioquímicos.

2.4. Ensaio de coloração Hoechst

Para a preparação da coloração Hoechst, as células A549 foram plaqueadas com

células / mL em placas de 6 poços. Após manipulações farmacológicas, as células foram coradas diretamente com o kit Hoechst da Beyotime. A contagem de células foi realizada por meio do software ImageJ do National Institutes of Health, que está disponível em http://rsbweb.nih.gov.

2,5. Ensaio de coloração e imunocoloração de F-Actina

Para detectar as fibras de F-actina em células A549 tratadas com thapsigargina, as sondas de Rodamina Phalloidina R415 foram aplicadas para corar as fibras de F-actina. Para a preparação da coloração com Rodamina-Faloidina, células A549 foram semeadas com 1,0 × 10 5 células / mL em placas de 6 poços. Após o tratamento com thapsigargina em diferentes concentrações de 6 h a 24 h, as células foram fixadas com 4% de Paraformaldeído (PFA) e 4% de sacarose em solução salina tamponada com fosfato por 30 min e depois permeabilizadas com 0,25% de Triton-X 100 em PBS por outro 5 min à temperatura ambiente. O anticorpo anti-RhoA foi usado para detectar sinais RhoA nessas células. Após lavagem extensiva, sondas de Rodamina Phalloidina R415 foram adicionadas a essas células, bem como anticorpos-Alexa Fluor 594 de cabra anti-IgG de camundongo (Invitrogen, Carlsbad, CA). Em seguida, após uma segunda lavagem por três vezes, as lamínulas foram montadas em lâminas de vidro com reagente antifade com 4 ′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para etiquetagem nuclear.

2.6. Ensaio de Western Blots

Para extrair proteínas, células A549 cultivadas foram sonicadas com tampão de lise (PBS com 1% Triton X-100 e inibidores de protease). Os sobrenadantes do lisado celular foram colhidos por centrifugação a 10000 rpm durante 10 min a 4 ° C. As concentrações de proteína dos sobrenadantes celulares foram avaliadas e medidas pelo kit BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, EUA). Quantidades iguais das proteínas de cada extrato foram separadas em um gel de SDS-poliacrilamida (12,6%) com 5% de gel de empilhamento em tampão de corrida SDS-Tris-glicina. As proteínas foram então transferidas eletroforeticamente usando uma membrana de PVDF por procedimentos padrão. As membranas foram então bloqueadas por 5% de leite em pó desnatado em PBST (PBS com 0,1% de Tween 20, pH 7,6) por 1 h em temperatura ambiente e sondadas durante a noite por anticorpos primários adequados diluídos em PBST a 4 ° C.As membranas foram enxaguadas 3 vezes com PBST e incubadas com anticorpos secundários adequados diluídos em PBST durante 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, as membranas foram lavadas mais 3 vezes com PBST em temperatura ambiente por 10 min, e as proteínas foram detectadas pelo reagente de desenvolvimento de quimioluminescência aprimorada Super Signal (ECL) (Thermo Scientific Pierce) e expostas a filmes (Kodak). A quantificação do nível de proteína foi realizada por ImageJ.

2.7. Análise Estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas pelo software Image. Os dados quantitativos foram mostrados em

-testes para comparações. Os valores 0,05 (*), 0,01 (**) e 0,001 (***) foram assumidos como nível de significância para os testes estatísticos realizados.

3. Resultados

3.1. Thapsigargin induz apoptose celular em células A549

Para examinar se o tratamento com tapsigargina pode induzir a morte celular em células A549, aplicamos a coloração Hoechst em células A549 tratadas com tapsigargina (Figura 1). Os resultados mostram que a tapsigargina tem efeitos leves na morte celular na concentração final de 1 nM (morte celular em 5,2%) ou 100 nM (em 7,4%) para 6 h de tratamento (Figura 1 (b)). A porcentagem de morte celular aumenta significativamente para 24,1% na concentração de 1 µM (Figura 1 (b)). Para examinar se os efeitos da tapsigargina na morte celular das células A549 são dependentes do tempo ou não, prolongamos o tempo de tratamento da tapsigargina nas células A549 para 24 horas. Nossos resultados sugerem que as porcentagens de morte celular aumentam para 9,4% (1 nM), 25,8% (100 nM) e 41,2% (1 µM) após o tratamento com tapsigargina (Figura 1 (b)). Esses achados apóiam a noção de que a tapsigargina pode induzir a morte celular em células A549 de maneira dependente do tempo e da dose.


