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7.2: Projeto de exclusão do genoma de Saccharomyces - Biologia

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A publicação da sequência do genoma da levedura abriu novas oportunidades para geneticistas de levedura. A recombinação homóloga permite aos pesquisadores
para substituir um gene cromossômico por uma construção de DNA de sua própria concepção. As células transformadas que incorporaram os cassetes de substituição em DNA cromossômico podem ser identificadas selecionando o gene marcador no cassete de substituição.

o Saccharomyces Projeto de exclusão de genoma (SGDP) usou esta abordagem para substituir sistematicamente cada uma das ORFs previstas no S. cerevisiae genoma com resistência à canamicina (KANR) gene. Para cada ORF, os pesquisadores usaram uma série de reações de PCR (abaixo) para construir cassetes em que o KANR gene foi flanqueado por sequências curtas de DNA que ocorrem a montante e a jusante da ORF alvo no S. cerevisiae cromossoma. Os cassetes foram então usados ​​para transformar a cepa BY4742 (Brachmann et al., 1998). Cepas que incorporaram o KANR gene foram selecionados em placas contendo análogos de canamicina (Winzeler et al., 1999).

o S. cerevisiae cepas que estamos usando em nossos experimentos fazem parte da coleção SGDP de mutantes de deleção. Neste laboratório, você usará PCR para identificar quais CONHECEU genes foram interrompidos em suas cepas. Os primers de PCR foram projetados e testados pelo SGDP para verificar as identidades das cepas. Os primers disponíveis incluem dois primers específicos de gene (GSP) para cada um dos CONHECEUgenes. Um dos GSPs, o GSP Primer A, está localizado 200-400 bp a montante do códon de iniciação. O segundo GSP, GSP Primer B, é um primer antisense que se liga ao ORF. Também temos um primer antisense que liga 250 bp dentro do KANR gene (KAN Primer B).


Geração de cepas de deleção de genes de levedura em todo o genoma

No ano de 2001, uma coleção de cepas de levedura será concluída, as quais serão deletadas nos 6000 quadros de leitura abertos selecionados como genes putativos pela análise bioinformática inicial do genoma de Saccharomyces cerevisiae. A coleção foi produzida pelo projeto transatlântico de deleção do gene de levedura, uma colaboração envolvendo pesquisadores dos EUA, Canadá e Europa. O esforço europeu fez parte da EUROFAN (European Functional Analysis Network), onde algumas das cepas poderiam alimentar vários nós de análise funcional lidando com áreas específicas da biologia celular. Com aproximadamente 40% dos genes humanos envolvidos em doenças hereditárias tendo um homólogo em leveduras e com o uso de leveduras em várias estratégias de descoberta de drogas, não menos devido ao aumento dramático de infecções fúngicas, essas cepas serão valiosas em estudos transgenômicos e em estudos de interesse especializado em laboratórios individuais. Uma análise detalhada do projeto pelo consórcio está em preparação, aqui discutimos as cepas de levedura, relatamos resultados e abordagens para usar este recurso.


O gal80 Exclusão por CRISPR-Cas9 na engenharia Saccharomyces cerevisiae Produz Ácido Artemisínico Sem Indução de Galactose

O sistema de repetições palindrômicas curtas (CRISPR) -as com agrupamento regularmente intercalado surgiu como a ferramenta dominante para a engenharia do genoma, ao mesmo tempo que muda a velocidade e a eficiência da engenharia metabólica em leveduras convencionais e não convencionais. Entre esses sistemas CRISPR-Cas, a tecnologia CRISPR-Cas9 geralmente tem sido aplicada para remover genes alvo desfavoráveis. Aqui, usamos a tecnologia CRISPR-Cas9 para excluir o gal80 gene na cepa deficiente em uracila e havia remodelado com sucesso o Saccharomyces cerevisiae que pode produzir ácido artemisínico sem indução de galactose. Um L9(3 4) teste ortogonal foi adotado para investigar os efeitos de diferentes fatores na produção de ácido artemisínico. O meio de fermentação III com sacarose como fonte de carbono, nível de inóculo de 1% e tempo de cultura de 84 h foram identificados como as condições ideais de fermentação. Sob esta condição, a produção máxima de ácido artemisínico por engenharia S. cerevisiae 1211-2 foi de 740 mg / L no nível de cultivo do frasco agitado. Este estudo forneceu uma abordagem eficaz para reformar a via metabólica da cepa produtora de ácido artemisínico. O engenheiro S. cerevisiae 1211-2 pode ser aplicado à produção de ácido artemisínico por fermentação industrial no futuro.

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A identificação de determinantes genéticos da tolerância ao metanol em leveduras sugere diferenças nos mecanismos de toxicidade do metanol e do etanol e candidatos para engenharia aprimorada de tolerância ao metanol

Figura 1. Comparação das curvas de crescimento de S. cerevisiae BY4741 em meio YPD (pH 4,5) suplementado ou não ( ) com 5% ( ), 8% ( ), 10% ( ), ou 14% (v / v) ( ) de metanol. O crescimento foi seguido em um leitor de microplaca medindo a densidade óptica a 595 nm de uma placa de 96 poços incubada a 35 ° C com agitação orbital, por 36 h. Figura 1. Comparação das curvas de crescimento de S. cerevisiae BY4741 em meio YPD (pH 4,5) suplementado ou não ( ) com 5% ( ), 8% ( ), 10% ( ), ou 14% (v / v) ( ) de metanol. O crescimento foi seguido em um leitor de microplaca medindo a densidade óptica a 595 nm de uma placa de 96 poços incubada a 35 ° C com agitação orbital, por 36 h.

Discussão

Apesar da abundância de longos RNAs não codificantes identificados por abordagens de todo o genoma, estudos genéticos rigorosos que poderiam ajudar na caracterização funcional de lncRNAs individuais estão ausentes [2]. Aqui, aproveitamos a tratabilidade genética da levedura e empregamos uma metodologia SGA de alto rendimento para catalogar sistematicamente os IGs de seis SUTs intergênicos. Inicialmente, verificamos a utilidade da abordagem, demonstrando que os IGs identificados para o RNA da telomerase TLC1 enriquecer os termos GO correspondentes à sua função celular conhecida. As telas SGA subsequentes e a análise dos perfis GI implicaram os seis SUTs intergênicos testados em diversos processos biológicos. Um desses lincRNAs, SUT457, exibiu IGs que enriqueceram uma anotação GO definitiva ligando-o à biologia dos telômeros. Uma caracterização funcional adicional revelou o papel de SUT457 na prevenção do acúmulo de ssDNA telomérico. Além disso, experimentos de resgate fenotípico mostraram que SUT457 atua em trans para manter os níveis fisiológicos de ssDNA telomérico. Nosso trabalho revela que o mapeamento sistemático dos IGs de lncRNAs pode associar essas moléculas a processos biológicos específicos e apontar suas funções individuais.

Em leveduras, a função dos lncRNAs identificados tem sido principalmente ligada à regulação da expressão gênica. A maioria dos lncRNAs caracterizados até agora regulam seus genes cognatos por meio de interferência transcricional [23, 24, 66] ou modulando sua estrutura de cromatina local [19-22]. No entanto, evidências emergentes sugerem que lncRNAs podem ter papéis além da regulação gênica [42]. Os perfis de enriquecimento GO dos SUTs intergênicos testados os ligaram a funções nucleares, como reparo de DNA, meiose e organização de telômeros, mas também a processos citoplasmáticos, incluindo fusões de membrana e formação de vesículas, por exemplo, no caso de SUT042 (Fig. 2a). A última observação é consistente com o fato de que um grande número de SUTs são transportados para o citoplasma e foram propostos para representar transcritos funcionais dentro deste compartimento celular [18]. Além disso, lncRNAs humanos são co-expressos com proteínas da membrana citoplasmática [67] e estão presentes dentro de vesículas extracelulares [68]. Portanto, a futura caracterização aprofundada de lincRNAs, como SUT042, poderia elucidar o papel dessas moléculas em processos citoplasmáticos, como biogênese e tráfego de vesículas.

Apenas raros exemplos de translncRNAs de levedura ativa foram relatados até o momento. Especificamente, o PHO84 lncRNAs antisense e um transcrito instável críptico associado a retrotransposons Ty1 controlam o silenciamento transcricional de seus genes alvo em trans [69, 70]. Mostramos aqui que o perfil GI também pode fornecer informações sobre o modo de ação dos lincRNAs, além de inferir sua função biológica. Isso é conseguido comparando os perfis GI de lincRNAs com aqueles de seus genes codificadores de proteínas adjacentes. Por exemplo, TLC1 tem uma rede GI que difere completamente daquela de seus genes a montante e a jusante (Fig. 2b), o que está de acordo com o fato de que TLC1 tem uma função não relacionada com seus vizinhos e atua em trans nas extremidades do cromossomo [71]. De forma similar, SUT457 e SUT042 têm perfis GO distintos em comparação com seus genes vizinhos (Fig. 2c e Arquivo adicional 7: Figura S2), sugerindo que esses SUTs também podem funcionar em trans. De acordo, SUT457 a deleção não afeta a expressão de seus genes vizinhos (Fig. 3b) e regula um processo telomérico que ocorre distal de seu local de transcrição (Fig. 5). No entanto, ainda existe a possibilidade de que o SUT457 locus é próximo a um gene envolvido no processamento da extremidade do telômero dentro da arquitetura tridimensional do genoma. Portanto, em tal cenário, SUT457 teria um papel no processamento da extremidade do telômero, controlando seu gene espacialmente proximal. No entanto, o resgate fenotípico obtido pela expressão SUT457 de um cromossomo diferente (Fig. 5) torna este cenário bastante improvável. Três dos outros SUTs intergênicos testados (SUT014, SUT451 e SUT469) exibem IGs com perfis de enriquecimento GO que se sobrepõem aos de seus genes flanqueadores (arquivo adicional 7: Figura S2), indicando que esses lincRNAs podem estar envolvidos na regulação de seus genes próximos em cis. Claro, não podemos eliminar, neste ponto, a probabilidade de que a construção dessas três deleções SUT leve a um efeito de gene vizinho [54, 55], que pode ser responsável pela sobreposição observada entre perfis GO enriquecidos (Arquivo adicional 7: Figura S2). Notamos que dois dos seis SUTs intergênicos testados (SUT042 e SUT457) exibem perfis de GI consistentes com um trans- papel atuante e, portanto, em contraste com a evidência atual na literatura, antecipamos que um número considerável de lincRNAs de levedura de brotamento funcionaria em locais distais de seu locus de síntese.