(uma)
(b)
(uma)
(b) Thapsigargin induz apoptose celular em células A549. (a) Coloração Hoechst (azul) mostrando o aumento de células A549 apoptóticas por tapsigargina (1 nM, 100 nM e 1 µM) tratamento por 6 e 24 h (setas brancas). (b) Histogramas mostrando a quantificação da morte celular (%) em células A549 após o tratamento com tapsigargina. Os resultados são médias de três experimentos independentes. Os dados representam a média ± SEM. *
3.2. A thapsigargina prejudica as organizações do citoesqueleto de actina em células A549

Para estudar os mecanismos celulares de como a tapsigargina induz a morte celular em células A549, focamos na dinâmica do citoesqueleto, porque notamos que as células A549 tendem a encolher após o tratamento com tapsigargina (dados não mostrados). Assim, realizamos a coloração com F-actina por sondas de Faloidina marcadas com Rodamina em células A549. Sendo consistentes com as colorações de Hoechst, nossos resultados mostram que as fibras de F-actina são reduzidas de maneira dependente do tempo e da dose após o tratamento com tapsigargina (Figura 2). Além disso, os sinais RhoA, indicados pela fluorescência da ganância, também são reduzidos após o tratamento com tapsigargina, em paralelo com os sinais da rodamina-faloidina, enquanto os sinais DAPI marcados em azul indicam as localizações nucleares (Figura 2). A redução paralela dos sinais de F-actina e RhoA pelo tratamento com tapsigargina confirma que a tapsigargina pode prejudicar a dinâmica e as organizações do citoesqueleto.


Thapsigargin prejudica as organizações do citoesqueleto de actina em células A549. As reduções das fibras de F-actina pela tapsigargina (1 nM, 100 nM e 1 µM por 6 e 24 h) os tratamentos foram mostrados por imunocoloração. A fluorescência vermelha é indicada por sondas de rodamina-faloidina, verde por anticorpo RhoA e azul por DAPI.
3.3. A thapsigargina interrompe as proteínas do citoesqueleto de actina em células A549

Para confirmar o comprometimento da dinâmica do citoesqueleto em células A549 tratadas com thapsigargina, examinamos as vias celulares que regulam as organizações de F-actina. Por western blots, mostramos que as fosforilações de Cofilin-1 são reduzidas após o tratamento com tapsigargina, enquanto os níveis de proteína total de Cofilin-1 não são alterados (Figura 3 (a)). A proporção de p-Cofilin-1 para Cofilin-1 reduz para 67,4% após o tratamento com tapsigargina de 1 µM por 6 h, e para 40,9% após 1 µM por 24 h (Figura 3 (b)). De forma consistente, a fosforilação da paxilina também é reduzida para 33,9% após 1 µTratamento com M thapsigargin por 24 h (Figuras 3 (a) e 3 (b)). É de notar que o nível de proteína de p-Paxilina não é alterado com diferença estatística após 1 µTratamento com M thapsigargin por 6 h (Figuras 3 (a) e 3 (b)). Isso pode ser devido ao efeito retardador da tapsigargina nas moléculas reguladoras do citoesqueleto. Tomados em conjunto, nossos resultados sugerem que o tratamento com thapsigargina pode prejudicar o equilíbrio da dinâmica do citoesqueleto, despolimerizando as fibras de actina e inibindo as reorganizações da actina.