Falta de SUT457 exibiu senescência acelerada em células telomerase-negativas (Fig. 3e e arquivo adicional 9: Figura S4) associada com encurtamento de telômero aprimorado (Fig. 3f) e um acúmulo em saliência de ssDNA telomérico (Fig. 4a). Curiosamente, fenótipos análogos foram relatados para mutações de fatores envolvidos na proteção da extremidade do telômero [38, 40, 41, 52]. Consistente com as observações acima, SUT457 mostra um GI positivo com o fator de capeamento do telômero YKU70 (Fig. 3c e arquivo adicional 12: Figura S7), implicando que essas duas moléculas afetam o mesmo processo molecular [46]. Notavelmente, o Yku70 se liga e protege os telômeros do processamento nucleolítico Exo1, evitando assim o acúmulo de saliência do ssDNA telomérico [30, 37, 64]. Nossos dados também mostram que a nuclease Exo1 é necessária para o aumento no ssDNA telomérico detectado na ausência de SUT457 (Figs. 4d e e). Além disso, de acordo com o fato de que EXO1- o acúmulo dependente de ssDNA telomérico induz a parada do ciclo celular [37, 72], mostramos que a perda da proteína de mascaramento de ssDNA telomérico Gbp2 em sut457Δ as células resultam na inibição do crescimento após a subcultura (Fig. 4c) e, mais importante, esta parada do crescimento é resgatada pela deleção de EXO1 (Arquivo adicional 11: Figura S6). Com base nas evidências acima, especulamos que o SUT457 funciona em uma via que protege as extremidades dos telômeros do processamento nucleolítico, a fim de regular os níveis de saliências de ssDNA teloméricas. Curiosamente, o RNA telomérico contendo repetição de lncRNA associado ao telômero também foi implicado nesta via, mas, em vez disso, facilita a atividade de nuclease de Exo1 nas extremidades do cromossomo [73].

A sequência de nucleotídeos primária de SUT457 (Arquivo adicional 6: Tabela S5) não exibe similaridade de sequência significativa com quaisquer outras regiões dentro do S. cerevisiae genoma e carece de conservação, mesmo entre espécies de levedura intimamente relacionadas ([11] e dados não mostrados). No entanto, considerando seu papel revelado no processo celular fundamental e conservado da homeostase do telômero pendente [35], acreditamos que análogos funcionais de SUT457 podem existir em outros eucariotos. Da mesma forma, TLC1 é um lncRNA cuja sequência primária não é conservada evolutivamente, mas que possui análogos funcionais em outros organismos [26].


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Telas fenotípicas em grande escala

A seção a seguir destaca vários aplicativos da coleção YKO e não pretende ser abrangente.

Crescimento celular

Uma triagem das coleções de deleção heterozigótica e homozigótica revelou que ∼3% dos genes são haploinsuficientes em rich media (Deutschbauer et al. 2005). Este resultado tem ramificações importantes para telas agrupadas da coleção de deleção de heterozigotos, pois 97% de todos os heterozigotos não mostram nenhum fenótipo detectável sem perturbação, e que estender o número de gerações de crescimento realiza uma maior sensibilidade e faixa dinâmica. O defeito de aptidão (3–5%) da maioria dos heterozigotos haploinsuficientes é aproximadamente uma ordem de magnitude menor do que suas contrapartes haploides ou homozigotas (10–50%). Mais da metade dos 3% dos genes haploinsuficientes são funcionalmente relacionados ou enriquecidos para a função ribossomal (Deutschbauer et al. 2005). Os autores especularam que isso se deve ao fato de que a função ribossômica se torna limitante da taxa em condições de rápido crescimento em mídia rica. Esta hipótese foi apoiada pela observação de que muitos dos mutantes haploinsuficientes não manifestam mais um fenótipo de crescimento em meio mínimo, no qual todas as cepas crescem mais lentamente. Assim, parece que a base primária da haploinsuficiência em condições ideais de crescimento é devida à produção insuficiente de proteína.

Outros ensaios de crescimento / aptidão da coleção de deleção pontuaram fenótipos como o tamanho da célula. Jorgensen et al. (2002) identificou ∼500 mutantes pequenos (whi) ou grandes (lge), revelando uma rede de produtos gênicos que controlam o tamanho da célula no "início", o ponto no ciclo celular em que as células se comprometem com o próximo ciclo celular. Este estudo mostrou a estreita relação entre a biogênese do ribossomo e o tamanho da célula, mediada pelo fator de transcrição Sfp1. Um ensaio de tamanho de célula de todos os homozigotos não essenciais e todos os 1166 heterozigotos essenciais mutantes de deleção identificou um conjunto muito menor de 49 genes que alteram dramaticamente o tamanho da célula, 88% dos quais têm homólogos humanos (Zhang et al. 2002), ressaltando o nível notavelmente alto de conservação nos genes centrais de controle do ciclo celular.

Acasalamento, esporulação e germinação

A primeira triagem do genoma para defeitos na esporulação e germinação dobrou o número de genes implicados na esporulação (Deutschbauer et al. 2002). Entre esses 400 genes estão reguladores positivos e negativos, incluindo genes envolvidos na autofagia, utilização de carbono e transcrição, bem como recombinação e segregação cromossômica. A comparação deste ensaio fenotípico com ensaios de expressão publicados anteriormente revelou que 16% dos genes de esporulação expressos diferencialmente afetam a produção de esporos, novamente demonstrando a frequente falta de correlação entre a regulação da expressão gênica e o fenótipo.

Uma triagem para mutantes de germinação (Kloimwieder e Winston 2011) forneceu uma lista atualizada de genes envolvidos na germinação e revelou dois novos genes não previamente implicados na germinação (Kloimwieder e Winston 2011), demonstrando a utilidade de revisitar e repetir as telas realizadas na coleção de deleção para confirmar e estender conjuntos de dados coletados anteriormente.

Tráfico de membrana

As células de levedura dependem fortemente de uma interação complexa de formação, transporte e reciclagem de vesículas para manter a organização celular e a homeostase e para amortecer sua resposta às mudanças ambientais. A importância do tráfego de membrana adequado é demonstrada pela onipresença de genes com defeitos nesse processo em resultados de quase todas as telas de deleção de todo o genoma. O enriquecimento desses mutantes é particularmente evidente em pesquisas de drogas e perturbações ambientais.

Várias telas focavam certos aspectos do transporte da membrana e da vesícula. Uma triagem da coleção de deleção não essencial haplóide para mutantes defeituosos para transporte endossomal identificou o VPS55 / 68 complexo de classificação como um jogador-chave nesse processo (Schluter et al. 2008). Uma triagem da coleção mutante haplóide não essencial identificou 87 genes necessários para a retenção intracelular do chaperone ER Kar2, incluindo uma série de conhecidos por estarem envolvidos na modificação e classificação de proteínas secretoras (Copic et al. 2009).

O tráfego da membrana e a dinâmica estão intimamente ligados ao vacúolo, o equivalente funcional do lisossoma dos mamíferos. Estudos recentes demonstram que esta organela multifuncional é essencial para classificação de proteínas, acidificação de organelas, homeostase de íons, autofagia e resposta a estresses ambientais. Além disso, o vacúolo fornece à célula várias opções para lidar com xenobióticos e drogas desintoxicantes (para revisão, Li e Kane 2009). A título de exemplo, a H + ATPase vacuolar foi implicada na resposta à droga em dois estudos de grande escala (Parsons et al. Hillenmeyer 2004 et al. 2008).

Estresses ambientais selecionados

Aproximadamente 20% das telas da coleção de deleção de levedura concentraram-se na resposta ao estresse ambiental, incluindo choque térmico, estresse oxidativo, ácido fraco e estresse iônico e choque osmótico (Gasch et al. 2000). Padrões de expressão genômica semelhantes em resposta a uma variedade de condições de estresse ambiental foram observados (Gasch et al. 2000), mas estudos análogos com as coleções de deleção de leveduras observaram o oposto, identificando genes necessários exclusivamente para resistir a diversos estresses. A base para a discrepância entre a expressão gênica e os genes necessários para resistir ao estresse permanece um mistério.


Resumo

O isoprenol (3-metil-3-buteno-1-ol) é um biocombustível valioso e um importante precursor de vários produtos químicos básicos. Sistemas microbianos sintéticos usando a via heteróloga do mevalonato foram recentemente desenvolvidos para a produção de isoprenol em Escherichia coli, e uma melhoria significativa do rendimento e do título foi alcançada ao longo de uma década de pesquisa. Saccharomyces cerevisiae tem sido amplamente utilizado na indústria de biotecnologia para a produção de isoprenóides, mas não houve nenhum bom exemplo de produção de isoprenol relatado neste hospedeiro. Neste estudo, nós projetamos a levedura de brotamento S. cerevisiae para uma melhor biossíntese de isoprenol. A cepa projetada com a via do mevalonato atingiu a produção de isoprenol no título de 36,02 ± 0,92 mg / L no frasco. A via de derivação IPP (difosfato de isopentenila), que tem mostrado produção de isoprenol mais eficiente, evitando o acúmulo do intermediário tóxico em E. coli, também foi construído em S. cerevisiae e melhorou o título de isoprenol em 2 vezes. Nós ainda projetamos as cepas excluindo uma quinase endógena promíscua que poderia desviar o fluxo da via para longe da produção de isoprenol e melhoramos o título para 130,52 ± 8,01 mg / L. Finalmente, identificamos um gargalo da via usando a análise metabolômica e superexpressamos uma fosfatase alcalina promíscua para aliviar esse gargalo. Os esforços combinados resultaram na melhora do título para 383,1 ± 31,62 mg / L no frasco. Este é o título de isoprenol mais alto até o momento em S. cerevisiae e este trabalho fornece as principais estratégias para projetar a levedura como uma plataforma industrial para a produção de isoprenol.