(uma)
(b)
(uma)
(b) A thapsigargina interrompe as proteínas do citoesqueleto de actina em células A549. As reduções dos níveis de proteína de p-Cofilin-1 (Ser3) e p-Paxilina (Tyr118) pelo tratamento com tapsigargina (1 µM por 6 e 24 h) em células A549 foram mostrados por Western blots (a) e histogramas (b). Notas mostraram que o nível de proteína de Cofilin-1 total não é afetado pelo tratamento com thapsigargina. Os resultados são médias de quatro experimentos independentes. Os dados representam a média ± SEM. **
3.4. A thapsigargina prejudica a dinâmica do citoesqueleto por meio das vias mTOR-RhoA em células A549

Para estudar o mecanismo molecular do efeito da tapsigargina na dinâmica do citoesqueleto, os níveis de proteína dos indicadores mTORC1 e do fator RhoA a jusante foram examinados. Nossos resultados revelam que os níveis de proteína de pS6 (Ser240 / 244), um indicador bem conhecido da atividade de mTORC1, são reduzidos para 61,1% (1 µM por 6 h) e não detectável (1 µM por 24 h) após o tratamento com thapsigargina (Figuras 4 (a) e 4 (b)). Posteriormente, os níveis de proteína de RhoA, um regulador chave da dinâmica do citoesqueleto de actina, também são reduzidos para 52,9% (1 µM por 6 h) e 17,7% (1 µM por 24 h) após o tratamento com thapsigargina (Figuras 4 (a) e 4 (b)). A redução dos níveis de proteína RhoA é consistente com a redução anterior dos sinais de imunocoloração de RhoA após o tratamento com tapsigargina (Figura 2). Esses resultados indicaram que a tapsigargina pode prejudicar a dinâmica do citoesqueleto por meio das vias mTOR-RhoA em células A549.


(uma)
(b)
(c)
(uma)
(b)
(c) Thapsigargin prejudica a dinâmica do citoesqueleto através da Vias mTOR-RhoA em células A549. As mudanças nos níveis de proteína de RhoA e pS6 (S240 / 244) pelo tratamento com tapsigargina (1 µM por 6 e 24 h) em células A549 foram mostrados por Western blots (a) e histogramas (b). Os resultados são médias de quatro experimentos independentes. Os dados representam a média ± SEM. **

4. Discussão

A progressão do câncer é um processo de várias etapas que permite que as células tumorais se dispersem para pontos distantes de uma determinada massa tumoral primária, e isso geralmente leva à metástase. O movimento celular através do tecido, portanto, desempenha um papel crucial e primário na progressão do câncer. Este processo requer uma série de eventos biológicos distintos, mas combinados, nos quais o citoesqueleto de actina desempenha papéis essenciais [5, 15]. Em décadas, nossa compreensão das moléculas envolvidas na regulação da dinâmica do citoesqueleto da actina aumentou. Foi relatado que a thapsigargina induz a morte celular em várias linhagens de células tumorais, seja por meio do aumento da entrada de cálcio mediada pelo armazenamento ou do estresse no RE [16–18]. Foi relatado que o tratamento com thapsigargina rapidamente induz um aumento sustentado na concentração de cálcio e fragmentação de DNA e induz a morte celular alterando a morfologia celular ou ativando vias apoptóticas [14, 19]. No presente estudo, demonstramos que a tapsigargina, um inibidor irreversível específico do ER cálcio-ATPase, induz a morte celular ao prejudicar a dinâmica do citoesqueleto e as organizações de actina na linha de células A549 de adenocarcinoma de pulmão humano. Este processo pode ser mediado pelas vias mTOR-RhoA-Cofilina-1, porque o tratamento com tapsigargina pode inibir dramaticamente a atividade de mTORC1 e reduzir as proteínas RhoA e atenuar as fosforilações da Cofilina-1 (Figura 4 (c)). mTOR é um controlador central de proliferação, crescimento e sobrevivência celular e funciona em células pelo menos como dois complexos, mTORC1 e mTORC2. Foi relatado que as vias mTOR regulam a migração de células tumorais e metástases de câncer. Por exemplo, a rapamicina suprime a reorganização e migração de F-actina estimulada por IGF-1 em várias linhas de células tumorais por meio da inibição da atividade de mTORC1. A rapamicina também pode inibir a reorganização da F-actina e a motilidade celular pela regulação negativa da expressão e atividade da proteína RhoA [20, 21]. Nossos resultados destacam um papel importante da entrada de cálcio na organização do citoesqueleto e apoptose e definem um estágio para o tratamento clínico da metástase de células tumorais.