Fungos (leveduras e outros)

Pesquise informações sobre os íntrons spliceosomal da levedura Saccharomyces cerevisiae.

Encontre dados de sequência genômica e informações sobre genes e proteínas de Aspergilli.

Pesquise e analise dados genômicos extraídos de espécies de Aspergillus.

Recurso biológico que coleta as informações mais relevantes relacionadas a genes e proteínas envolvidos nos processos do ciclo celular humano e de levedura.

Encontre informações sobre os genomas de mais de 80 espécies de fungos.

Busca por informações genômicas sobre o fungo patógeno oportunista Candida albicans.

Pesquisa por Expressed sequence tags (ESTs) em 18 espécies de fungos patogênicos.

Pesquisa de informações abrangentes sobre a estrutura molecular e rede funcional da levedura Saccharomyces cerevisiae.

Pesquisa de dados genômicos e informações sobre o fungo patógeno humano Candida albicans.

Encontre informações sobre o gênero Fusarium.

Pesquise um banco de dados centralizado contendo dados de um grande número de estudos de microarray do ciclo celular.

Encontre anotações de genoma para bactérias, protistas, fungos, plantas e metazoários de invertebrados.

Pesquise informações genômicas do patógeno vegetal Fusarium graminearum a partir deste recurso abrangente do genoma.

Um pipeline de informática que apóia a análise filogenômica de fatores de transcrição fúngicos.

Pesquise classes funcionais, localizações celulares e complexos de proteínas para obter uma lista de genes de levedura.

Pesquise informações abrangentes sobre o genoma de Saccharomyces cerevisiae.

Realizar estudos genômicos comparativos em leveduras hemiascomicetas.

Procure por sequências de nucleotídeos distintas que distinguem organismos microbianos de outros.

Encontre informações sobre ortólogos relacionados funcionalmente.

Pesquise informações relacionadas à sequência de proteínas com base na análise de todo o genoma.

Pesquisa de informações sobre a estrutura molecular e rede funcional do fungo filamentoso Neurospora crassa inteiramente sequenciado.

Um servidor da web abrangente para mineração de locais de ligação de fator de transcrição em levedura.

Encontre informações sobre milhares de genomas microbianos.

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Informações relacionadas às interações patógeno-hospedeiro.

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Banco de dados de filomas completos derivados para diferentes genomas dentro de uma faixa taxonômica específica.

Pesquisa de informações biológicas moleculares para pesquisa de interação de plantas Phytophthorax96.

Detecta pontos quentes / frios de recombinação do genoma da levedura.

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Visualize genomas microbianos de forma interativa e gere imagens escalonáveis ​​de alta qualidade.

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Identifique as condições que afetam a expressão de um gene ou lista de genes de levedura regulados em um conjunto de experimentos.

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Texto principal

Yeast nitrogen utilization under wine fermentative conditions

Several reviews exist that focus on yeast nitrogen sensing, signalling, transport, assimilation and metabolism [27,28,29,30,31,32,33,34,35]. A general conclusion is that yeast growth rate is not only associated with the amount of available nitrogen, but also with the quality of the nitrogen source [18, 27]. Thus, nitrogen sources sustaining high growth rate such as glutamine, glutamate, asparagine and ammonium are considered as preferred, whereas proline, allantoin and urea allows slow growth rate and, therefore, are considered as non-preferred nitrogen sources [28].

Nitrogen can be found in various forms in grape must, with yeast consuming mainly ammonium and amino acids from them, the main amino acids present are proline, arginine, alanine, glutamate, glutamine, serine and threonine, in addition to ammonia [36]. Moreover, in wine fermentation context these nitrogen sources are consumed following a specific order, where asparagine, threonine, glutamine, leucine, histidine, methionine, isoleucine, serine, glycine and phenylalanine are utilized at the beginning of the fermentation, while ammonium, valine, arginine, alanine, tryptophan and tyrosine are preferred at later times [37]. This preference for different nitrogen sources is the aftermath of a tight metabolic regulation system where four different mechanisms regulate nitrogen utilization: Ssy1-Ptr3-Ssy5 system (SPS), nitrogen catabolic repression (NCR), retrograde signalling pathway (RTG) and the general control of amino acids (GAAC) with all of them in turn regulated by the TORC1 signalling pathway [29, 30].

Under nitrogen limited conditions, yeast cells grow slowly, reducing the ribosome biogenesis, protein translation and arresting the cell cycle in G1 [38]. There are a couple of excellent reviews covering this topic in wine fermentation context [18, 21, 26], mainly focused on studies that used media containing a mixture of different nitrogen sources mimicking natural grape musts. Remarkably, several groups around the world have shown that the nitrogen requirements of S. cerevisiae are strain-dependent, i.e. different yeast strains have different necessities of nitrogen, and then have different capacities to growth and perform wine fermentation in nitrogen-limited musts [39,40,41,42,43]. In this context, the wide phenotypic diversity observed in S. cerevisiae for nitrogen requirements is probably a consequence of its genetic diversity, being an important challenge to disentangle this diversity.