O citoesqueleto de actina atua na geração e manutenção da morfologia e polaridade celular, na endocitose e no tráfego intracelular, na contratilidade, na motilidade e na divisão celular. A montagem e desmontagem dos filamentos de actina, bem como sua organização em redes funcionais de ordem superior, são reguladas por várias sinalizações extracelulares e intracelulares [8, 22]. A thapsigargina ativa a entrada de cálcio após a depleção dos estoques de cálcio intracelular e acopla-se às organizações do citoesqueleto. Por exemplo, foi relatado que a tapsigargina induz a despolimerização da actina e produz uma diminuição líquida no conteúdo de F-actina em células monocíticas humanas. Por sua vez, o tratamento prolongado com inibidores da polimerização da actina elimina a entrada de cálcio em 50% nas plaquetas humanas [14]. Assim, o acoplamento da sinalização do cálcio e da dinâmica do citoesqueleto da actina precisa ser mais consolidado. Nossos achados revelam que a abertura ectópica do influxo de cálcio pela tapsigargina pode interromper as organizações dos citoesqueletos de actina, o que pode ajudar a entender a relação da sinalização do cálcio e a dinâmica do citoesqueleto.

Está bem estabelecido que o aumento da F-actina pode promover a longevidade celular, enquanto a diminuição do turnover da actina parece desencadear a morte celular [7]. A proteína reguladora da actina Cofilina-1 demonstrou ter um papel fundamental no processo apoptótico. Cofilin-1 é um membro da família Cofilin-1 / ADF (fator de despolimerização de actina) e regula a dinâmica da actina promovendo a despolimerização e separação dos filamentos de actina e regulando a reciclagem dos monômeros resultantes. Foi demonstrado que a forma ativa (desfosforilada) da Cofilin-1 é direcionada para a mitocôndria após o início da apoptose. O direcionamento mitocondrial de Cofilin-1 é suficiente para induzir o vazamento de citocromo C da mitocôndria e a apoptose fortemente induzida [23]. Além disso, a paxilina, uma proteína de múltiplos domínios, é um dos principais componentes da reorganização do citoesqueleto mediada por integrina. Em células tumorais, a paxilina é altamente fosforilada em Tyr118 e recruta outras moléculas de sinalização para aderências focais para metástases tumorais [7, 24]. No presente estudo, nossos achados sugeriram que o tratamento com thapsigargina pode reduzir drasticamente a fosforilação da Cofilina-1 e aumentar sua atividade (Figuras 3 (a) e 3 (b)), o que contribui para a despolimerização da actina e início da apoptose. Para esclarecer como a tapsigargina inibe as fosforilações da Cofilina-1, nos concentramos nas vias mTOR-RhoA. Foi demonstrado que o mTOR integra sinais de uma variedade de entradas extracelulares, incluindo fatores de crescimento, aminoácidos, glicose, ATP e oxigênio. A sinalização dependente de mTOR modula inúmeras propriedades celulares, incluindo proliferação celular, motilidade celular e tradução de proteínas. A inibição da atividade da mTOR quinase pela rapamicina prejudica a síntese de proteínas mediada por mTOR e as atividades das pequenas GTPases (por exemplo, RhoA), levando à inibição da organização da F-actina e da motilidade celular [21, 25]. Além disso, o efeito inibitório da rapamicina na expressão de RhoA também é observado em outras linhas de células tumorais, incluindo aquelas derivadas de câncer cervical (HeLa), câncer de próstata (PC-3), sarcoma de Ewing (Rh1) e glioblastoma (U-373 ) [26], sugerindo que isso não é dependente do tipo de célula. Aqui, nossos resultados sugeriram que a tapsigargina também pode diminuir a atividade da mTOR quinase e inibir o nível da proteína RhoA em células A549 de adenocarcinoma de pulmão humano. Esses achados podem contribuir para o comprometimento dos citoesqueletos de actina pela tapsigargina. Assim, nosso trabalho estabeleceu ligações de influxo de cálcio, vias mTOR-RhoA e dinâmica do citoesqueleto.