Yeast genetic diversity

Genome sequencing and population structure

As abovementioned, S. cerevisiae is a model organism with its genome fully sequenced since 1996 [1]. Since then, different attempts have been made to unveil the genetic diversity and population structure of the species. The first attempts to unveil the genetic diversity present in S. cerevisiae were done sequencing individual genes and using molecular markers, which showed the presence of two main yeast populations: domesticated yeasts associated with human activities (wine, beer, bread, etc.) and wild yeasts from natural environments without human intervention [44,45,46].

These two populations reflect different evolutionary trajectories, for instance, wine yeasts have been selected by centuries of human activity, preferring traits such as ethanol production and fruity flavours and fragrances while wild yeasts have faced challenging environments with scarcity of carbon and nitrogen sources [47]. Furthermore, this divergent track of selection was confirmed by assaying the ability of wild yeasts to growth in a wide range of carbon and nitrogen sources, which contrasts with the limited nitrogen and carbon sources sustaining growth in wine yeasts [48].

After these first attempts, the population structure of S. cerevisiae was finally resolved by genome sequencing of 37 yeast strains isolated from different ecological niches, demonstrating the presence of five clean lineages or subpopulations in the species: Malaysian (MA), Sake (SA), North American (NA), West African (WA) and Wine/European (WE) [49, 50]. Afterward, the genome sequencing of 100 yeast strains confirmed the presence of these five clean lineages (MA, NA, SA, WA and WE) in the population structure of S. cerevisiae [51]. Interestingly, the information obtained by these and other sequencing efforts has revealed unique sets of genetic features related with yeast strains specific niche adaptation, often absent in the reference genome, some of them acquired by horizontal gene transfer events from distant species or by introgression from closely relative ones [52,53,54,55,56,57,58].

Recently, the “1002 yeast genomes project” has been finished, representing the most complete catalogue of the genetic variation in S. cerevisiae, where a population of 1011 yeast strains isolated from different ecological niches has been sequenced [59]. In the “1011 population”, a total of 26 clades were described, expanding the number of phylogenetic clusters initially observed in the species of them, 362 isolates were grouped into the WE cluster [59]. Additionally, the sequencing of this huge population confirmed that isolates from Asia have the greatest genetic diversity within the species [59, 60]. Nowadays, the repertory of yeast strains with sequenced genomes includes wild isolates from environments such as tree bark and flowers, and domesticated isolates from clinical, dairy, cheese, brewery and vineyard environments (among others) [49, 51, 54, 59,60,61,62] with the “1011 yeasts population” including most the genetic variation existing in S. cerevisiae and becoming a powerful resource for genotype–phenotype correlations [59].

Phenotype–genotype correlation by QTL mapping

The extensive knowledge and information generated by the sequencing projects in S. cerevisiae has been accompanied by massive phenotyping efforts under different culture conditions, showing that phenotypic variation is wider than genotypic diversity in the species [63, 64]. This observation suggests that yeast has a broad phenotypic plasticity and, more importantly, that multiple genes contributes to most of the phenotypes studied, which are commonly refers as polygenic traits or complex traits [65].

QTL mapping has been the main experimental approximation to fill the gap between genotype and phenotype in yeast [66]. In this approach, a population of individuals derived from a cross is genotyped and phenotyped, allowing the statistical correlation between genotype and phenotype to map genes affecting the trait of interest [67, 68]. This approach has been extensively used in yeast for mapping causatives genes affecting phenotypes such as thermotolerance [69,70,71], chemical resistance [69, 72], translation termination [73] and dehydration stress tolerance [74], among many others, being particularly important in identifying quantitative trait nucleotides impacting technological performances of industrial yeast strains (see [75] for more details in the topic).

In this context, several QTLs have been mapped for phenotypes associated with the fermentation process, such as ethanol production, residual sugar and acidity [76,77,78,79,80], as well as QTLs involved in nitrogen-limited fermentations and in nitrogen consumption and utilization [41, 42, 78, 81,82,83,84,85] (Table 1). Overall, QTL mapping has proved to be an efficient tool for the detection of genes responsible of the phenotypic variation observed in populations generated by crosses, particularly for fermentative phenotypes.

Yeast natural diversity related to low nitrogen adaptation

Nitrogen consumption

Several genes have been linked with yeast strains differences in nitrogen consumption, under laboratory and/or fermentative conditions, not only by QTL mapping but also using other experimental strategies (Table 1). For example, transcriptomic studies have given insights into groups of genes related to nitrogen uptake [86], nitrogen requirements [39] and response to nitrogen availability [87, 88], all of them using wine strains. In other approach, a massive hemizygote analysis showed that the inability of a commercial wine strain to utilize methionine is a consequence of mutations in ADE5,7, ARO8 e VBA3 genes [40]. In a similar way, the use of a wine yeast deletion collection (WYDC) showed that deletion of MFA2 resulted in a decrease in fermentation duration in nitrogen-limited conditions [89].