5. Conclusão

Em resumo, os presentes estudos revelam que o influxo ectópico de cálcio pela tapsigargina inibe a atividade da mTOR quinase e a expressão de RhoA, levando ao aumento da atividade da Cofilina-1 e despolimerizações da actina. O comprometimento da dinâmica do citoesqueleto de actina finalmente desencadeia a morte celular em células A549 de adenocarcinoma de pulmão humano. Nosso trabalho sugere que as terapias que visam especificamente moléculas de sinalização do citoesqueleto de cálcio podem ser úteis para o tratamento de metástases de células tumorais.

Conflito de interesses

Não há conflito de interesses a declarar, e cada autor certifica que não possui associações comerciais que possam representar conflito de interesses neste trabalho.

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Direito autoral

Copyright & # xA9 2014 Fei Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob a Licença de Atribuição Creative Commons, que permite o uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o trabalho original seja devidamente citado.


Localizações de figuras

Figura 2 Diagramas esquemáticos da polaridade dos microtúbulos (MT) em vertebrados, Drosófila, e Caenorhabditis elegans neurônios usados ​​na regeneração de axônios. (uma) Polaridade MT neuronal típica de vertebrados, com base em estudos de interneurônios de roedores (Baas et al. 1988, Stepanova et al. 2003). MTs axonais são quase exclusivamente terminais positivos (MTs terminais positivos são mostrados como setas azuis). Os dendritos proximais têm polaridade mista, mais os dendritos distais têm polaridade positiva. (b) No Drosófila neurônios sensoriais, classe I de arborização dendrítica, MTs axonais ddaC são & gt95% mais a extremidade. MTs dendríticos proximais são predominantemente menos MTs end-out (MTs menos end-out mostrados como setas vermelhas) mais dendritos distais têm polaridade MT mista (Stone et al. 2008). (c) Arranjo MT selecionado C. elegans neurônios. Os neurônios mecanossensoriais PLM têm extremidades positivas no processo axonal anterior principal (Ghosh-Roy et al. 2012). Em neurônios motores DB, os processos pré-sinápticos dorsais têm mais orientação final, com base na imagem EBP-GFP (Goodwin et al. 2012). Em neurônios DA, os processos pré-sinápticos dorsais também têm MTs terminais positivos e os processos pós-sinápticos ventrais têm polaridade mista com mais terminais negativos distais (Ou et al. 2010). Os neurônios sensoriais anfídeos têm TMs terminais negativos em seus processos sensoriais e TMs terminais terminais positivos em seus axônios (Maniar et al. 2012).


DISCUSSÃO

Embora as experiências in vitro tenham revelado que a atividade motora da miosina II e a montagem do filamento são reguladas pela fosforilação MRLC, a importância da fosforilação na dinâmica da miosina II in vivo ainda não foi totalmente examinada. No presente estudo, abordamos essa questão usando células MDCK II que expressam MRLC-EGFP ou seus mutantes que mimetizam vários estados de fosforilação. O papel da miosina II não fosforilada (0P-), 1P- ou 2P na dinâmica da miosina II in vivo foi revelado.