In a different genetic strategy, allele specific expression (ASE), an approach that allows the study of eQTLs (expression QTLs) through the combination of recombinant populations (as in traditional QTL mapping) and sequencing-based methods (RNA-seq), has also been used in studies that showed that coding and non-coding mutations in ASN1 explains nitrogen consumption differences between different yeast strains [90] and that polymorphisms within the coding region of GDB1 underlie fermentation kinetics differences [91].

Anyway, QTL mapping has been a preferred method for detection of genes linked to industrial-importance phenotypes in general (reviewed in [75]) and nitrogen consumption in particular (Table 1). One strategy has been the use of recombinant populations derived from wine strains. For example, using a recombinant population derived from two wine strains and phenotyped for nitrogen requirements for efficient fermentation, ARG8, BIO3, GCN1 e MDS3 genes were linked to key roles in nitrogen metabolism and signalling [82]. Other study found, utilizing a recombinant population derived from a wine and a laboratory strain, that ABZ1 gene controls the fermentation rate through modulation of nitrogen utilization [76].

In contrast, another useful strategy is to use strains representative of the clean lineages abovementioned for S. cerevisiae [49] as the parental strains of the recombinant populations. Through this approach, several genes have been mapped and validated: AGP1, ASI1 e GLT1 for variation in nitrogen sources consumption underlying differences in the central nitrogen metabolism [41] DAL1, DAL4, RIM15 e PUT4 for nitrogen source use variations [48] and RIM15, this last gene having an antagonistic pleiotropy, with a wine strain allele conferring a greater nitrogen utilization efficiency and glycerol production but also fungicide sensitivity [42].

An alternative to the use of these bi-parental recombinant populations is the utilization of the SGRP-4X population, a multi-parental recombinant population derived from four representative strains from lineages NA, SA, WA and WE [92]. Using this population and a combined strategy of QTL mapping and BSR-seq (bulk segregant RNA-seq), allelic variants in a large set of genes (ARO1, ALP1, ASI2, CPS1, EAP1, GTR1, LYP1, NPR1, PDC1, RPI1, SAP185, SCH9, SIT4 e TOR2) were identified as responsible for nitrogen consumption differences during wine fermentation [81, 83, 85]. Interestingly, half of these genes (EAP1, GTR1, NPR1, SAP185, SCH9, SIT4 e TOR2) are directly linked to the TORC1 signalling pathway in yeast [85].

TORC1 pathway-associated genes

TORC1 signalling pathway is a pleiotropic signalling pathway, conserved through the eukaryotic domain from yeast to humans (where is known as “mTORC1”), that connects nutrient availability with growth, playing a central role in general metabolism regulation, specially linked to nitrogen metabolism [26]. In nitrogen starvation conditions, TORC1 activates autophagy, stress response genes, nitrogen catabolic genes and ammonium permeases on the contrary, it represses protein biosynthesis, amino acid biosynthesis, translation initiation and ribosome biogenesis [28].

One of the major actual challenges in the TORC1 field is to determine exactly how intracellular levels of nitrogen are sensed by the TORC1 complex and how this pathway differentiate between preferred and non-preferred nitrogen sources [29, 30, 93, 94]. In this sense, a recently developed method allows the indirect monitoring of TORC1 activation for hundreds of strains, enabling the study of this phenotype by approaches like QTL mapping [95]. Using these experimental capacities, KAE1 allelic variants were identified to affect both TORC1 activation by glutamine and fermentation kinetics under nitrogen-sufficient and nitrogen-limited wine conditions [84] (Fig. 1).

Central role of TORC1 signalling pathway and importance of wild alleles for yeast nitrogen consumption. The proteins encoded by nitrogen-associated genes identified in the studies summarized in this review are highlighted in colour (green or red). Among them, proteins encoded by genes for which wild alleles cause higher consumption levels for some nitrogen sources are highlighted in red, while the rest are in green

We can add to this last antecedent the fact that that allelic variants of EAP1, GTR1, NPR1, SAP185, SCH9, SIT4 e TOR2, all of them genes directly associated to the yeast TORC1 pathway, underlie differences in ammonium and amino acids consumption under wine fermentation conditions [85] (Fig. 1). Also, allelic variants of RIM15 are involved in nitrogen source use variations [47] and utilization efficiency [41], with Rim15 being downstream TORC1. Thus, the experimental evidence obtained to date reinforces the suggested idea of the importance of this pleiotropic pathway (i.e. a pathway that contribute to the regulation of multiple developmental outcomes) in yeast adaptation to low nitrogen environments in wine fermentation [26]. It this sense, it is well stablished that signalling mechanisms that control development in yeast are highly pleiotropic, implying that perturbations of signalling pathways like TORC1 can manifest in multiple and/or unexpected ways [96].

Wild yeast strains as reservoir of beneficial alleles

Surprisingly, for four of the aforementioned TORC1-related genes (NPR1, SAP185, SCH9 e TOR2), allelic variants from the wild NA strain (which correspond to an oak tree isolate [49]) presented higher consumption levels for certain amino acids (aspartic acid, histidine, glutamine and threonine) [85] (Fig. 1). Conversely, several studies have shown that alleles coming from the domesticated WE strain (which was isolated from a winemaking environment [49]) presented lower consumption levels for particular amino acids in comparison to other strains (NA, SA and WA) [41, 81, 83, 85].

These facts are quite interestingly, because one might thought that the WE strain would be better adapted to wine fermentation conditions that, for example, the NA strain, which is a wild isolate not adapted to this environment [49]. While this is true for ammonium consumption (a nitrogen source regularly in high proportion in grape must [36]), with alleles coming from WE strain causing higher rates of it [85], it is not for the consumption of certain amino acids (as abovementioned). It is still unclear if these amino acids are present in some natural environments (like oak bark) but absent in wine environments and if this is related to the specific demand for each amino acid, information that could help to better understand the differential nitrogen consumption between wine and wild yeast strains.

A possible explanation to this phenomenon is that, while wine yeast strains have been selected by humans for phenotypes directly linked to wine final characteristics (e.g. ethanol production and fermentation kinetics properties), wild yeast strains face environments with nitrogen limitations [47], being able to growth in a wider range of nitrogen sources than wine strains [48]. Therefore, these different evolutionary trajectories between wild and wine yeasts could have led to the existence of different genetic adaptations to nitrogen-limited environments, with wild strains better adapted to this condition, thus being a reservoir of beneficial alleles from an industrial point of view.

However, an alternative explanation is that wine yeasts have high nitrogen requirements because of the production of high concentrations of ethanol, while wild yeast only need the (low) nitrogen enough to allow growth and survival. Therefore, these differences could be a consequence of their metabolism related to the substrate where they develop rather than an environmental adaptation. New evidences towards one or another explanation are needed to gain a better understanding on this topic, like genomic and/or transcriptomic studies in nitrogen-limited fermentations comparing wine and wild yeast strains.

Even so, the hypothesis that wild yeast strains are better adapted to nitrogen-limited conditions is reinforced by the fact that alleles coming from WE strain tend to cause higher rates of ammonium consumption [85], which may be caused by the regular high proportion of this nitrogen source in the grape must [36] and the oenological practice of ammonium must supplementation [25]. All these antecedents are suggesting that wine yeasts are not well adapted to low nitrogen environments, requiring high levels of nitrogen to complete the fermentation process [26]. Therefore, wild allelic variants augmenting amino acid consumption could be of industrial potential, e.g. for the improvement of industrial wine strains, maybe favouring amino acids consumption over ammonium, by genetic improvement programs.

Direções futuras

Although QTL mapping and “omics”-linked approaches have been the preferred tools for the identification of genes associated with yeast adaptation to low nitrogen fermentative conditions, another experimental strategy that can also be applied for phenotype–genotype correlations is Genome-wide association study (GWAS) [66]. This approach is based on a population of individuals without direct genetic relationship, which has been genotyped (generally by chips or sequencing) and phenotyped (for a specific trait), also allowing a direct correlation between genotype and phenotype [65]. While GWAS has been successfully applied in human populations for detection of risk genetic variants associated with diseases, when is applied to microorganism populations several confounding factors must be undertaken, such as selective sweeps, recombination frequency, horizontal gene transfer and clonal expansion [97].

In yeast, GWAS has been seldom utilized due to the necessity to genotype a large number of strains from diverse ecological niches, making the QTL mapping the preferred tool for the analysis of complex traits [65]. As far as we know, there is no study focused on nitrogen-related genes using GWAS. However, the recently sequenced “1011 yeasts population” overcome this problem, allowing to apply GWAS on this yeast population and becoming in a powerful resource for a direct association between genotype and phenotype [59]. Thus, we have now the chance to use GWAS as a tool for the identification of genes affecting phenotypes related to wine fermentation, particularly nitrogen utilization, as well as to TORC1 activation.

The GWAS experimental approach has also the advantage to allow the direct phenotypic and genotypic comparison between wild and domesticated yeast strains. S. cerevisiae is one of the most important domesticated species, due to its use for food (e.g. bread) and beverage (e.g. beer and wine) fermentations for thousands of years [98], but wild yeast strains also exist in non-human environments, such as tree barks and flowers [49]. However, little is known about the phenotypic effects linked to domestication in yeast, for example, over low nitrogen adaptation.

In this context, it will be of great importance for the yeast researcher community to study the effect that domestication process has had over these and other traits. Given the actual evidence pointing towards the different evolutionary trajectories of wild and domesticated yeast strains [47, 48, 59, 64], we can hypothesize that wild strains of S. cerevisiae are better adapted to low nitrogen conditions, being a reservoir of useful alleles to improve industrial yeasts for wine production. Moreover, this domestication process may have caused differences in TORC1 activation between wild and domesticated strains, with some works suggesting the existence of lineage-specific functional divergence for TORC1-associated phenotypes [64, 84, 99, 100], which in turn may have impacted on their fermentative capacities. The disentangling of the genetic bases of yeast adaptation to low nitrogen environments in wine fermentation will help to answer this and other questions, and to take the accumulated knowledge for industrial application in wine industry.


Assista o vídeo: Experimento com Fungos - Alunos do CETI Sérgio Pessoa (Fevereiro 2023).