Usando células que expressam AD- ou DD-MRLC com fibras de estresse resistentes a Y27632, fomos capazes de aumentar nosso nível de conhecimento existente sobre o papel da ROCK na formação de fibras de estresse. A atividade ROCK é conhecida por regular a fosforilação MRLC por mono- (Amano et al., 1996) ou di- (Ueda et al., 2002) fosforilação de MRLC e por desfosforilação indireta de MRLC por meio da ativação de miosina fosfatase (Amano et al., 1996 Kimura et al., 1996). A inativação de ROCK, por outro lado, supostamente leva à desfosforilação da cofilina por meio da inativação da quinase LIM. Isso também pode causar ruptura da fibra de estresse por meio da despolimerização de actina induzida por cofilina ativada (Maekawa et al., 1999). Nossos experimentos usando células que expressam AD ou DD-MRLC mostraram claramente que ROCK regula a formação de fibras de estresse principalmente por meio da fosforilação de MRLC, mas não da fosforilação de cofilina, pelo menos em células MDCK II. Embora ROCK regule principalmente a conversão entre 1P- para 2P-MRLC em todas as células MDCK II, sua atividade parece ser essencial para manter 1P-MRLC em fibras de estresse por várias razões. Em primeiro lugar, MYPT1 localiza-se nas fibras de estresse e pode desfosforilar prontamente MRLC quando a atividade ROCK é reduzida (Figura 9A). Em segundo lugar, a redução do nível de 1P-MRLC pela inibição de ROCK foi limitada às regiões de fibra de estresse e esta inibição causou a ruptura da fibra de estresse (Figura 4). Terceiro, como AD-MRLC mimetizando 1P-MRLC é suficiente para manter as fibras de estresse durante o tratamento Y27632 (Figuras 4 e 9), a produção de 0P-MRLC deve ocorrer em fibras de estresse de células normais tratadas com Y27632.

Também encontramos problemas no uso de inibidores de MLCK, como ML-7. O efeito de ML-7 ou -9 na organização citoesquelética ou motilidade celular foi interpretado como sendo o efeito da redução da atividade da miosina II através da inibição da atividade MLCK (Saitoh et al., 1987). Usando MRLCs pseudofosforilados que não são sensíveis à fosforilação / desfosforilação, elucidamos que ML-7 ou -9 afeta a organização das fibras de estresse por outros efeitos colaterais além da fosforilação de MRLC. Porque camundongos knockout para MLCK mostraram desenvolvimento embrionário quase normal (Somlyo et al., 2004) e porque ZIP quinase também é sensível a ML-9 e responsável pela fosforilação de MRLC pelo menos em fibroblastos NIH3T3 (Komatsu e Ikebe, 2004), é claro que a importância de MLCK na estrutura e função da actomiosina é limitada a um subconjunto de órgãos. A partir dessas descobertas, sugerimos que seja necessário reavaliar os relatórios que afirmam a importância da atividade de MLCK ou miosina II com base nos resultados do uso desses inibidores.

Demonstramos neste estudo que a distribuição de 1P-miosina II é semelhante à da miosina II total em geral, enquanto a 2P-miosina II está concentrada localmente, de acordo com relatórios anteriores (Sakurada et al., 1998 Uchimura et al., 2002 Komatsu e Ikebe, 2004). Além disso, o acúmulo de 2P-miosina II coincidiu com as regiões de contração nas fibras de estresse (Figura 5). A difosforilação de MRLC foi mais sensível do que a monofosforilação a inibidores de quinase / fosfatase e a mediadores como a prostaglandina F (Sakurada et al., 1998 este estudo). A difosforilação causou um baixo turnover da miosina II (Figura 7). Portanto, é razoável pensar que embora a monofosforilação em si seja essencial para as funções da miosina II, a difosforilação, em vez da monofosforilação de MRLC, regula localmente a montagem ou contração da miosina II em muitos casos dentro das células.

Nós analisamos a dinâmica da miosina II por imagem ao vivo de MRLC marcado com EGFP. A intensidade da fluorescência mudou rapidamente com WT- ou AS-MRLC-EGFP, mas não outras construções mutantes (Figura 6), indicando que a fosforilação / desfosforilação de MRLC é importante para a rápida montagem e desmontagem da miosina II. Conforme mostrado in vitro (Ikebe et al., 1988) e in vivo (Totsukawa et al., 2004 neste estudo), consideramos a 1P-miosina II estável para manter os filamentos em comparação com a 0P-miosina II, e que a 2P-miosina II é mais estável do que a 1P-miosina II. De acordo com a medição FRAP (Figura 7) e a formação do cordão em bolsa no fechamento da ferida (Figura 8), miosina II contendo AA-MRLC não fosforilável pode ser incorporada aos filamentos e a desfosforilação de MRLC é necessária para a rápida renovação dos filamentos de miosina II. A recuperação lenta com AD-, DD- ou WT-MRLC fosforilado em medições de FRAP pode ser devido à estabilidade dos filamentos de miosina II que inibe a liberação rápida de moléculas de miosina II dos filamentos para o citoplasma. Isso levanta a questão de por que as fibras de estresse são mantidas em células que expressam AA-MRLC. Como essas fibras de estresse também são sensíveis ao Y27632, a miosina II endógena contendo MRLC deve, portanto, participar das fibras de estresse e sua fosforilação desempenha um papel crucial na manutenção das fibras de estresse. Além disso, observamos uma quantidade considerável de 1P-miosina II em fibras de estresse em células que expressam AA-MRLC (dados não mostrados). Obtivemos um pequeno valor de t1/2 com WT-MRLC (17,5 s) em comparação com aquele (8,5 min) em células de fibroma de gerbil (Peterson et al., 2004). Outro estudo, no entanto, mostrou recuperação rápida em regiões perinucleares em células suíças 3T3 (DeBiasio et al., 1988). Esta discrepância pode ser devida a diferenças no estado de fosforilação do MRLC e / ou a existência de proteínas que podem alterar a estabilidade do filamento de miosina II entre várias células.

Descrevemos a dinâmica da miosina II em fibras de estresse em células MDCK II como na Figura 10. MRLC em fibras de estresse é freqüentemente desfosforilada para o estado 0P e isso é necessário para a rápida liberação de moléculas de miosina II dos filamentos. Em fibras de estresse estáveis, a liberação e a incorporação de moléculas de miosina II são geralmente equilibradas (fosforilação intermediária). Quando a fosforilação MRLC é reduzida a um certo nível em regiões restritas de fibras de estresse de células normais ou em fibras de estresse em células tratadas com inibidores para a fosforilação, a liberação torna-se dominante e as fibras de estresse são relaxadas, esticadas e interrompidas (baixa fosforilação). Quando a fosforilação do MRLC é localmente elevada, a incorporação torna-se dominante, resultando na montagem do filamento de miosina II e na demonstração de maior atividade contrátil (alta fosforilação). Acreditamos que esse mecanismo seja essencialmente comum a todas as estruturas contendo miosina II dentro das células, exceto as fibras de estresse. Embora miosina II contendo AA-MRLC em fibras de estresse mostrou rápida renovação (t1/2 = 12,8 s), sua intensidade de fluorescência foi relativamente estável por mais tempo (∼10 min), indicando que a liberação e a incorporação são rápidas, mas equilibradas. O nível de fosforilação de MRLC em células que expressam AA-MRLC pode ser relativamente estável em comparação com as células que expressam WT-MRLC, provavelmente porque as células que expressam AA-MRLC contêm apenas uma pequena quantidade de MRLC endógeno que pode ser fosforilado ou desfosforilado.

Figura 10. Modelo da dinâmica da miosina II dentro das células reguladas por fosforilação. Para obter detalhes, consulte o texto.

Na tentativa de compreender o mecanismo de regulação espacial do MRLC, testamos dois fatores que podem regular as localizações da quinase ou fosfatase para o MRLC (Figura 9). Uma é a atividade ROCK. Embora MYPT1, uma subunidade de ligação à miosina da miosina fosfatase é fosforilada por ROCK, resultando em menor afinidade para a miosina II (Velasco et al., 2002), a inibição de ROCK não alterou o acúmulo de MYPT1. O segundo fator é a atividade ATPase da miosina II. Quando esta atividade foi bloqueada pela blebbistatina, tanto a ZIP quinase quanto a MYPT1 foram liberadas dos filamentos de miosina II, mesmo na presença do inibidor ROCK. As alterações conformacionais da miosina II por geração de força, em vez de fosforilação, parecem regular a associação da quinase / fosfatase à miosina II. Presumimos que esta localização dependente da atividade da miosina II da quinase / fosfatase está envolvida no equilíbrio da contratilidade dentro ou entre as células. Mais detalhes sobre o mecanismo dependente de força dessas associações devem ser elucidados usando sistemas de reconstituição in vitro.


Assista o vídeo: The cytoskeleton. Structure of a cell. Biology. Khan Academy (Janeiro 2022).